CN101589144A - 线虫诱导型启动子及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了根特异和/或由寄生线虫诱导的启动子多核苷酸。本发明的启动子可用于控制植物根中目的核酸的表达。

Description

线虫诱导型启动子及其使用方法

与相关申请的交叉引用

本申请要求2007年2月6日提交的美国临时专利申请系列号60/899,693的优先权。

发明领域

本发明涉及调节拟南芥(Arabidopsis thaliana)标志At5g12170转录的启动子及其片段。本发明的启动子可用于控制任一目的核酸在植物根中的转录。尤其，本发明的启动子可以用来控制编码物质的核酸转录，其中所述的物质破坏采食部位的形成或维持、破坏植物寄生线虫的生长和/或繁殖，赋予或改善植物对植物寄生线虫的抗性或毒害植物寄生线虫以减少作物破坏。

发明背景

线虫是以超过2,000种行栽作物、蔬菜、水果和观赏植物的根、叶及茎为食，造成世界范围估计一千亿美元作物损失的微小线虫。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根癌线虫(RKN)、形成胞囊及形成损伤的线虫。以造成采食部位处根瘿形成为特征的根癌线虫具有相对广泛的宿主范围并且因此对种类繁多的作物物种致病。形成胞囊和形成损伤的线虫物种具有更有限的宿主范围，不过依旧在易感作物中造成巨大损失。

致病性线虫存在于美国各地，在南部和西部的温暖湿润地区及在沙壤土中密度最大。大豆植物的最严重病虫-大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)在1954年首次于美国的北卡莱罗纳州发现。某些地区严重遭受大豆胞囊线虫(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，则大豆生产不再可能是经济的。尽管大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，然而SCN寄生总计约50种宿主，包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草。

线虫损伤的迹象包括在炎热时期矮化与叶子发黄及植物萎蔫。然而，线虫侵染可以引起严重产量损失，而无任何明显的地上部分发病症状。产量减少的主要原因归咎于地下的根损伤。受SCN感染的根矮缩或矮化。线虫侵染也可以减少根上固氮结节的数目，并且可以使根更易受其他土源性植物病原体侵袭。

线虫的生命周期具有三个主要阶段：卵、幼体和成体。该生命周期在线虫物种之间不同。例如，SCN的生命周期在最适条件下通常可以于24-30日内完成，而其他物种可能经过长达一年或更长时间以完成生命周期。当温度和湿度水平在春季变得适宜时，蠕虫形状的幼体在土壤中从卵孵化出来。仅幼体发育阶段的线虫能够感染大豆根。

SCN的生命周期已经成为众多研究的主题，并且因此是理解线虫生命周期的有用实例。在穿透大豆根后，SCN幼体通过根移动直至它们接触维管组织，此时SCN幼体停止迁移并开始采食。借助口针，线虫注射了调节某些根细胞并将它们转化成特化采食部位的分泌物。这些根细胞在形态学上转化成巨大的多核合胞体(或在RKN情况中为巨大细胞)，这种合胞体被用作线虫的营养物来源。主动采食的线虫因此从植物窃取重要的营养物，导致产量损失。当雌性线虫采食时，它们膨胀并逐渐变得如此巨大，以至于它们的身体突破根组织并暴露在根的表面。

在采食一段时间后，作为成体不膨胀的雄性SCN线虫从根迁移至土壤内并使膨大的雌性成体受精。雄性线虫随后死亡，而雌性线虫仍与根系统附着并继续采食。膨大雌性线虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块或卵囊(a mass or egg sac)中并随后在线虫体腔内发育。雌性成体的整个体腔最终充满卵，并且雌线虫死亡。正是充满卵的死亡雌线虫身体才称作胞囊。胞囊逐渐释放并游离存在于土壤中。胞囊的璧变得极坚韧，从而为胞囊内所含大约200-400粒卵提供良好的保护作用。SCN卵在胞囊内存活直至适宜的孵化条件出现。尽管众多的卵可以在头一年中孵化，然而很多卵也会在保护性胞囊内存活几年。

线虫可以依赖其自身力量在土壤中每年穿行仅几英寸。然而，线虫侵染可以在多种方式下传播相当远的距离。可以移动受侵染土壤的任何事物，包括农场机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人，能够传播这种侵染。种子大小的土壤颗粒往往污染收获的种子。因此，当来自受侵染田地的污染种子在非侵染田地中播种时，可以传播线虫侵染。存在某些线虫可以通过鸟类传播的证据。仅可以预防这些病因中的某些病因。

防治线虫侵染的常规方法包括：在线虫侵染的土地中保持合理的土壤养分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用消毒措施，如仅在处理线虫非侵染田地后才翻耕、播种和中耕线虫侵染的田地；在侵染的田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在侵染田地中生长的种子播种非侵染田地，除非这种种子已经得到正确地清洁；轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播种抗性植物品种。

已经提出方法用于遗传转化植物以便赋予增加的植物寄生线虫抗性。美国专利号5,589,622和5,824,876涉及线虫附着后在植物采食部位内或其附近特异性表达的植物基因的鉴定。美国专利号5,589,622和5,824,876公开了从马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)感染的马铃薯根分离的8种启动子；没有公开来自其他植物物种的线虫诱导型启动子。据称这些启动子可用于指导有毒蛋白或酶特异性表达或指导针对靶基因或针对一般细胞基因的反义RNA的表达。

美国专利号5,023,179公开命名为ASF-1的分离自CaMV启动子的启动子增强元件，据称其增强植物基因在根中的表达。

美国专利号5,750,386公开烟草(Nicotiana tabacum)RB7根特异性启动子的缺失片段，据称其具有线虫应答性。

美国专利号5,837,876公开从烟草分离并命名为TobRD2的根皮层特异性基因启动子。

美国专利号5,866,777公开了推迟线虫采食结构形成的双基因方法。第一个基因-芽孢杆菌RNA酶基因处于驱动至少在采食结构中表达的启动子控制下。第二个基因-芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因处于驱动在除所述采食结构之外的全部植物细胞中表达的启动子控制下。美国专利号5,866,777中公开的采食部位特异性启动子包括截短形式的Δ0.3TobRB7和rolC启动子。

美国专利号5,955,646公开了基于源自根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)甘露氨酸合酶基因和章鱼碱合酶基因的启动子的嵌合调节区，据称其具有线虫诱导性。

美国专利号6,005,092公开了烟草内切-1，4-β-葡聚糖酶(Ntce17)启动子。

美国专利号6,262,344和6,395,963公开了从拟南芥分离的启动子，据称其具有线虫诱导性。

美国专利号6,448,471公开了来自拟南芥的启动子，其对线虫采食部位是特异性的。

美国专利号6,593,513公开了用拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶基因(cel1)启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶转化植物以产生能够破坏线虫侵袭的植物。

美国专利号6,703,541公开了玉米过氧化物酶P7X基因及其启动子的克隆和分离。玉米过氧化物酶P7X启动子被报道为线虫诱导型的。

美国专利号6,906,241公开了与编码杀线虫或杀昆虫蛋白质的异源核酸组合的Ntce17启动子。

美国专利号7,078,589公开大豆Pyk20基因和启动子的克隆与分离，所述启动子据称将受SCN感染诱导并在维管组织中显示强烈活性。

美国专利号7,196,247公开了大豆异黄酮合酶I的启动子，所述启动子被报道为根特异的，并且在营养组织中是寄生虫袭击诱导型的。

美国专利号7,223,901公开了来自磷酸核糖甲酰甘氨脒核糖核苷酸合酶(phosphoribosylformylglycinamidine ribonucleotide synthase)的启动子及其缺失片段，所述启动子被报道为对线虫感染应答。

美国专利申请公开号2004/0078841公开拟南芥TUB-1、RPL16A及ARSK1启动子和来自豌豆(Pisum sativum)的PSMT_A启动子的启动子区，所述全部启动子区据称是根特异性的。

美国专利申请公开号2004/0029167公开了来自烟草的II类咖啡酸O-甲基转移酶基因的启动子序列，据称所述启动子序列可应答于机械性或化学性损伤或应答于致病体入侵而诱导。

WO 94/10320公开了来自烟草的Δ0.3TobRB7启动子片段及其与多种基因一起用于线虫采食细胞特异性表达。

WO 03/033651公开了命名为SCP1、UCP3和SUP的合成的线虫调节型启动子序列。

WO 2004/029222及其美国同族专利-美国专利申请公开号2005/0070697公开了来自大豆腺苷-5′-磷酸脱氨酶和肌醇-5-磷酸酶基因的调节区，用于提高植物中的线虫抗性。

上文提及的根特异性或采食部位特异性启动子目前均未用在含有抗线虫转基因的商品种子中。虽然对这类产品的需求久已承认，然而迄今无人成功通过重组DNA技术开发抗线虫植物。持续需求根特异性和/或线虫采食部位特异性启动子以与编码毒害植物寄生线虫物质的转基因组合。

发明概述

本发明提供适用于驱动第二多核苷酸在易感于线虫侵袭的植物根中表达的启动子多核苷酸。本发明的启动子多核苷酸特别用于产生抵抗线虫侵染的农业作物植物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含分离的启动子多核苷酸的启动子，所述启动子能够介导根优选的和/或线虫诱导的表达，其中所述启动子多核苷酸选自：a)具有SEQ ID NO：1中公开的序列的多核苷酸；b)包含下述多核苷酸的核苷酸476到1476的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ IDNO：1中公开的序列；c)与a)或b)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；d)在严格条件下与a)或b)的多核苷酸杂交的多核苷酸；和e)包含下述多核苷酸的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1中公开的序列。

