MX2012009033A - Plantas transgenicas resistentes a los nematodos. - Google Patents

Abstract

Composiciones de ARN bicatenario y plantas transgénicas capaces de inhibir la expresión de genes vegetales, y métodos asociados con ellas. Específicamente, el uso de ARN de interferencia para inhibir la expresión de un gen blanco vegetal que es un gen CLASP1, un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY de planta, y la generación de plantas que tienen mayor resistencia a los nematodos parasitarios.

Description

PLANTAS TRANSGÉNICAS RESISTENTES A LOS NEMATODOS El campo de la presente invención es el control de nematodos, en particular, el control de nematodos de quiste de soja. La invención también se refiere a la introducción de material genético en plantas que son susceptibles a los nematodos a fin de aumentar la resistencia a ellos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los nematodos son gusanos microscópicos que se alimentan de las raíces, hojas y tallos de más de 2.000 cultivos de hilera, vegetales, frutas y plantas ornamentales, y se calcula que causan pérdidas de cultivos de USD 100.000 millones a nivel mundial. Varias especies de nematodos parasitarios infectan las plantas de cultivo, incluso nematodos de nudos radiculares (RKN) y nematodos formadores de quistes y lesiones. Los nematodos de nudos radiculares, que se caracterizan por causar la formación de agallas radiculares en los sitios de alimentación, tienen un rango de huéspedes relativamente amplio y, en consecuencia, son patogénicos para gran cantidad de especies de cultivo. Las especies de nematodos formadores de quistes y lesiones tienen un rango de huéspedes más limitado, pero aún así causan pérdidas considerables en los cultivos susceptibles a ellos.

Los nematodos patogénicos están presentes en todos los Estados Unidos, y las mayores concentraciones se observan en las regiones cálidas y húmedas del Sur y el Oeste, y en suelos arenosos. El nematodo del quiste de la soja (Heterodera glycines), la plaga más severa de las plantas de soja, se descubrió por primera vez en los Estados Unidos, en Carolina del Norte, en 1954. Algunas zonas están tan intensamente infestadas por el nematodo del quiste de la soja (SCN) que la producción de soja ya no es económicamente posible sin medidas de control. Aunque la soja es el principal cultivo económico atacado por el SCN, éste parásita alrededor de cincuenta huéspedes en total, incluso cultivos de campo, vegetales, plantas ornamentales y malezas.

Los signos del daño causado por los nematodos incluyen atrofia y color amarillento de las hojas, y marchitamiento de las plantas durante los períodos de calor. Sin embargo, la infestación por nematodos puede causar significativas pérdidas del rendimiento sin que haya ningún síntoma visible de la enfermedad en la superficie. Las causas principales de la reducción del rendimiento son el daño subterráneo de las raíces.

Las raíces infectadas por SCN se vuelven enanas y se atrofian. La infestación por nematodos también puede disminuir la cantidad de nodulos fijadores de nitrógeno en las raíces, y pueden hacer que las raíces sean más susceptibles al ataque de otros patógenos de plantas que habitan en el suelo.

El ciclo de vida del nematodo tiene tres etapas principales: huevo, juvenil y adulto. El ciclo de vida varía entre las especies de nematodos. Por ejemplo, el ciclo de vida del SCN se completa usualmente en 24 a 30 días en condiciones óptimas, mientras que otras especies pueden tardar hasta un año o más en completar el ciclo de vida. Cuando los niveles de temperatura y humedad se vuelven favorables en la primavera, los juveniles con forma de gusanos salen de los huevos en el suelo. Sólo los nematodos en la etapa de desarrollo juvenil son capaces de infectar las raíces de la soja.

El ciclo de vida del SCN ha sido objeto de muchos estudios, y como tal son un ejemplo útil para comprender el ciclo de vida del nematodo. Luego de penetrar en las raíces de la soja, los SCN juveniles se desplazan a través de la raíz hasta que entran en contacto con el tejido vascular; en ese momento detienen su migración y comienzan a alimentarse. Con un estilete, el nematodo inyecta secreciones que modifican ciertas células de la raíz y las transforman en sitios de alimentación especializados. Las células de las raíces se transforman morfológicamente en grandes sincitios multinucleados (o en células gigantes en el caso de RKN), que se usan como fuente de nutrientes para los nematodos. Los nematodos que se alimentan activamente sustraen los nutrientes esenciales de la planta, lo que ocasiona pérdidas del rendimiento. A medida que los nematodos hembra se alimentan, se hinchan y finalmente se vuelven tan grandes que sus cuerpos rompen el tejido de la raíz y quedan expuestos en la superficie de la raíz.