本发明还涉及包含本发明的分离的启动子多核苷酸的表达盒和转基因植物，还涉及在作物中控制寄生线虫侵袭的方法，其中所述方法使用重组核酸构建体减少作物破坏，所述重组核酸构建体包含与下述核酸有效结合的本发明的分离的启动子多核苷酸，所述核酸编码破坏植物寄生线虫代谢、生长和/或生殖的物质，赋予或改善植物对植物寄生线虫抗性的物质，或对植物寄生线虫有毒的物质。

附图概述

图1：拟南芥基因座At5g12170的启动子多核苷酸的核酸序列(SEQ IDNO：1)。

图2：大豆cDNA克隆50657480的核酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3：由大豆cDNA克隆50657480编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，其中“＊”表示终止密码子。

图4：cDNA克隆50657480的微阵列数据。(N)中的N表示cDNA微阵列测量的数量，ND表示在该研究中所述的实验条件下不可检出。名称“未处理的根”表示下述全根组织aRNA(扩增的RNA)，其来自与经SCN接种的区段同龄的未感染的根区段。名称“非合胞体”表示全根组织aRNA，其来自与不含有SCN或进食位点的感染区相邻的被SCN感染的根。名称“合胞体”表示使用激光捕获显微解剖(LCM)获得的aRNA SCN合胞体样品。

图5：由拟南芥At5g12170基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，其中“＊”表示终止密码子。

图6：大豆cDNA克隆50657480编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与拟南芥At5g12170基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的比对。

图7：在实施例4中公开的大豆发根测定中，双元载体pAW280的β-葡糖醛酸糖苷酶表达模式。SCN接种后12天，对大豆胞囊线虫感染的发根和对照未感染的发根染色。使用以下的评分指标：“-”表示无GUS染色，“+”表示弱GUS染色，“++”表示强GUS染色，“-/+”表示存在约25％的测试株系在＜25％被观察的根组织中具有一定的维管GUS染色。

图8：在实施例7中公开的大豆发根测定中，双元载体pAW280、RTJ119和RTJ120的β-葡糖醛酸糖苷酶表达模式。SCN接种后12天，对大豆胞囊线虫感染的发根和对照未感染的发根染色。使用以下的评分指标：“-”表示无GUS染色，“+”表示弱GUS染色，“++”表示强GUS染色，“-/+”表示存在约25％的测试株系在＜25％被观察的根组织中具有一定的维管GUS染色。

图9：用于克隆启动子多核苷酸的引物。

优选实施方案的详述

本发明可以通过参考以下详细描述的本发明优选实施方案及其中所包含实施例而更容易地理解。除非另外说明，本文中所用术语将根据相关领域技术人员的习惯用法加以理解。除了下文提供的术语定义外，分子生物学中常用术语的定义也可以在Rieger等，1991 Glossary of genetics：classical and molecular，第五版，Berlin：Springer-Verlag；和在Currentprotocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编者，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley & Sons，Inc.(1998附录)中找到。

应当理解如本说明书及在权利要求书中所用，“一种(a)”或“一个(an)”可以意指一个或多个，这取决于该冠词所用的上下文。因此，对“一种细胞”的称谓可以可以意指可以使用至少一种细胞。应当理解本发明不限于具体核酸、具体细胞类型、具体宿主细胞、具体条件或具体方法等，因为这些当然可以变化，并且其中的众多修改与变化对于本领域技术人员是显而易见的。还应当理解本文中使用的术语仅仅旨在描述具体实施方案并且不意图是限制性的。

在本申请通篇范围内，参考了多种出版物。全部这些出版物及这些出版物中引用的那些参考文献的公开内容通过引用方式完整地并入本申请，旨在更充分地描述本发明涉及的本领域状态。用于克隆、DNA分离、扩增及纯化，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等酶反应的标准技术以及多种分离技术是本领域技术人员已知并且通常使用的那些技术。众多标准技术在Sambrook和Russell，2001 Molecular Cloning，第三版，Cold Spring Harbor，Plain view，New York；Sambrook等，1989Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Maniatis等，1982 Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory，Plainview，New York；Wu(编辑)1993 Meth.Enzymol.218，第I部分；Wu(编辑)1979 Meth Enzymol.68；Wu等，(编辑)1983 Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编辑)1980 Meth.Enzymol.65；Miller(编辑)1972 Experiments in MolecuIar Genetics，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Old和Primrose，1981 Principles of Gene Manipulation，University of California Press，Berkeley；Schleif和Wensink，1982 Practical Methods in MolecularBiology；Glover(编辑)1985 DNA Cloning第I和II卷，IRL Press，Oxford，UK；Hames和Higgins(编辑)1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，UK以及Setlow和Hollaender 1979 Genetic Engineering：Principles and Methods，第1-4卷，Plenum Press，New York中描述。

提供从其天然环境分离和/或纯化的本发明启动子多核苷酸，它们处于基本上纯的或均匀的形式，或者不含或基本上不含所述物种来源的其他核酸。如本文中所用的“分离”核酸在通过重组技术产生时也基本上(在分离时)不含其他细胞材料或培养基，或在化学地合成时基本上不含化学前体。本发明的启动子多核苷酸是分离的核酸。当在本文中使用时，术语“分离的”包括全部这些可能。

术语“约”在本文中用来意指大约、大致、左右或处于......范围。术语“约”与数字范围一起使用时，它通过扩张边界高于和低于所述数值而修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用来修饰某数值高于和低于所述值，即在该数值之上或之下(较高或较低)达10％的偏差。

如本文中所用的术语“启动子”或启动子多核苷酸指与目的核苷酸序列连接时能够控制该目的核苷酸序列转录成mRNA的DNA序列。启动子一般(尽管不必要)位于目的核苷酸的5′(例如上游)(例如接近结构基因的转录起始位点)，所述目的核苷酸向mRNA转录的受所述启动子的控制，并为用于启动转录的RNA聚合酶和其他转录因子提供特异性结合位点。“组成型启动子”指这样的启动子，它能够在植物整个或几乎整个发育期期间于全部或几乎全部植物组织中表达该启动子控制的可读框或调节元件。“调节型启动子”指不以组成型方式而以时间和/或空间方式指导基因表达的启动子，并且包括组织特异性启动子和诱导型启动子。不同启动子可以指导基因或调节元件在不同组织或细胞类型中或在不同发育期或在应答于不同环境条件下表达。“组织特异性启动子”指不在全部植物细胞中表达而仅在特定器官(如根或种子)、特定组织(如胚或子叶)内的一个或多个细胞类型或特定细胞类型(如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)中表达的调节型启动子。“诱导型启动子”指可以在一个或多个细胞类型中通过外部刺激如化学、光、激素、胁迫或病原体开启的那些调节型启动子。

本文中使用的术语“线虫抗性”表示植物避免被线虫感染、杀死线虫或阻碍、减少或终止线虫发育、生长或繁殖的能力。这可通过主动过程(例如通过产生对线虫有害的物质)或被动过程(例如通过减少给线虫的养分或抑制由线虫诱导的结构如合胞体或巨细胞的发育)实现。植物的线虫抗性水平可以以多种方式测定，例如通过计数在感染后能够在植物上建立寄生的线虫，或通过测量感染后多个时间存在的线虫发育阶段，或通过测量雄性和雌性线虫的比例或产生的线虫卵或胞囊的数量。

术语“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸序列或多肽序列环境下指这两个序列中的这些位置，其中当所述序列在指定比较窗口范围(例如全局比对中的整个序列或在局部比对中的相似性区域)内为最大对应进行比对时，相同的符号对归集在一起。当序列同一性百分数用来指多肽时，可认识到的是不同一的残基位置经常因保守性氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基被替换为具有相似化学属性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并且因此没有改变分子的功能属性。当序列因保守性置换而不同时，序列同一性百分数可以向上调整以针对所述置换的保守性本质进行修正。将因此类保守性置换而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。一般，这种方法包括将保守性置换判定为部分匹配而非错配，因而增加序列相似性的百分数。

如本文中所用，“序列同一性的百分数”或“序列同一性百分数”指通过如此方式确定的值，即首先在全局或局部比较窗口中的两个最佳比对序列中在每个组成位置处注明相同的核酸碱基或氨基酸残基是否在这两个序列中出现，若出现，指定为匹配，或若不出现，则指定为不匹配。由于所述比对通过优化匹配碱基数目而建立，与此同时允许在任一位置处的错配以及允许引入任一大小的空位或空白区域，如此提高所述比对的显著性及质量，因而这种计算确定了匹配条件存在的位置总数，并且随后将这个数字除以比较窗口内的位置总数，并且最后将结果乘以100以产生序列同一性百分数。可以使用相同原理对蛋白质序列计算“序列相似性百分数”，其中将保守性置换计算为部分不匹配而非完全不匹配。因此，例如，在给予相同氨基酸评分1并且给予非保守性置换评分0的情况下，给予保守性置换0-1之间的评分。对保守性置换的评分可以从本领域已知的氨基酸矩阵例如Blosum或PAM矩阵中获得。

用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以使用数学算法实现两个序列之间同一性百分数或相似性百分数(对于蛋白质)的确定。此类数学算法的优选、非限制性实例是Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。可以使用这些数学算法的计算机实现以比较序列来确定序列同一性或鉴定同源物。