Luego de un período de alimentación, los nematodos SCN machos, que no se hinchan durante la adultez, migran fuera de la raíz hacia el suelo y fertilizan a las hembras adultas de mayor tamaño. Mientras que los machos luego mueren, las hembras permanecen unidas al sistema radicular y continúan su alimentación. Los huevos dentro de las hembras hinchadas comienzan a desarrollarse, inicialmente en una masa o saco de huevos fuera del cuerpo y luego dentro de la cavidad corporal del nematodo. Finalmente, toda la cavidad corporal de la hembra adulta se llena de huevos y el nematodo muere. El cuerpo lleno de huevos de la hembra muerta se denomina quiste. Por último, los quistes se desprenden y quedan sueltos en el suelo. Las paredes del quiste se endurecen, lo que provee una excelente protección para alrededor de 200 a 400 huevos contenidos en su interior. Los huevos del SCN sobreviven dentro del quiste hasta que se producen las condiciones adecuadas de incubación. Si bien muchos de los huevos pueden salir del quiste dentro del primer año, muchos también sobreviven dentro de los quistes protectores durante varios años.

Un nematodo se puede desplazar por el suelo sólo unas pocas pulgadas por año por sí mismos. Sin embargo, la infestación por nematodos se puede esparcir considerables distancias de diversas maneras. Cualquier cosa que pueda mover suelo infestado es capaz de esparcir la infestación, incluso maquinarias, vehículos y herramientas agrícolas, viento, agua, animales y trabajadores agrícolas. A menudo, las partículas de tierra del tamaño de semillas contaminan las semillas cosechadas. En consecuencia, la infestación por nematodos se puede esparcir cuando se plantan semillas contaminadas de campos infestados en campos no infestados. Incluso hay pruebas de que ciertas especies de nematodos pueden ser esparcidas por aves. Sólo se pueden prevenir algunas de estas causas.

Las prácticas tradicionales para controlar la infestación por nematodos incluye: mantener adecuados nutrientes del suelo y niveles de pH del suelo en el suelo infestado por nematodos; controlar otras enfermedades de las plantas, así como plagas de insectos y malezas; usar prácticas sanitarias, tales como arado, siembra y cultivo de campos infestados por nematodos sólo después de trabajar en campos no infestados; limpiar exhaustivamente el equipamiento con vapor o agua a alta presión después de trabajar en campos infestados; no usar semillas cultivadas en tierras infestadas para sembrar campos no infestados, a menos que la semilla haya sido limpiada adecuadamente; rotar los campos infestados y alternar cultivos huésped con cultivos no huésped; usar nematicidas; y sembrar variedades de plantas resistentes.

Se propusieron métodos para la transformación genética de las plantas a fin de conferirles mayor resistencia a los nematodos parasitarios de planta. Las patentes estadounidenses No. 5.589.622 y 5.824.876 se refieren a la identificación de genes de planta expresados específicamente en el sitio de alimentación de la planta o adyacentes a éste, luego de que el nematodo se ha sujetado a él. Los promotores de estos genes blanco de planta luego se pueden usar para dirigir la expresión específica de proteínas o enzimas perjudiciales, o la expresión de ARN antisentido al gen blanco o a genes celulares generales. Los promotores de planta también se pueden usar para conferir resistencia a los nematodos específicamente en el sitio de alimentación al transformar la planta con un constructo que comprende el promotor del gen blanco de planta ligado a un gen cuyo producto induce letalidad en el nematodo después de la ingestión.

Recientemente, se ha propuesto al ARN de interferencia (ARNi), también denominado silenciamiento génico, como método para controlar nematodos. Cuando se introduce ARN bicatenario (dsARN) correspondiente esencialmente a la secuencia de un gen blanco o mARN en una célula, se inhibe la expresión del gen blanco (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 6.506.559). La patente estadounidense No.6.506.559 demuestra la eficacia del ARNi contra genes conocidos en Caenorhabditis elegans, pero no demuestra la utilidad del ARNi para controlar los nematodos parásitos de planta.