与美国专利申请系列号60/899,739同时提交的共同转让的美国专利申请系列号60/899,739公开并要求保护称作GM50657480的大豆cDNA，其在本文中由SEQ ID NOs：2和3表示。如实施例2中所示，在SCN诱导的合胞体中，GM50657480的表达被上调。如图6中所示，GM50657480的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)显示与At5g12170的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的显著比对，指出两种蛋白质是直向同源物。如实施例4中所证明的，当与GUS报告基因处于有效连接中时，本发明的拟南芥启动子多核苷酸(SEQ ID NO：1)在被线虫感染的大豆发根中上调。

因此，本发明涉及具有SEQ ID NO：1中公开序列的分离的启动子多核苷酸，或从具有SEQ ID NO：1中公开序列的分离的启动子多核苷酸得到的最小启动子多核苷酸片段，所述片段能够驱动第二多核苷酸的根特异和/或线虫诱导的表达。本文中使用术语“等同片段”或“最小启动子多核苷酸片段”是指能够介导第二多核苷酸的根特异和/或线虫诱导表达的启动子多核苷酸片段。可通过去除非必需功能元件而不缺失关键的功能元件例如关键的转录因子结合位点，获得本发明的启动子多核苷酸的等同片段。所述启动子多核苷酸序列缩小至必需的功能元件可以在体外通过试错缺失突变或在计算机上利用启动子元件搜索途径实现。对启动子活性必需的区域常常显示为成簇的某些已知启动子元件。此类分析可以使用可获得的计算机算法如PLACE(″植物顺式作用调节性DNA元件″；Higo 1999)、BIOBASE数据库″Transfac″(Biologische Datenbanken GmbH，Braunschweig；Wingender 2001)或数据库PIantCARE(Lescot 2002)进行。特别优选的是通过缺失编码mRNA 5’-非翻译区从而仅提供(未转录的)启动子多核苷酸区域而获得的启动子多核苷酸的等同片段。可容易地通过本领域已知的方法(例如5’-RACE分析)确定5’-非翻译区。因此，本发明的一些启动子多核苷酸是其他启动子多核苷酸的等同片段。本发明特异的最小启动子多核苷酸片段包括但不仅限于，包含SEQ ID NO：1中公开序列的核苷酸476到1476的多核苷酸，下述多核苷酸，其包含具有SEQ IDNO：1中公开序列的启动子多核苷酸的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸、或至少300个连续核苷酸、或至少400个连续核苷酸、或至少500个连续核苷酸的片段。

或者，本发明的启动子多核苷酸包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在严格条件下与具有SEQ ID NO：1中公开序列的启动子多核苷酸杂交，或与从具有SEQ ID NO：1中公开序列的启动子多核苷酸获得的最小启动子多核苷酸片段杂交。本文使用的严格杂交条件是公知的，包括例如400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、60℃杂交12-16小时；然后在约65℃下在0.1％SDS、0.1％SSC中洗涤约15-60分钟。

本发明还涉及下述分离的多核苷酸，其在严格条件下与包含SEQ IDNO：1公开序列的核苷酸476到1476的多核苷酸杂交，其中启动子多核苷酸能够驱动第二多核苷酸的根特异和/或线虫诱导的表达，并且在植物根中由植物寄生线虫感染诱导。本发明的启动子多核苷酸还包含分离的启动子多核苷酸，所述启动子多核苷酸与具有SEQ ID NO；1中公开序列的多核苷酸或从SEQ ID NO；1中公开序列获得的最小启动子多核苷酸片段至少50-60％、或至少60-70％、或至少70-80％、80-85％、85％、68％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或至少95％、96％、97％、98％、99％同一，所述启动子多核苷酸能够驱动第二多核苷酸的根特异和/或线虫诱导的表达。多核苷酸序列比较的长度为至少50个连续的核苷酸，或至少100个连续的核苷酸，或至少200个连续的核苷酸，或至少500个连续的核苷酸，长达序列的全长。在待比较的两条序列不具有相同长度的情况下，术语“序列的全长”是指较短序列的全长。

本文公开的方法可用于分离SEQ ID NO：1的另外的最小启动子多核苷酸片段，所述片段能够介导第二多核苷酸的根特异和/或线虫诱导的表达。本发明还涉及本发明启动子多核苷酸的“变体”或“衍生物”。特异启动子多核苷酸序列及其特异元件的衍生物可包括但不仅限于，序列的缺失、单点或多点突变、具体限制性酶切位点的改变、功能元件的添加，或分子修饰的其他手段。该修饰可以增强或不增强，或者可以改变或不改变所述启动子多核苷酸的转录调节活性。例如，本领域技术人员可限定启动子多核苷酸内的功能元件例如启动子元件(例如但不仅限于转录因子结合位点)，并缺失任何非必需的功能元件。可修饰或组合功能元件，以针对任何具体的应用提高本发明启动子多核苷酸的利用或表达水平。

如上所述，也可以随机制备然后测定本发明启动子多核苷酸的缺失突变体。根据该策略制备了一系列构建体，每个构建体含有启动子多核苷酸的不同部分(亚克隆)，然后筛选这些构建体的活性。筛选活性的一种合适手段是将含有启动子多核苷酸片段的启动子多核苷酸构建体与可选择或可筛选标记物连接，并仅分离表达标记物基因的细胞。藉此鉴定了大量不同的、经缺失的下述启动子多核苷酸构建体，其仍然保留期望的活性或甚至具有增强的活性。因此通过比较选择的构建体鉴定了活性必需的最小启动子多核苷酸片段。该启动子多核苷酸片段随后可用于构建表达第二多核苷酸的载体，所述第二多核苷酸例如编码外源基因。

在多核苷酸(例如启动子多核苷酸)中诱变或产生缺失的方法是本领域技术人员熟知的并且在例如通过引用方式完整并入本文的US 6,583,338中披露。调节性序列变体的一个实例是通过从较大启动子多核苷酸中的一个缺失或多个缺失所形成的启动子多核苷酸。有时候可以缺失启动子多核苷酸的5′部分直至接近转录起始位点附近的TATA盒而不消除启动子活性，如Zhu等(1995)The Plant Cell 7：1681-1689描述。除去部分多核苷酸的例行方法是使用核酸外切酶与DNA扩增的组合以产生双链DNA克隆的单向嵌套缺失。用于此目的的商业试剂盒以商标名Exo-Size.TM.(NewEngland Biolabs，Beverly，Mass.)出售。生物活性变体也包括例如具有一个或多个核苷酸置换、缺失或插入的本发明天然启动子多核苷酸。

衍生物和变体也包括来自其他物种(如但不限于细菌、真菌和植物)的同源物、旁系同源物和直向同源物。“同源物”是本领域中用来表示与参考序列具有高度序列相关性的多核苷酸或多肽序列的遗传学术语。这种相关性可以如前所述通过确定两个序列之间同一性和/或相似性的程度进行量化。属于这个遗传学术语的是术语“直向同源物”和“旁系同源物”。“旁系同源物”指在相同物种内功能上相似的多核苷酸或多肽。“直向同源物”指作为另一个物种中与所述多核苷酸或多肽功能等同的多核苷酸或多肽。直向同源基因优选地意指编码直向同源蛋白质的基因。更具体地，术语“直向同源物”指从一个物种中获得的多肽或蛋白质，其是来自不同物种的多肽或蛋白质的功能性对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。

本文使用的术语“等位基因变体”是指含有多态性的多核苷酸，所述多态性导致多核苷酸的核苷酸中的改变并存在于自然种群(例如植物物种或变种)中。术语“等位基因变体”还表示含有多态性的启动子多核苷酸，所述多态性导致启动子多核苷酸的多核苷酸序列中的改变并存在于自然种群中。这类天然等位基因变体通常可导致多核苷酸中1-5％的差异，或编码的蛋白质中1-5％的差异。可通过对大量不同植物中的目的多核苷酸进行测序来鉴定等位基因变体，可通过使用例如杂交探针鉴定这些植物中相同的启动子多核苷酸、基因或遗传基因座完成所述测序。启动子多核苷酸中任何和所有下述这类核酸变异旨在属于本发明的范围，所述核酸变异由天然等位基因变异引起并且不改变启动子多核苷酸的功能活性。基因的等位基因变体可被用于克隆本发明启动子多核苷酸的变体。藉此获得的本发明启动子多核苷酸的变体可与SEQ ID NO：1的序列或与SEQ ID NO：1的核苷酸476到1476的序列至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一，并与编码下述多肽的基因天然相连，所述多肽与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4所述序列至少95％、96％、97％、98％、99％同一。天然相连表示两条多核苷酸是(例如植物基因组中)自然存在的连续多核苷酸的部分，其中连接两条序列的多核苷酸片段不长于3000bp、2000bp、1000bp、500bp、200bp、100bp或50bp。优选地，本发明的启动子多核苷酸的变体在编码下述多肽的直向同源基因上游区域中，所述多肽与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所述序列有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性。

根据本发明，本发明的分离的启动子多核苷酸可处于与第二多核苷酸的有效连接中，用于植物中第二多核苷酸的根特异和/或线虫诱导的表达，从而改变该植物的表型。本文使用的术语“有效连接”、“有效地连接”和“连接”是可以互换的，并且表示单个多核苷酸片段上启动子和第二多核苷酸的下述方式的功能连接，所述方式使得第二多核苷酸的转录由该启动子起始和介导。通常，有效连接的核酸是连续的。