Se propuso el uso de ARNi para dirigirse a genes de nematodos esenciales, por ejemplo, en la publicación de PCT 01/96584, WO 01/17654, US 2004/0098761 , US 2005/0091713, US 2005/0188438, US 2006/0037101 , US 2006/0080749, US 2007/0199100 y US 2007/0250947.

Se propusieron varios modelos para la acción del ARNi. En sistemas de mamíferos, los dsARN mayores a 30 nucleótidos desencadenan la inducción de la síntesis de interferón y la detención global de la síntesis de proteínas, en forma no específica de secuencia. Sin embargo, la patente estadounidense No. 6.506.559 describe que en los nematodos, la longitud del dsARN correspondiente a la secuencia de genes blanco puede ser de al menos 25, 50, 100, 200, 300 o 400 bases, y que también fueron eficaces dsARN aún más grandes para inducir el ARNi en C. elegans. Se sabe que cuando los constructos de ARN de horquillas que comprenden regiones bicatenarias que varían de 98 a 854 nucleótidos se transformaron en diversas especies de plantas, los genes blanco de planta se silenciaron eficazmente. Hay un acuerdo general de que en muchos organismos, incluso nematodos y plantas, se clivan grandes porciones de dsARN en fragmentos de alrededor de 19-24 nucleótidos (siARN) dentro de las células, y que estos siARN son los verdaderos mediadores del fenómeno ARNi.

Si bien hubo numerosos esfuerzos para usar ARNi en el control de nematodos parasitarios de plantas, hasta el momento no se ha desregularizado ninguna planta transgénica resistente a los nematodos en ningún país. En consecuencia, aun es necesario identificar composiciones y métodos seguros y eficaces para controlar nematodos parasitarios de plantas mediante el uso de ARNi, y para la producción de plantas que tienen mayor resistencia a nematodos parasitarios de plantas.

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN La presente invención provee ácidos nucleicos, plantas transgénicas y métodos para superar o aliviar la infestación por nematodos de cultivos agrícolas valiosos, tales como soja y papa. Los ácidos nucleicos de la invención son capaces de disminuir la expresión de los genes blanco de planta mediante el ARN de interferencia (ARNi). De acuerdo con la invención, el gen blanco vegetal se selecciona de un grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina (tipo LRK), un gen tipo pectina metilesterasa (tipo PME) y un gen NPY.

En una forma de realización, la invención provee un vector de expresión aislado que codifica un ARN bicatenario que comprende una primera cadena y una segunda cadena complementaria de la primera cadena, en donde la primera cadena es sustancialmente idéntica al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido vegetal seleccionado del grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY., en donde el ARN bicatenario inhibe la expresión del gen blanco.

La invención también se ilustra como un vector de expresión aislado que comprende un ácido nucleico que codifica múltiples moléculas de ARN bicatenario, en donde cada una comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de al menos 19, 20 o 21 nucleótidos, en donde una cadena de dicha región bicatenaria deriva de un polinucleótido blanco vegetal seleccionado del grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY de planta, en donde el ARN bicatenario inhibe la expresión del gen blanco.

En otra forma de realización, la invención provee una planta transgénica capaz de expresar al menos un dsARN que es sustancialmente idéntico al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un gen blanco vegetal seleccionado del grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY de planta, en donde el dsARN inhibe la expresión del gen blanco en la raíz de la planta.

La invención también abarca un método para producir una planta transgénica capaz de expresar un dsARN que comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica a una porción de un gen blanco vegetal y una segunda cadena complementaria de la primera cadena, en donde el gen blanco se selecciona del grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY de planta; dicho método comprende las siguientes etapas: (a) preparar un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el dsARN, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcripto bicatenario cuando se expresa en la planta; (b) transformar una planta receptora con dicho vector de expresión; (c) producir uno o más vástagos transgénicos de dicha planta receptora; y (d) seleccionar los vástagos con resistencia a la infección por nematodos.

La invención además provee un método para conferirle a una planta resistencia a los nematodos, en donde dicho método comprende las siguientes etapas: (a) seleccionar un gen blanco vegetal del grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY de planta; (b) preparar el vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un dsARN que comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica a una porción del gen blanco y una segunda cadena complementaria de la primera cadena, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcripto bicatenario luego de expresarse en la planta; (c) transformar una planta receptora con dicho ácido nucleico; (d) producir uno o más vástagos transgénicos de la planta receptora; y (e) seleccionar el vástago con resistencia a los nematodos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1 a-1 b muestran la tabla de SEQ ID NO asignados a las correspondientes secuencias de nucleótidos y aminoácidos de Glycine max y otras especies de plantas.

Las Figuras 2a-2c muestran el alineamiento de aminoácidos del marco de lectura abierto codificado por GmCLASPI (SEQ ID NO:2) con secuencias de aminoácidos de soja relacionadas descritas por identificadores de modelos de genes de soja Glyma03g32710.1 (SEQ ID NO:5), Glyma13g 19230.1 (SEQ ID NO: 7) y Glyma10g04850.1 (SEQ ID NO:9), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 10, penalidad por extensión de brecha= 0,05, penalidad por separación de brecha = 8).

La Figura 3 muestra el alineamiento de aminoácidos del marco de lectura abierto codificado por la subunidad delta de proteinasa Gmaspártica (SEQ ID NO:1 1 ) con secuencias de aminoácidos de soja relacionadas descritas por identificadores de modelos de genes de soja Glyma15g11670.1 (SEQ ID NO:14) y Glyma07g39240.1 (SEQ ID NO: 16), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 10, penalidad por extensión de brecha= 0,05, penalidad por separación de brecha = 8).

La Figura 4 muestra el alineamiento de aminoácidos del marco de lectura abierto codificado por la proteína 1 GmSecretada (SEQ ID NO: 18) con una secuencia de aminoácidos de soja relacionada descrita por la proteína 2 GmSecretada (SEQ ID NO:21) y el identificador de modelos de genes de soja Glyma20g26600.1 (SEQ ID NO: 23), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 10, penalidad por extensión de brecha= 0,05, penalidad por separación de brecha = 8).

La Figura 5 muestra el alineamiento de aminoácidos del marco de lectura abierto codificado por tipo receptor de quinasa GmLectina (SEQ ID NO:25) con una secuencia de aminoácidos de soja relacionada descrita por el identificador de modelos de genes de soja Glyma18g40290.1 (SEQ ID NO:28), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 10, penalidad por extensión de brecha= 0,05, penalidad por separación de brecha = 8).

La Figura 6 muestra el alineamiento de aminoácidos de tipo Gmpectina metilesterasa (SEQ ID NO:30) con una secuencia de aminoácidos de soja relacionada descrita por el identificador de modelos de genes de soja Glyma16g01650.1 (SEQ ID NO:33), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 10, penalidad por extensión de brecha= 0,05, penalidad por separación de brecha = 8).

La Figura 7 muestra el alineamiento de aminoácidos de GmNPYI del modelo de genes de soja Glyma05g22370.1 (SEQ ID NO: 35) con secuencias de aminoácidos de soja relacionadas GmNPY-tipo2 (SEQ ID NO: 38), GmNPY-tipo3 (SEQ ID NO: 40) y GmNPY-tipo4 del modelo de genes de soja Glyma17g 17470.1 (SEQ ID NO: 42), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 10, penalidad por extensión de brecha= 0,05, penalidad por separación de brecha = 8).

La Figura 8 muestra el alineamiento de aminoácidos de GmNPY-tipo5 (SEQ ID NO:44) con una secuencia de aminoácidos de soja relacionada GmNPY-tipo6 (SEQ ID N0:48), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 10, penalidad por extensión de brecha= 0,05, penalidad por separación de brecha = 8).

Las Figuras 9a-9j muestran el alineamiento de ADN de la secuencia del marco de lectura abierto de GmCLASPI (SEQ ID NO:1) con secuencias del marco de lectura abierto de modelos de genes de soja relacionados Glyma03g32710.1 (SEQ ID NO:4), Glyma13g19230.1 (SEQ ID NO: 6) y Glyma10g04850.1 (SEQ ID NO:8), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 15, penalidad por extensión de brecha= 6,66, penalidad por separación de brecha = 8). La horquilla generada por el vector binario RTP2593-3 con la cadena sentido descrita en SEQ ID NO:3 se puede dirigir a las correspondientes secuencias de ADN descritas en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO:8, como se muestra en el alineamiento.