任何第二多核苷酸可处于与本发明启动子多核苷酸的有效连接中，以达成第二多核苷酸的根特异或病原体诱导的表达。第二多核苷酸包括例如可读框、可读框的部分、编码融合蛋白的多核苷酸、反义序列、编码双链RNA序列的序列、转基因等等。第二多核苷酸可编码昆虫抗性基因，细菌疾病抗性基因，真菌疾病抗性基因，病毒疾病抗性基因，线虫疾病抗性基因，除草剂抗性基因，影响谷粒组成或品质的基因，养分利用基因，真菌毒素减少基因，雄性不育基因，可选择标记物基因，可筛选标记物基因，阴性可选择标记物基因，阳性可选择标记物基因，影响植物农学特征(如产率)的基因，环境胁迫抗性基因(例如赋予对干旱、热、寒冷、冷冻、过湿、盐胁迫或氧化胁迫的抗性或耐性的基因)，改善淀粉特性或数量、油数量和品质、氨基酸或蛋白质组成的基因等等。

优选地，第二多核苷酸编码RNA，优选地编码双链RNA(dsRNA)或反义RNA、siRNA、miRNA或其前体等等。

优选地，第二多核苷酸编码RNA，优选地编码双链RNA(dsRNA)，其总体或部分与下述植物基因或植物启动子基本同一或同源，所述植物基因或植物启动子是线虫进食位点的形成和维持所必需的，例如通过破坏或妨碍合胞体或巨细胞的发育或完整性。在一个实施方案中，第二多核苷酸编码dsRNA、反义RNA、siRNA、miRNA，其与植物启动子互补并导致植物启动子的下调。或者第二多核苷酸可编码破坏或妨碍植物寄生线虫生长和/或生殖的物质、赋予或改善对植物寄生线虫的植物抗性的物质，或对植物寄生线虫有毒性的物质，例如蛋白质、dsRNA、反义RNA、siRNA、miRNA或其前体，从而减少作物破坏。根据本发明可使用编码下述物质的任何多核苷酸：破坏植物寄生线虫生长和/或生殖的物质、赋予或改善对植物寄生线虫的植物抗性的物质，或对植物寄生线虫有毒性的物质。例如，第二多核苷酸可编码下述双链RNA，其与线虫代谢、存活、变态或生殖必需的寄生植物线虫靶基因基本同一。或者，第二多核苷酸可编码下述双链RNA，其与植物根的进食位点中线虫存活、生长或生育力必需的植物基因基本同一。

在本文中使用时，考虑比较RNA和DNA序列时尿嘧啶代替胸腺嘧啶，术语“基本同一”和“对应于”表示dsRNA一条链的核苷酸序列与靶基因的20或更多个连续核苷酸至少约80％-90％同一，更优选地，与靶基因的20或更多个连续核苷酸至少约90-95％同一，最优选地，与靶基因的20或更多个连续核苷酸至少约95-99％同一或完全同一。示范性的植物寄生线虫靶基因公开于例如共同转让的共同未决的美国专利申请公开号No.2005/188438中，其并入本文作为参考。

或者，为了进行线虫控制，与本发明的启动子多核苷酸处于有效连接中的第二多核苷酸可编码可读框，优选地编码蛋白质编码基因。例如，第二多核苷酸可编码来自任何物种的任何可读框。非限制性的例子是来自大豆属、拟南芥属、苜蓿属(Medicago)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Baccillus)、根瘤菌属(Rhizobium)或酵母属(Saccharomyces)物种。例如，第二核酸可编码昆虫抗性基因，细菌疾病抗性基因，真菌疾病抗性基因，病毒疾病抗性基因，线虫疾病抗性基因，除草剂抗性基因，影响谷粒组成或品质的基因，养分利用基因，真菌毒素减少基因，雄性不育基因，可选择标记物基因，可筛选标记物基因，阴性可选择标记物基因，阳性可选择标记物基因，影响植物农学特征(如产率)的基因，环境胁迫抗性基因(例如赋予对干旱、热、寒冷、冷冻、过湿、盐胁迫或氧化胁迫的抗性或耐性的基因)，改善淀粉特性或数量、油数量和品质、氨基酸或蛋白质组成的基因等等。在一个实施方案中，可读框编码下述蛋白质，所述蛋白质在进食位点中过表达时导致提高的线虫抗性。线虫抗性的分子机制可大幅变化，取决于具体的策略。例如，可通过过表达对线虫有毒性的基因来达成提高的线虫抗性，所述基因破坏线虫进食位点的形成和/或维持，修饰对线虫的养分的可获得性或递送，提高植物防御应答，或以任何方式对线虫生殖有害。在另一实施方案中，基因编码对线虫有毒的蛋白质。例如，编码微生物毒素或其片段的多核苷酸，来自昆虫的毒素或其片段例如美国专利号5,457,178；5,695,954；5,763,568；5,959,182中所述的那些等等适用于本发明的该实施方案。

作物植物和相应的致病线虫在《美国植物疾病索引)》(美国农业部手册第165号，1960)；《北美洲植物寄生线虫物种分布》(线虫学家学会，1985)和《美国植物及植物产品上的真菌》(美国植物病理学会，1989)中列出。例如，本发明所针对的植物寄生线虫包括而不限于，胞囊线虫和根癌线虫。本发明所靶向的具体植物寄生线虫包括而不限于大豆异皮线虫、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)、水稻异皮线虫(Heterodera oryzae)、木豆异皮线虫(Heterodera cajani)、车轴草异皮线虫(Heterodera trifolii)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)或烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、北方根结线虫(M.hapla)、爪哇根结线虫(M.javanica)、纳西根结线虫(M.naasi)、短小根结线虫(M.exigua)、起绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、窄小茎线虫(Ditylenchus angustus)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、多带螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、最短尾短体线虫(Pratylenchusbrachyurus)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、弯曲短体线虫(Paratylenchus curvitatus)、玉米短体线虫(Paratylenchus zeae)、肾形小盘旋线虫(Rotylenchulus reniformis)、银莲花拟毛刺线虫(Paratrichodorusanemones)、较小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、Paratrichodoruschristiei、麦粒鳗线虫(Anguina tritici)、Bidera avenae、小麦根瘿线虫(Subanguina radicicola)、塞氏纽带线虫(Hoplolaimus seinhorsti)、哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus Columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimusgaleatus)、半穿刺小垫刃线虫(Tylenchulus semipenetrans)、花生鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)、椰子细杆刃线虫(Rhadinaphelenchuscocophilus)、水平对刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、贝氏滑刃线虫(Aphelenchoides besseyi)、卡纳亚拟鞘线虫(Hemicriconemoideskanayaensis)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲剑线虫(Xiphinema americanum)、瘟疫坏死线虫(Cacopaurus pestis)等。

在一个实施方案中，被靶向的线虫属于诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫科。诱导巨细胞或合胞体细胞的线虫属于长针线虫科(Longidoridae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、异皮线虫科(Heterodidae)、根结线虫科(Meloidogynidae)、短体线虫科(Pratylenchidae)或小垫刃线虫科(Tylenchulidae)。尤其是异皮线虫科和根结线虫科。

因此，在另一个实施方案中，目标线虫属于选自由伪根瘤线虫属(Naccobus)、仙人掌胞囊线虫属(Cactodera)、长形胞囊线虫属(Dolichodera)、球异皮线虫属(Globodera)、异皮线虫属(Heterodera)、Punctodera、长针线虫线虫属(Longidorus)或根结线虫属(Meloidogyne)组成的组中的一个或多个属。在优选的实施方案中，目标线虫属于选自由伪根瘤线虫属(Naccobus)、仙人掌胞囊线虫属、长形胞囊线虫属、球异皮线虫属、异皮线虫属、Punctodera或根结线虫属组成的组中的一个或多个属。在更优选的实施方案中，目标线虫属于选自由球异皮线虫属、异皮线虫属或根结线虫属组成的组中的一个或多个属。在甚至更优选的实施方案，目的线虫属于选自由球异皮线虫属或异皮线虫属组成的组中的一个或两个属。在另一个实施方案中，目标线虫属于根结线虫属。

当靶向的线虫是球形胞囊线虫属(Globodera)时，靶向的物种可选自：蕃草属球异皮线虫(G.achilleae)、蒿球异皮线虫(G.artemisiae)、G.hypolysi、G.mexicana、G.millefolii、苹果球异皮线虫(G.mali)、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、烟草异皮线虫(G.Tabacum)和G.virginiae。在一个优选的实施方案中，靶向的球形胞囊线虫属(Globodera)线虫包括至少物种马铃薯白线虫(G.pallida)、烟草异皮线虫(G.Tabacum)或马铃薯金线虫(G.rostochiensis)之一。当靶向的线虫是胞囊线虫属(Heterodera)时，物种可选自燕麦异皮线虫(H.avenae)、胡萝卜异皮线虫(H.carotae)、鹰嘴豆异皮线虫(H.ciceri)、十字花科异皮线虫(H.cruciferae)、H.delvii、褐藻异皮线虫(H.elachista)、菲力普异皮线虫(H.filipjevi)、H.gambiensis、大豆异皮线虫、豌豆异皮线虫(H.goettingiana)、荞麦异皮线虫(H.graduni)、蛇麻异皮线虫(H.humuli)、大麦异皮线虫(H.hordecalis)、小麦异皮线虫(H.latipons)、燕麦异皮线虫(H.major)、苜蓿异皮线虫(H.medicaginis)、水稻异皮线虫(H.oryzicola)、巴基斯坦异皮线虫(H.pakistanensis)、酸模异皮线虫(H.rosii)、甘蔗异皮线虫(H.sacchari)、甜菜异皮线虫、高粱异皮线虫(H.sorghi)、车轴草异皮线虫、荨麻异皮线虫(H.urticae)、豇豆异皮线虫(H.vigni)和玉米异皮线虫(H.zeae)。在一个优选的实施方案中，靶向的胞囊线虫属线虫包括至少物种大豆异皮线虫、燕麦异皮线虫、木豆异皮线虫、豌豆异皮线虫、车轴草异皮线虫、玉米异皮线虫或甜菜异皮线虫之一。在一个更优选的实施方案中，靶向的线虫包括至少物种大豆异皮线虫或甜菜异皮线虫之一。在一个最优选的实施方案中，靶向的线虫是物种大豆异皮线虫。