Las Figuras 10a-10c muestran el alineamiento de ADN de la secuencia del marco de lectura abierto de proteinasa GmAspártica (SEQ ID NO: 10) con secuencias del marco de lectura abierto de modelos de genes de soja relacionados Glyma15g11670.1 (SEQ ID NO: 13) y Glyma07g39240.1 (SEQ ID NO: 15), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 15, penalidad por extensión de brecha= 6,66, penalidad por separación de brecha = 8). La horquilla generada por el vector binario RTP31 13-1 con la cadena sentido descrita en SEQ ID NO: 12 se puede dirigir a las correspondientes secuencias de ADN descritas por SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO: 15, como se muestra en el alineamiento.

Las Figuras 11 a-1 1 b muestran el alineamiento de ADN de la secuencia del marco de lectura abierto de proteína 1 GmSecretada (SEQ ID NO: 17) con secuencias del marco de lectura abierto del gen de soja relacionado proteína 2 GmSecretada (SEQ ID NO:20) y el modelo de genes Glyma20g26600.1 (SEQ ID NO: 22), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 15, penalidad por extensión de brecha= 6,66, penalidad por separación de brecha = 8). La horquilla generada por los vectores binarios RTP3923-4 y RTP3924-1 con la cadena sentido descrita en SEQ ID NO:19 se pueden dirigir a las correspondientes secuencias de ADN descritas por SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:22, como se muestra en el alineamiento.

Las Figuras 12a-12d muestran el alineamiento de ADN de la secuencia del marco de lectura abierto de tipo receptor de quinasa GmLectina (SEQ ID NO:24) con secuencias del marco de lectura abierto de modelos de genes de soja relacionados Glyma18g40290.1 (SEQ ID NO:27), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 15, penalidad por extensión de brecha= 6,66, penalidad por separación de brecha = 8). La horquilla generada por los vectores binarios RTP4279-1 y RTP4280-2 con la cadena sentido descrita en SEQ ID NO:26 se pueden dirigir a las correspondientes secuencias de ADN descritas por SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:27, como se muestra en el alineamiento.

Las Figuras 13a-13c muestran el alineamiento de ADN de la secuencia del marco de lectura abierto de tipo GmPectina metilesterasa (SEQ ID NO: 29) con la secuencia del marco de lectura abierto del modelo de genes de soja relacionados Glyma16g01650.1 (SEQ ID NO: 32) mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha = 15, penalidad por extensión de brecha = 6,66, penalidad por separación de brecha = 8). La horquilla generada por el vector binario RTP3856-4 con la cadena sentido descrita por SEQ ID NO: 31 se puede dirigir a las correspondientes secuencias de ADN descritas por SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:32, como se muestra en el alineamiento.

Las Figuras 14a-14d muestran el alineamiento de ADN de la secuencia del gen GmNPYI (SEQ ID NO: 34) con secuencias de genes de soja relacionados GmNPY-tipo2 (SEQ ID NO: 37), GmNPY-tipo3 (SEQ ID NO: 39) y GmNPY-tipo4, del modelo de genes de soja Glyma17g17470.1 (SEQ ID NO: 41 ), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 15, penalidad por extensión de brecha= 6,66, penalidad por separación de brecha = 8). La horquilla generada por los vectores binarios RTP2361-4 y RTP2362-1 con la cadena sentido descrita en SEQ ID NO:36 se puede dirigir a las correspondientes secuencias de ADN descritas por SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO:41 , como se muestra en el alineamiento.

Las Figuras 15a-15d muestran el alineamiento de ADN de GmNPY-tipo5 (SEQ ID NO: 43) con el gen de soja relacionado GmNPY-tipo6 (SEQ ID NO: 47) mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha = 15, penalidad por extensión de brecha = 6,66, penalidad por separación de brecha = 8). La horquilla generada por el vector binario RTP4082-1 con la cadena sentido descrita por SEQ ID NO: 45 y el vector binario RTP4083 con la cadena sentido descrita en SEQ ID NO:46 se pueden dirigir a las correspondientes secuencias de ADN descritas por SEQ ID NO:43 y SEQ ID NO:47, como se muestra en el alineamiento.