当靶向的线虫是根结线虫属(Meloidogyne)时，靶向的线虫可选自高粱根结线虫(M.acronea)、M.arabica、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelliae)、哥伦比亚根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.cofeicola)、短小根结线虫(M.esigua)、禾草根结线虫(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫、印度根结线虫(M.indica)、海滨根结线虫(M.inornata)、爪哇根结线虫(M.javanica)、林氏根结线虫(M.lini)、苹果根结线虫(M.mali)、小头根结线虫(M.microcephala)、小突根结线虫(M.microtyla)、纳西根结线虫(M.naasi)、萨拉斯根结线虫(M.salasi)和泰晤士根结线虫(M.thamesi)。在一个优选的实施方案中，靶向的线虫包括至少爪哇根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或哥伦比亚根结线虫。

可用本发明的启动子多核苷酸转化任何植物物种。例如，可用含本发明启动子多核苷酸的核酸构建体转化的植物包括但不仅限于来自以下属的植物，所述属选自苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、小黑麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属、百脉根属(Lotus)、苜蓿属、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡芦巴属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、蓝英花属(Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)。

所述启动子多核苷酸的衍生物和变体可以优选地用在特定的植物进化枝、科、属或植物种中。可以从一个植物物种中分离的所述启动子多核苷酸的衍生物和变体优选地用在这样的植物中，其中所述的植物与用于分离所述启动子多核苷酸的衍生物和变体的植物属于相同的进化枝、科、属或种。因此，在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物，优选是禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae)植物，优选是禾本科植物。因此，在又一个实施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍属、小麦属、稻属、大麦属、黑麦属、燕麦属、甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、狼尾草属、狗尾草属(Setaria)、稷属、蟋蟀草属(Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodium)、羊茅属(Festuca)或黑麦草属植物。当植物是玉蜀黍属(Zea)时，优选的物种是玉米(Z.mays)。当植物是小麦属(Triticum)时，优选的物种是普通小麦(T.aestivum)、斯佩尔特小麦(T.speltae)或硬粒小麦(T.durum)。当植物是稻属(Oryza)时，优选的物种是稻(O.sativa)。当植物是大麦属(Hordeum)时，优选的物种是大麦(H.vulgare)。当植物是黑麦属(Secale)时，优选的物种是黑麦(S.cereale)。当植物是燕麦属(Avena)时，优选的物种是燕麦(A.sativa)。当植物是甘蔗属(Saccharum)时，优选的物种是甘蔗(S.officinarum)。当植物是高梁属(Sorghum)时，优选的物种是蜀黍(S.vulgare)、两色蜀黍(S.bicolor)或苏丹草(S.sudanense)。当植物是狼尾草属(Pennisetum)时，优选的物种是御谷(P.glaucum)。当植物是狗尾草属(Setaria)时，优选的物种是谷子(S.italica)。当植物是黍属(Panicum)时，优选的物种是野生稷(P.miliaceum)或柳枝稷(P.virgatum)。当植物是穇属(Eleusine)时，优选的物种是穇子(E.coracana)。当植物是芒属(Miscanthus)时，优选的物种是芒(M.sinensis)。当植物是短柄草属(Brachypodium)时，优选的物种是二穗短柄草(B.distachyon)。当植物是羊茅属(Festuca)时，优选的物种是苇状羊茅(F.arundinaria)、紫羊茅(F.rubra)或草甸羊茅(F.pratensis)。当植物是黑麦草属(Lolium)时，优选的物种是多年生黑麦草(L.perenne)或多花黑麦草(L.multiflorum)。或者植物可以是小黑麦属(Triticosecale)。

或者在一个实施方案中，植物是双子叶植物，优选地是豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、芸苔科(Brassicaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科(Linaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或柑橘(Citrus)科的植物。在一个实施方案中，植物是豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)或芸苔科(Brassicaceae)的植物。因此，在一个实施方案中，植物是豆科(Fabaceae)，优选地是大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵豆属(Lens)。优选的豆科(Fabaceae)物种是截形苜蓿(M.truncatula)、紫苜蓿(M.sativa)、大豆(G.max)、豌豆(P.sativum)、花生(A.hypogea)、鹰嘴豆(C.arietinum)、蚕豆(V.faba)、菜豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinus albus)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)或兵豆(Lensculinaris)。更优选的是大豆(G.max)和花生(A.hypogea)、紫苜蓿(M.sativa)物种。最优选的是大豆(G.max)。当植物是茄科(Solanaceae)时，优选的属是茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)或辣椒属(Capsicum)。优选的茄科物种是马铃薯(S.tuberosum)、番茄(L.esculentum)、烟草(N.tabaccum)或黄灯笼辣椒(C.chinense)。更优选的是马铃薯(S.tuberosum)。因此，在一个实施方案中，植物是十字花科(Brassicaceae)，优选的是拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔(Brassica)或萝卜属(Raphanus)。优选的十字花科(Brassicaceae)物种是拟南芥(A.thaliana)、欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleracea)、芥菜(B.juncea)或芜青(B.rapa)物种。更优选的是欧洲油菜(B.napus)物种。当植物是藜科(Chenopodiaceae)时，优选的属是甜菜属(Beta)，优选的物种是甜菜(B.vulgaris)。当植物是菊科(Asteraceae)时，优选的属是向日葵属(Helianthus)，优选的物种是向日葵(H.annuus)。当植物是锦葵科(Malvaceae)时，优选的属是棉属(Gossypium)或秋葵属(Abelmoschus)。当属是棉属(Gossypium)时，优选的物种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉(G.barbadense)，最优选的物种是陆地棉(G.hirsutum)。秋葵属(Abelmoschus)的优选的物种是咖啡黄葵(A.esculentus)。当植物是亚麻科(Linaceae)时，优选的属是亚麻属(Linum)，优选的物种是亚麻(L.usitatissimum)。当植物是大戟科(Euphorbiaceae)时，优选的属是木薯属(Manihot)、麻风树属(Jatropa)或蓖麻属(Ricinus)，优选的物种是木薯(M.esculenta)、麻风树(J.curcas)或蓖麻(R.comunis)。当植物是旋花科(Convolvulaceae)时，优选的属是番薯属(IPomea)，优选的物种是I.batatas。当植物是蔷薇科(Rosaceae)时，优选的属是蔷薇属(Rosa)、苹果属(Malus)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、悬钩子属(Rubus)、茶藨子属(Ribes)、越橘属(Vaccinium)或草莓属(Fragaria)，优选的物种是杂种荷兰草莓(Fragaria xananassa)。当植物是葫芦科(Cucurbitaceae)时，优选的属是黄瓜属(Cucumis)、西瓜属(Citrullus)或南瓜属(Cucurbita)，优选的物种是黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus lanatus)或西葫芦(Cucurbita pepo)。当植物是山茶科(Theaceae)时，优选的属是山茶属(Camellia)，优选的物种是茶(Camellia sinensis)。当植物是茜草科(Rubiaceae)时，优选的属是咖啡属(Coffea)，优选的物种是小果咖啡(C.arabica)或中果咖啡(C.canephora)。当植物是梧桐科(Sterculiaceae)时，优选的属是可可树属(Theobroma)，优选的物种是可可树(T.cacao)。当植物是柑橘属(Citrus)时，优选的物种是甜橙(C.sinensis)、柠檬(C.limon)、桔(C.reticulata)、柚(C.maxima)和柑橘物种的杂种等等。

在另一个实施方案中，在暴露于线虫刺激的植物根中诱导启动子多核苷酸。植物被植物寄生线虫感染或处于被植物寄生线虫感染过程中时，可存在线虫刺激。介导应答线虫刺激的表达的启动子多核苷酸也可以称作线虫诱导型启动子多核苷酸。涉及本发明的启动子、启动子多核苷酸、分离的核酸或多核苷酸的术语“根优选的表达”表示主要在根组织中、尤其是在根维管组织中表达。主要在根组织中表达表示，与相同量其他组织(例如叶、茎或花组织)中产生的mRNA量相比时，特定量的根组织中在本发明的启动子多核苷酸控制下产生的mRNA量至少高10倍、50倍、100倍或200倍。

本发明还涉及包含本发明启动子多核苷酸的表达盒。该语境中“表达盒”应当被广义地理解为包含盒中含有的所有下述序列，所述序列可影响目的核酸的转录和如果适用的话影响其翻译。除了本发明的启动子多核苷酸外，本发明的表达盒还可包含：促进启动子多核苷酸功能的调节元件，或允许在原核生物和/或真核生物中转录和/或翻译的遗传元件，和下游(在3′-方向中)调节元件，例如转录终止序列和多聚腺苷酸化序列。本发明表达盒的多种组件顺序并有效地连接在一起。

因此，本发明的表达盒可包含能够介导根优选和/或线虫诱导的表达的启动子，所述启动子包含启动子多核苷酸，其中所述启动子多核苷酸选自以下多核苷酸：a)具有SEQ ID NO：1中公开的序列的多核苷酸；b)包含下述多核苷酸的核苷酸476到1476的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ IDNO：1中公开的序列；c)与a)或b)的多核苷酸具有至少70％同一性的多核苷酸；d)在严格条件下与a)或b)的多核苷酸杂交的多核苷酸；和e)包含下述多核苷酸的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸片段的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1中公开的序列。在另一实施方案中，启动子在被植物寄生线虫感染的植物根中被诱导。

可以任选地在本发明表达盒中包括的具体遗传元件包括而不限于允许在细菌中复制的复制起点，例如来自pBR322或P15A ori的ORI区；或土壤杆菌T-DNA转移所需要的元件例如，T-DNA的左边界和/或右边界。本发明表达盒的其他成分可以包括而不限于，额外的调节元件，例如增强子、内含子、多接头、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结合位点等。示例性增强子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因(Ellis等，1987)、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis，1987)、玉米矮缩I基因(Vasil 1989)、TMV Ω元件(Gallie，1989)和非植物性真核生物(例如酵母；Ma 1988)的启动子的元件。示例性行植物内含子序列包括来自Adh 1、bronze 1、肌动蛋白1、肌动蛋白2(WO 00/760067)的内含子或蔗糖合酶内含子；见：The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，New York(1994)。

病毒前导序列也可以增强本发明表达盒转录目的核酸。例如，来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已经证明有效增强表达。本领域已知的其他前导序列包括，但不限于：小RNA病毒前导序列，例如脑脊髓炎病毒(EMCV)前导序列；马铃薯Y病毒属前导序列、烟草蚀纹病毒(TEV)前导序列；MDMV(玉米矮花叶病毒)前导序列；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列、来自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列。

本发明的表达盒也包含转录终止元件或多聚腺苷酸化信号，示例性转录终止元件包括来自根瘤土壤杆菌胭脂碱合酶基因的那些转录终止元件(Bevan，1983)、来自根瘤土壤杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子以及来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制物I或Il基因的3′末端。

将要被转录成RNA并任选地表达为蛋白质的第二多核苷酸插入本发明的表达盒中，用于转化进生物中。根据本发明，第二多核苷酸序列被置于本发明启动子多核苷酸的下游(即3′-方向上)和转录终止元件的上游，与其共价连接。优选地，第二多核苷酸序列和本发明的启动子多核苷酸之间的距离不超过200碱基对，更优选地不超过100碱基对，最优选地不超过50碱基对。

也可通过将本发明的启动子多核苷酸插入植物基因组中，来装配本发明的表达盒。这类插入可导致与基因组固有的目的核酸序列的有效连接。作为本发明启动子多核苷酸的转录调节特性的结果，这类插入允许目的核酸在被线虫诱导后优先在根组织中表达或过表达。插入可以是定向的或随机的。优选地，插入是定向的并通过例如同源重组实现。通过该步骤，可以用本发明的启动子多核苷酸完全或部分地替换天然的启动子，从而修饰内源基因的表达谱。

本发明的表达盒可被插入重组载体、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或适合转化进宿主细胞中的任何其他载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如但不仅限于大肠杆菌(Escherichia coli)、根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)和毛根土壤杆菌(A.rhizogenes)细胞和植物细胞。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。或者，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体DNA中。

本发明的表达盒可被转化进植物中提供转基因植物，所述转基因植物包含与本发明的启动子多核苷酸有效连接的一个或多个多核苷酸。该实施方案的转基因植物包含下述启动子，所述启动子包含如SEQ ID NO：1中公开的启动子多核苷酸序列或SEQ ID NO：1的最小启动子多核苷酸片段。或者，本发明的转基因植物包含能够介导根优选和/或线虫诱导的表达的启动子多核苷酸，所述启动子多核苷酸在严格条件下与下述启动子多核苷酸杂交，所述启动子多核苷酸具有SEQ ID NO：1中公开的序列或SEQ ID NO：1的最小启动子多核苷酸片段。另外，本发明的转基因植物包含能够介导根优选和/或线虫诱导的表达的启动子多核苷酸，所述启动子多核苷酸与下述启动子多核苷酸具有至少70％的序列同一性，所述启动子多核苷酸具有SEQ ID NO：1中公开的序列或SEQ ID NO：1的最小启动子多核苷酸片段。

如本文中所用，术语“植物”根据上下文可以理解为意指完整植株、植物细胞、植物器官、收获的种子及其子代。词汇“植物”也指任一植物，尤其种子植物，并且可以包括，但不限于作物植物。植物部分或植物器官包括，但不限于茎、根、嫩枝、果实、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、微孢子、下胚轴、子叶、花药、萼片、花粉、非收获的种子等。收获的种子是指从生产种子的植物上取下的种子，而非收获的种子是指仍然与生产种子的植物相连的种子，例如其处于生长或成熟阶段。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。所述植物可以源于选自由玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、柑桔树、菠萝、椰子、香蕉、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜(oilseed rape)、芸苔、甜菜、卷心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种(Lotus sp.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、多年生草、黑麦草和拟南芥组成的组中的属。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法可见于例如WO2006/024509(PCT/EP2005/009366；USSN60/6060789)和上文Sambrook et al.中，以及其他实验室手册例如Methods in MolecularBiology，1995，Vol.44，Agrobacterium protocols，Ed：Gartland and Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey中。转化双子叶植物的通用方法也公开于例如美国专利号4,940,838；5,464,763等等中。用于转化特定双子叶植物例如棉花的方法公开于美国专利号5,004,863；5,159,135和5,846,797中。大豆转化方法公开于美国专利号4,992,375；5,416,011；5,569,834；5,824,877；6,384,301和EP 0301749B1中。其他植物转化方法公开于例如美国专利号4,945,050；5,188,958；5,596,131；5,981,840等等中。

转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、使用基因枪的生物射弹方法(Fromm ME et al.，Bio/Technology.8(9)：833-9，1990；Gordon-Kamm et al.Plant Cell 2：603，1990)、电穿孔、在含DNA的溶液中温育干胚，以及显微注射。在这些直接转化方法的情况下，使用的质粒不需要满足任何具体的要求。可使用单一质粒，例如pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184的质粒等等。如果要从被转化的细胞再生完整的植物，则另外的可选择标记物基因优选地位于质粒上。直接转化技术同样适用于双子叶和单子叶植物。可以通过借助于土壤杆菌的细菌感染(例如EP 0 116 718)、借助于病毒载体的病毒干扰(EP 0 067 553；US 4,407,956；WO 95/34668；WO 93/03161)或借助于花粉(EP 0 270 356；WO 85/01856；US 4,684,611)完成转化。基于土壤杆菌的转化技术(特别是对于双子叶植物而言)是本领域公知的。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物。T-DNA(转化DNA)被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如Horsch RB et al.(1985)Science 225：1229中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如White FF，Vectors forGene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，pp.15-38；Jenes B et al.Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，pp.128-143；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant MolecBiol 42：205-225中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

可使用已知的植物育种方法，将本发明的转基因植物与以下杂交制备种子：类似的转基因植物，或缺少与本发明启动子多核苷酸有效连接的基因的转基因植物，或非转基因植物。另外，本发明的转基因植物可包括下述另一转基因植物和/或与之杂交从而在植物和/或其后代中产生转基因“垛叠”，所述另一转基因植物包含与本发明的启动子多核苷酸或另一启动子有效连接的一个或多个不同基因。然后种植种子，获得杂交的能育转基因植物，其包含目的核酸和本发明的启动子多核苷酸。杂交的能育转基因植物可具有通过母本或通过父本遗传的具体表达盒。第二种植物可以是近交的植物。杂交的能育转基因植物可以是杂种。还包括在本发明中的是任何这些杂交的能育转基因植物的种子。本发明的种子可从能育的转基因植物收获并用于栽培本发明的被转化植物的后代，包括包含所述DNA构建体的杂种植物株系。

也可以如下实现“基因垛叠”：通过植物转化将两个或更多多核苷酸转移进细胞核中。在该语境中，“基因”表示编码全长蛋白质的多核苷酸以及编码RNAi构建体或全长蛋白质的结构域的多核苷酸。在转化期间，可顺序地或同时将多个多核苷酸引入细胞核中。多个植物基因或目标病原体基因可以通过使用靶定多个连接的部分目的序列的单个转基因借助沉默机制、尤其RNAi进行下调。在各自启动子控制下的多个垛叠基因也可以过量表达以获得想要的单个或多个表型。也可以将含有过量表达基因和受沉默靶标的基因垛叠的构建体导入植物，从而产生单个或多个农学重要的表型。在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与目的多核苷酸序列的任一组合垛叠以产生所需表型。所述组合可以产生具有多种性状组合的植物，所述性状组合包括，但不限于抗病性、除草剂耐受性、产量增加、耐寒性和耐旱性。这些垛叠的组合可以由任一方法产生，所述的任一方法包括，但不限于通过常规方法或通过遗传方法对植物进行杂交育种。若性状通过遗传转化进行堆叠，则目的多核苷酸序列可以按照任一顺序依次或同时组合。例如，若欲导入两个基因，则这两个序列可以包含在独立的转化盒内或位于相同的转化盒上。所述序列的表达可以由相同或不同的启动子驱动。

本发明还包括作物，所述的作物包括在农田中一起栽种的多种本发明转基因植物。

本发明的转基因植物可以用于控制作物中植物寄生线虫侵染的方法内，所述方包括以下步骤：从包含表达盒的种子培育出所述作物，其中所述的表达盒包含与编码物质的第二核酸有效连接的本发明植物启动子多核苷酸，所述的物质破坏所述植物寄生线虫的代谢、生长和/或繁殖，改善植物对所述植物寄生线虫的耐受性或对所述植物寄生线虫有毒，其中所述表达盒稳定整合至植物细胞、植物和/或种子的基因组内。此类物质包括而不限于，与对于线虫存活、变态或繁殖必需的植物寄生线虫的靶基因基本上同一的双链RNA；与维持线虫采食部位所需的植物基因基本上同一的双链RNA；反义RNA、siRNA、miRNA或其前体、干扰所述线虫代谢、存活、变态或繁殖的蛋白质，微生物毒素、来自昆虫的毒素或干扰所述线虫代谢、存活、变态或繁殖的任一毒素等。