Las Figuras 16a-16p muestran el porcentaje de identidad global de secuencias GmCLASPI de ejemplo (Figura 16a, aminoácido; Figura 16b, nucleótido), secuencias de la subunidad delta de proteinasa GmAspártica (Figura 16c, aminoácido; Figura 16d, nucleótido), secuencias de la proteína 1 GmSecretada (Figura 16e, aminoácido; Figura 16f, nucleótido), secuencias tipo receptor de quinasa GmLectina (Figura 16g, aminoácido; Figura 16h, nucleótido), secuencias tipo GmPectina metilesterasa (Figura 16i, aminoácido; Figura 16j, nucleótido), secuencias GmNPYI (Figura 16k, aminoácido; Figura 161, nucleótido) y secuencias tipo GmNPY-tipo5 (Figura 16m, aminoácido; Figura 16n, nucleótido). Se calculó el porcentaje de identidad de alineamientos múltiples mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0. El porcentaje de identidad de nucleótidos se calculó de múltiples alineamientos de regiones codificantes previstas.

Las Figuras 17a-17c muestran el alineamiento de aminoácidos del gen GmCLASPI (SEQ ID NO:2) con homólogos relacionados de la soja Glyma03g32710.1 , Glyma13g19230.1 y Glyma10g04850.1 (SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente) y de la secuencia parcial StCLASP de la papa de GenBank EST BQ506533 (SEQ ID NO: 65), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 10, penalidad por extensión de brecha = 0,05, penalidad por separación de brecha = 8).

Las Figuras 8a- 8d muestran el alineamiento de aminoácidos del gen GmNPYI (SEQ ID NO:35) con homólogos relacionados de la soja GmNPY-tipo2, GmNPY-tipo3, GmNPY-tipo4, GmNPY-tipo5, GmNPY-tipo6 y GmNPY-tipo7 (SEQ ID NO:38, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID N0.48 y SEQ ID NO:50, respectivamente), del maíz ZmLOC 100280048 y ZM07MC01162_BFb0263J23 (SEQ ID NO:52 y SEQ ID NO:54, respectivamente), del arroz OsAK103674.1 , Os12g0583500 y Os09g0420900 (SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58 y SEQ ID NO:60, respectivamente) y del algodón TA26692_3635_Gh (SEQ ID NO:62) mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha = 10, penalidad por extensión de brecha = 0,05, penalidad por separación de brecha = 8).

Las Figuras 19a-19n muestran el alineamiento de nucleótidos de la secuencia del marco de lectura abierto del gen GmCLASPI (SEQ ID NO:1) con las secuencias del marco de lectura abierto de homólogos relacionados de la soja Glyma03g32710.1 , Glyma13g 19230.1 y Glyma10g04850.1 (SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO: 8, respectivamente) y el homólogo parcial de la papa StCLASP EST BQ506533 (SEQ ID NO: 63), mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha= 15, penalidad por extensión de brecha = 6,66, penalidad por separación de brecha = 8).

Las Figuras 20a-20l muestran el alineamiento de nucleótidos de la secuencia del marco de lectura abierto del gen GmNPYI (SEQ ID NO:34) con secuencias del marco de lectura abierto de homólogos relacionados de la soja del gen GmNPY-tipo2, GmNPY-tipo3, GmNPY-tipo4, GmNPY-tipo5, GmNPY-tipo6 y GmNPY-tipo7 (SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41 , SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:47 y SEQ ID NO.49, respectivamente), del maíz ZmLOC 100280048 y ZM07MC01 162_BFb0263J23 (SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:53, respectivamente), del arroz OsAK103674.1 , Os12g0583500 y Os09g0420900 (SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57 y SEQ ID NO:59, respectivamente) y del algodón TA26692_3635_Gh (SEQ ID NO:61 ) mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0 (penalidad por apertura de brecha = 15, penalidad por extensión de brecha = 6,66, penalidad por separación de brecha = 8).

Las Figuras 21a-21d muestran el porcentaje de identidad global de secuencias GmCLASPI de ejemplo (Figura 21a, aminoácido; Figura 21 b, nucleótido) y secuencias GmNPYI (Figura 21c, aminoácidos; Figura 21d, nucleótido). Se calculó el porcentaje de identidad de alineamientos múltiples mediante el uso del software suite Vector NTI v10.3.0. El porcentaje de identidad de nucleótidos se calculó de múltiples alineamientos de regiones codificantes previstas.