以下实例不意图限制本发明权利要求书的范围，而是意图作为某些实施方案的示例。所例举方法中技术人员想到的任一变化将属于本发明的范围。

实施例1：从拟南芥克隆SCN-诱导型启动子

提取拟南芥(哥伦比亚生态型)基因组DNA。使用标准PCR扩增方案，克隆对应于拟南芥基因座标记At5g12170的、包含5’-非翻译区的、ATG密码子紧邻上游的1,476bp(SEQ ID NO：1)基因组DNA区(推定的启动子序列)。对应于At5g12170启动子区的1,476bp DNA片段显示为SEQ ID NO：1。PLACE(National Institute of Agrobiological Sciences，Ibaraki，Japan)分析结果指出，在SEQ ID NO：1中启动子序列3’端上游300bp区域中不存在TATA框。

实施例2：从大豆克隆At5g12170-样基因

使大豆栽培种Williams 82在琼脂平板上萌发三天，然后转移至萌发袋中。一天后，用大豆异皮线虫3号小种的第二阶段幼虫(J2)孵育每个幼苗。接种后六天，使用已知方法将新的根组织切成1cm长的段、固定、包埋在cryomold中并切片。通过扩大的细胞尺寸、增厚的细胞壁和稠密的细胞质的特有形态识别合胞体细胞，并使用PALM显微镜(P.A.L.M.MicrolaserTechnologies GmbH，Bernried，德国)解剖入RNA提取缓冲液中。

使用已知方法提取总细胞RNA、扩增并用荧光标记。作为对照，从“非-合胞体”和未经处理的对照根分离总RNA并进行相同的RNA扩增过程。将扩增的RNA与专有的大豆cDNA阵列杂交。图4中的表格总结了通过cDNA微阵列测量的表达数据，所述cDNA微阵列针对所有三种细胞/组织样品(合胞体、SCN感染的非-合胞体和未经处理的对照根组织)中的基因进行分析。基因表达的相对水平显示为归一化的信号强度(±标准差)。如图4中所述，大豆cDNA克隆GM50657480被鉴定为在SCN-感染的大豆根的合胞体中被上调。图3描绘了大豆cDNA克隆GM50657480的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。GM50657480 cDNA序列(SEQ ID NO：2)被确定为不是全长的，因为不存在ATG启始密码子并且根据图6中所示GM50657480的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与At5g12170的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的比对确定。

实施例3：全长启动子活性的转基因发根测定

为了评价克隆的启动子的表达活性，将SEQ ID NO：1的核苷酸1-1476克隆在GUS报告基因(细菌β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因(Jefferson(1987)EMBO J.6，3901-3907))上游，产生双元载体“pAW280”。双元载体中的植物可选择标记物是由天然拟南芥AHAS启动子驱动的来自拟南芥的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因的除草剂抗性形式(Sathasivan et al.，Plant Phys.97：1044-50，1991)。

通过电穿孔(Cho et al.，(1998)Plant Sci.138，53-65)将双元载体pAW280转化进毛根土壤杆菌(A.rhizogenes)K599菌株中。在接种毛根土壤杆菌之前，使来自大豆Williams 82(SCN易感)的种子萌发，切除子叶并数次对近轴侧造成创伤。将毛根土壤杆菌悬浮液接种在创伤表面上，并在25℃、16小时/天光照下，将接种过的子叶近轴侧向上孵育三天。然后将子叶转移至MS平板上，所述平板含有羧苄青霉素(为了阻抑毛根土壤杆菌生长)和1μM ARSENAL(灭草烟(imazapyr)，BASF Corporation，Florham Park，NJ)作为选择剂。两周后从受伤侧诱导出发根。收集抗ARSENAL并在选择培养基上生长的根，将其转移至相同组成的新鲜选择培养基上，并在25℃下黑暗中培养。收获发根并将它们在选择培养基上培养两周后，将发根在含羧苄青霉素但是不含ARSENAL的MS培养基上传代培养。

通过用pAW280转化产生若干种独立的转基因发根株系。传代培养后约三周，用大豆异皮线虫3号小种J2接种转基因发根株系。大豆异皮线虫接种后十二天(DAI)，收获发根并使用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)测定GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。在接种后的每个时间点，也在GUS染色溶液中染色来自每个株系的未经接种的对照平板。然后在显微镜下观察根，以检测GUS表达。对于每个转基因株系而言，观察10个随机挑取的合胞体并记录GUS表达强度。使用以下的评分指标：“-”表示无染色，“+”表示弱染色，“++”表示强染色。使用10个计数的上舍入均值(round-up average)确定株系合胞体中的GUS表达水平。另外，也使用相同的GUS评分指标记录相同株系中其它根组织(例如愈伤组织、根尖、维管系统、皮层和原基(primordial))的GUS表达水平：“-”表示无染色，“-/+”表示存在约25％的测试株系在＜25％被观察的根组织中具有一定的维管GUS染色，“+”表示弱染色，“++”表示强染色。用pAW280转化的株系的结果在图7中展示。GUS染色的结果指出对测试的大部分株系而言，pAW280中的启动子片段在12DAI时在合胞体中显示强GUS表达。相反，其它根部分例如根尖、维管组织和根皮层中的GUS表达未被检出、在株系间高度可变或较弱。

实施例4：最小启动子片段的转基因发根测定

使用基于SEQ ID NO：1的引物和标准PCR扩增方案，从pAW280扩增SEQ ID NO：1的碱基476到1476所代表的1001bp启动子缺失片段和SEQ ID NO：1的碱基977到1476所代表的500bp启动子缺失片段。通过标准琼脂糖凝胶电泳验证每种PCR产物的扩增DNA片段大小，并通过Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)提取DNA。将来自SEQID NO：1的启动子缺失克隆至GUS报告基因上游，分别产生双元载体“RTJ119”和“RTJ120”。双元载体中的植物选择标记物是由实施例3中所述拟南芥AHAS启动子驱动的突变的AHAS基因。如实施例3中所述，将双元载体pAW280、RTJ119和RTJ120转化进毛根土壤杆菌K599菌株中，产生转基因发根。用大豆异皮线虫SCN 3号小种J2接种转基因发根株系，并如实施例3中所述测定GUS表达。

用pAW280、RTJ119和RTJ120转化的株系的结果列于图8中。RTJ119包含的SEQ ID NO：1的1001bp最小启动子片段赋予了合胞体中线虫诱导的表达。RTJ119中的合胞体染色强度不如在pAW280中观察到的强。RTJ120包含的SEQ ID NO：1的500bp片段不赋予合胞体中线虫诱导的表达。

实施例5：全植株GUS染色

通过转化代表性构建体产生转基因大豆全植株，以表征整个植物生活周期中根和全植株组织中响应线虫感染的启动子表达，所述转基因大豆全植株包含与GUS报告基因有效连接的SEQ ID NO：1表示的启动子序列或其变体。大豆全植株中启动子表征的代表性方法包括但不限于以下描述。测试转基因大豆T1种子的接合性(zygosity)，并使单拷贝事件萌发、在温室条件下培养，并针对叶、茎、花、胚和种皮组织中不同发育阶段的GUS表达进行取样。另外，在接种和未接种的对照根中，在SCN感染之前和之后的不同时间收获根组织。针对每个事件测试多种植物，以测定GUS染色分析中的一致趋势。将收获的样品从植物切下并如实施例3中所述测定GUS表达。然后观察组织并对GUS染色的强度评分。

序列表

<110>巴斯福植物科学有限公司

     A·威格

<120>新的植物基因线虫诱导型启动子及其使用方法

<130>15142

<160>9

<170>PatentIn版本3.4

<210>1

<211>1476

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>1

gctcgcgtta gttccactca aggagtatcc tttcttcctt gcgcaactct ccaccttcgg     60

gtaaagtacc atctctagca tcttgagtct tgatcaactt ctgttttgct tactctcaaa    120

atgcattaat ttttttttat actagatcat agtattatat ctcttaatct acctattgaa    180

atctacttaa tgtttttact aaaacctacg tgtttctctt tagagaattt tgtgctatgc    240

atgaattaga ggttagtaat gtgtaatact tcataagtct agatttattt gttggttaac    300

acgtttagta attcacacac acacaccacc ttagatattt tactgtgaat tagaaaaaga    360

tacatagtta ggagtgtttt tttaaaaaaa ttcaatcatg agaaaattag aggtgtgatg    420

ttatacatta tgaaaatgca aagggcagat acgaataaat tagaaacttg tttaacgggt    480

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ttgtaggcgc attatatcat ttctctacat gcaatgaatg tacatacatt aattcacatt    600

tatttttgga ataatcatat gagtgatcga agtttgtatt tatatattca atcttcacaa    660

actactttta tttaaaaatc atttgcaaaa tgctatttta ttgacaaaaa gatatatgct    720

ataaaataaa ataaaattca caaactatag tcattaatac aaaaagaaat cattgaatat    780

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accattctta tttagtgcta actttgtgag ggttggaata acgaaccaag ctgattcaaa   1020

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ggtgtgtttt tctcaaacca agctaaatgg aatccattgt aaaccaaaat gttcacacct   1140