Las Figuras 22a-22aa muestran varios 21 meros posibles en SEQ ID NO:1 , 3, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31 , 32, 34, 36, 37, 39, 41 , 43, 45, 46, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63 o 65 por posición de nucleótidos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS La presente invención se puede comprender con mayor facilidad por referencia a la siguiente descripción detallada de las formas de realización preferidas de la invención y los ejemplos incluidos en la presente. A menos que se indique de otro modo, los términos usados en la en la presente se deben entender de acuerdo con el uso convencional que le adjudican los expertos en el arte pertinente Además de las definiciones de los términos provistos a continuación, las definiciones de los términos comunes en biología molecular también se pueden hallar en Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5 Ed., Berlín: Springer-Verlag; y en Current Protocols ¡n Molecular Biology, F.M. Ausubel ef al., Eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplemento de 1998). Se debe entender que, como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "una" pueden significar uno o más, según el contexto en el cual se usa. En consecuencia, por ejemplo, la referencia a "una célula" significa que se puede usar al menos una célula. Se debe entender que la terminología usada en la presente sólo tiene la finalidad de describir formas de realización específicas y no pretende ser limitante.

En la presente solicitud, se hace referencia a varias publicaciones. Las descripciones de todas estas publicaciones y las referencias citadas en dichas publicaciones se incorporan en su totalidad a la presente por referencia, a fin de describir más exhaustivamente el estado del arte al cual pertenece la presente invención. Las técnicas estándar para clonación, aislamiento de ADN, amplificación y purificación, para reacciones enzímáticas que incluyen ADN-ligasa, ADN-polimerasa, endonucleasas de restricción y similares, y diversas técnicas de separación son las que el experto en el arte conoce y usa habitualmente. Se describen numerosas técnicas estándar en Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Second Editíon, Cold Spring Harbor Laboratory, Plaínview, N.Y.; Maníatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plaínview, N.Y.; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101 ; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972 Experíments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Oíd and Primrose, 1981 Principies of Gene Manipularon, Uníversity of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, U ; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acíd Hybridízation, IRL Press, Oxford, UK; y Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principies and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York. Las abreviaciones y la nomenclatura, si se usan, se consideran estándar para esta área y de uso habitual en las publicaciones profesionales, tales como las citadas en la presente.

Como se usa en la presente, "ARNi" o "ARN de interferencia" se refiere al proceso de silenciamiento génico posterior a la transcripción específico de secuencia en plantas, mediado por ARN bicatenario (dsARN). Como se usa en la presente, "dsARN" se refiere a ARN que es parcial o completamente bicatenario. El ARN bicatenario también se denomina ARN de interferencia corto (siARN), ácido nucleico de interferencia corto (siARN), micro-ARN (miARN) y similares. En el proceso de ARNi, se introduce en una planta el dsARN que comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica a una porción de un gen blanco y una segunda cadena que es complementaria de la primera. Luego de la introducción en la planta, el dsARN específico de gen blanco es procesado en fragmentos relativamente pequeños (siARN) por una célula de planta que contiene la maquinaria de procesamiento de ARNi; esto da como resultado el silenciamiento del gen blanco.

Como se usa en la presente, si se toma en cuenta la sustitución de uracilo por tiamina cuando se comparan secuencias de ARN y ADN, el término "sustancialmente idéntica", como se aplica a dsARN, significa que la secuencia de nucleótidos de una cadena del dsARN es al menos alrededor de 80%-90% idéntica a 20 ó más nucleótidos contiguos del gen blanco, con mayor preferencia, al menos alrededor de 90-95% idéntica a 20 ó más nucleótidos contiguos del gen blanco y, con máxima preferencia, al menos alrededor de 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica o absolutamente idéntica a 20 ó más nucleótidos contiguos del gen blanco. 20 ó más nucleótidos significa una porción, que tiene al menos alrededor de 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 bases consecutivas o hasta la longitud completa del gen blanco.