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ctgattgcct tgcatcatat tcttggatca actttttttt tttttttttt tggggtaatt   1260

aacaaaatgc ttaaatttct caagactata ggatcacatt acctgtgtgc ttaacataac   1320

ttttagatag gctagagaat tgatctatta caagataatc aataatttac agaagaaaac   1380

attctttttt ttgttctatt tccttcatgt aggtatgtag ctgtatatta tactatcttg   1440

tattttcgat atcgtgctgg aactgtcaca gatgca                             1476

<210>2

<211>647

<212>DNA

<213>大豆

<400>2

aagatggtgc agcctgcttc ctaaattttg gtacattatc aagtggatgt gatggtgccc     60

ctctgcttcc tctgctgttt attattgtaa acataggttt caatattgca ttgcttcatc    120

tcctcaagat ctcttcagct gttgtatctt gtcttgcttc cacattttca gtcccaatat    180

ccatctacgt gttcaccatg ccattgccat accttggtgt tgcctcctct cttccaacag    240

gctttatggc aggggccatt atcctcattt tgggcttact catttatgct tggacccctt    300

caaatggttc ctcgggtgct tccttctcaa cttcctccac ctagagaggc tagaatgagt    360

tgacatgtca ttgcagatag tacaacacca caaggaacta attcaggttc gcttttagga    420

gacggctata agaaggagaa agaaataggg cgttcttgta agttgtaata gttgttcgta    480

agcatttttt atgagctaag cttaagtaag aaagagacta gactatagat agaacaggtt    540

ccaagttcaa tttttatgta agctaaggaa agtaaataga gaataaaagt cactttgttg    600

acagaggaaa tgatattgga ccatttggat gcaaaaaaaa aaaaaaa                  647

<210>3

<211>113

<212>PRT

<213>大豆

<400>3

Asp Gly Ala Ala Cys Phe Leu Asn Phe Gly Thr Leu Ser Ser Gly Cys

1               5                   10                  15

Asp Gly Ala Pro Leu Leu Pro Leu Leu Phe Ile Ile Val Asn Ile Gly

            20                  25                  30

Phe Asn Ile Ala Leu Leu His Leu Leu Lys Ile Ser Ser Ala Val Val

        35                  40                  45

Ser Cys Leu Ala Ser Thr Phe Ser Val Pro Ile Ser Ile Tyr Val Phe

    50                  55                  60

Thr Met Pro Leu Pro Tyr Leu Gly Val Ala Ser Ser Leu Pro Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Met Ala Gly Ala Ile Ile Leu Ile Leu Gly Leu Leu Ile Tyr Ala

                85                  90                  95

Trp Thr Pro Ser Asn Gly Ser Ser Gly Ala Ser Phe Ser Thr Ser Ser

            100                 105                 110

Thr

<210>4

<211>276

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>4

Met Leu Ser Val Pro Lys Ser Pro Phe Leu Ile Val Gly Ile Leu Glu

1               5                   10                  15

Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Asn Leu Ser Gly

            20                  25                  30

Pro Ser Thr Thr Val Leu Ser Gln Arg Lys Pro Asn Thr Arg Met Tyr

        35                  40                  45

Ser Cys Ser Ser Arg Cys Asn Arg Gln Cys Gly Lys Val Arg Ser Ala

    50                  55                  60

Phe Val Leu Ile Phe Cys Gly Ser Gly Ala Ala His Ser Leu Asn Glu

65                  70                  75                  80

Ala Gly Val Leu Trp Ile Leu Leu Met Val Leu Ser Phe Leu Leu Gln

                85                  90                  95

Gly Ala Gly Thr Val Leu Lys Glu Val Ile Phe Ile Asp Ser Gln Arg

            100                 105                 110

Arg Leu Lys Gly Ala Ser Leu Asp Leu Phe Ile Val Asn Ser Tyr Gly

        115                 120                 125

Ser Ala Phe Gln Ala Ile Cys Ile Ala Leu Leu Leu Pro Phe Leu Ser

    130                 135                 140

Lys Leu Trp Gly Ile Pro Phe Asn Gln Leu Gly Thr Tyr Leu Lys Asp

145                 150                 155                 160

Gly Ala Val Cys Phe Leu Asn Asn Gly Thr Ile Thr Lys Gly Cys Asp

                165                 170                 175

Gly Ala Pro Phe Leu Pro Leu Leu Phe Val Ile Met Asn Ile Gly Tyr

            180                 185                 190

Asn Ile Ala Leu Leu Arg Leu Leu Lys Ile Ser Ser Ala Val Val Ser

        195                 200                 205

Cys Leu Ala Ser Thr Val Ser Val Pro Ile Ala Val Phe Leu Phe Thr

    210                 215                 220

Met Pro Leu Pro Tyr Leu Gly Val Ala Ser Ser Leu Pro Lys Gly Phe

225                 230                 235                 240

Met Gly Gly Thr Ile Ile Leu Val Leu Gly Met Ile Leu Tyr Ser Trp

                245                 250                 255

Thr Pro His Gly Ala Asn Ser Ser His Thr Asp Ser Val Ile Pro Ser

            260                 265                 270

Pro Pro Pro Thr

        275

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物序列

<400>5

cccggggctc gcgttagttc cactc                                                     25

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物序列

<400>6

ggcgcgcctg catctgtgac agttccag                                                  28

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物序列

<400>7

acgtctgcag cgggtcagag ttggcttc                                                  28

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物序列

<400>8

agctctgcag gctaactttg tgagggttg                                                 29

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物序列

<400>9

tgcaggcgcg cctgcatctg tg                                                        22

Claims (18)

1.包含分离的启动子多核苷酸的启动子，所述启动子能够介导根优选的和/或线虫诱导的表达，所述启动子多核苷酸选自如下多核苷酸：

a)具有包含SEQ ID NO：1的核苷酸1到1476的序列的多核苷酸；

b)多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO：1中公开的序列的多核苷酸的核苷酸476到1476；

c)与a)或b)的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；

d)在严格条件下与a)或b)的多核苷酸杂交的多核苷酸；和

e)包含SEQ ID NO：1的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸。

2.权利要求1的启动子，其中所述分离的启动子多核苷酸具有包含SEQ ID NO：1的核苷酸1到1476的序列。

3.权利要求1的启动子，其中所述分离的启动子多核苷酸包含SEQ IDNO：1的核苷酸476到1476。

4.权利要求1的启动子，其中所述分离的启动子多核苷酸与以下多核苷酸有至少70％的序列同一性：

a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸1到1476的多核苷酸；

b)包含SEQ ID NO：1的核苷酸476到1476的多核苷酸。

5.权利要求1的启动子，其中所述分离的启动子多核苷酸与以下多核苷酸杂交：

a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸1到1476的多核苷酸；

b)包含SEQ ID NO：1的核苷酸476到1476的多核苷酸。

6.包含权利要求1的启动子的表达盒。

7.权利要求6的表达盒，其中所述第二多核苷酸赋予植物选自以下的性状：提高的产量、在胁迫条件下提高的存活、提高的营养品质、对植物寄生线虫的提高的抗性、改良的蛋白质含量和改良的油含量。

8.权利要求7的表达盒，其中所述第二多核苷酸通过编码如下物质而赋予对植物寄生线虫的提高的抗性：

a)破坏植物寄生线虫代谢、生长或生殖的物质，

b)对植物寄生线虫有毒的物质。

9.用表达盒转化的转基因植物，所述表达盒包含与第二多核苷酸有效连接的分离的启动子多核苷酸，其中：

a)分离的启动子多核苷酸选自：

i)包含SEQ ID NO：1的核苷酸1到1476的多核苷酸；

ii)包含SEQ ID NO：1的核苷酸476到1476的多核苷酸；

iii)与i)或ii)的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；

iv)在严格条件下与i)或ii)的多核苷酸杂交的多核苷酸；和

v)包含SEQ ID NO：1的至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸；

并且

b)分离的启动子多肽能够介导根优选的或线虫诱导的表达。

10.权利要求9的植物，其中所述植物是单子叶植物。

11.权利要求9的植物，其中所述植物是双子叶植物。

12.权利要求9的植物，其中所述植物选自玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、柑桔树、菠萝、椰子、香蕉、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜(oilseed rape)、芸苔、甜菜、卷心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种(Lotus sp.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、多年生草、黑麦草和拟南芥。

13.权利要求9的植物，其中所述分离的启动子多核苷酸包含SEQ IDNO：1的核苷酸1到1476。

14.权利要求9的植物，其中所述分离的启动子多核苷酸包含SEQ IDNO：1的核苷酸476到1476。

15.权利要求9的植物，其中所述分离的启动子多核苷酸与以下多核苷酸有至少70％的序列同一性：

a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸1到1476的多核苷酸，或

b)包含SEQ ID NO：1的核苷酸476到1476的多核苷酸。

16.权利要求9的植物，其中所述分离的启动子多核苷酸与以下多核苷酸杂交：

a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸1到1476的多核苷酸，或

b)包含SEQ ID NO：1的核苷酸476到1476的多核苷酸。

17.赋予或提高植物中线虫抗性的方法，其包括步骤：

a)制备如权利要求6所述的表达盒；

b)用步骤a)的表达盒转化植物细胞；

c)再生转化的植物细胞以产生转基因植物，和

d)选择与不含有所述表达盒的具有相同基因型的植物相比具有提高的线虫抗性的植物。

18.权利要求17的方法，其中所述有效连接的第二多核苷酸通过编码如下物质而提高植物对植物寄生线虫的抗性：

a)破坏植物寄生线虫的代谢、生长或生殖的物质，

b)对植物寄生线虫有毒的物质。

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