Como se usa en la presente, polinucleótidos "complementarios" son aquellos capaces de formar pares de bases de acuerdo con las normas de complementariedad estándar de Watson-Crick. Específicamente, las purinas forman pares de bases con pirimidinas para formar una combinación de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada con tiamina (A:T) en el caso de ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. Se entiende que dos polinucleótidos se pueden hibridar entre sí, incluso si no son completamente complementarios entre sí, siempre que cada uno tenga al menos una región que sea sustancialmente complementaria con la otra. Como se usa en la presente, el término "sustancialmente complementaria" significa que dos secuencias de ácidos nucleicos son complementarias en al menos 80% de sus nucleótidos. Preferentemente, las dos secuencias de ácidos nucleicos son complementarias en al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus nucleótidos o en la totalidad de sus nucleótidos. De forma alternativa, "sustancialmente complementaria" significa que dos secuencias de ácidos nucleicos se pueden hibridar en condiciones de alta rigurosidad. Como se usa en la presente, el término "sustancialmente idéntica" o "correspondiente a" significa que dos secuencias de ácidos nucleicos tienen al menos 80% de identidad de secuencia. Preferentemente, las dos secuencias de ácidos nucleicos tienen al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia.

Como también se usan en la presente, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren a ARN o ADN que es lineal o ramificado, mono- o bicatenario, o un híbrido de éstos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Cuando se produce dsARN de forma sintética, también se pueden usar bases menos habituales, tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otros para formar pares antisentido, dsARN y ribozima. Por ejemplo, se demostró que los polinucleótidos que contienen análogos de C-5 propina de uridina y citidina se unen a ARN con alta afinidad y son inhibidores antisentido potentes de la expresión génica. También se pueden realizar otras modificaciones, tales como la modificación de la estructura fosfodiéster o 2'-hidroxi en el grupo de azúcar ribosa del ARN Como se usan en la presente, los términos "poner en contacto" y "administrar" se usan indistintamente y se refieren a un proceso por el cual el dsARN de la presente invención se transcribe en una planta a fin de inhibir la expresión de un gen blanco esencial en la planta. El dsARN se puede administrar de varias maneras que incluyen, sin limitación, la introducción directa en una célula (es decir, intracelularmente) o la introducción extracelular o en el sistema vascular de la planta; o el dsARN puede ser transcripto por la planta. Por ejemplo, se puede pulverizar el dsARN en una planta, o se puede aplicar el dsARN al suelo cerca de las raíces, absorbido por la planta, o se puede modificar genéticamente una planta para que exprese el dsARN que se dirige a un gen blanco de planta en una cantidad suficiente para matar o afectar de forma adversa alguno o todos los nematodos parasitarios a los cuales está expuesta la planta por el silenciamiento de dsARN (ARNi) del gen blanco de planta.

Como se usa en la presente, el término "control", cuando se usa en el contexto de una infección, se refiere a la reducción o prevención de una infección. La reducción o prevención de una infección por un nematodo hará que la planta tenga mayor resistencia a los nematodos; sin embargo, dicha mayor resistencia no significa que la planta necesariamente tenga 100% de resistencia a la infección. En formas de realización preferidas, la resistencia a la infección por un nematodo en una planta resistente es mayor a 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%, en comparación con una planta de tipo silvestre que no es resistente a los nematodos. Preferentemente, la planta de tipo silvestre es una planta de un genotipo similar, con mayor preferencia de un genotipo idéntico, al de la planta que tiene mayor resistencia a los nematodos, pero no comprende un dsARN que se dirige al gen blanco. La resistencia de la planta a la infección por nematodos se puede deber a muerte, esterilidad, detención del desarrollo o deterioro de la movilidad del nematodo cuando se lo expone al dsARN específico de un gen de planta que tiene cierto efecto en el desarrollo o mantenimiento del sitio de alimentación o en la capacidad general del sitio de alimentación en proveer nutrición al nematodo. Como se usa en la presente, el término "resistente a infección por nematodos" o "una planta que tiene resistencia a los nematodos" se refiere a la capacidad de una planta, en comparación con una planta de tipo silvestre, en evitar la infección por nematodos, matar nematodos o dificultar, reducir o detener el desarrollo, el crecimiento o la multiplicación de nematodos. Esto se puede lograr mediante un proceso activo, por ejemplo, al producir una sustancia perjudicial para el nematodo, o mediante un proceso pasivo, por ejemplo, tener un valor nutricional reducido para el nematodo o no desarrollar estructuras inducidas por el sitio de alimentación del nematodo, tal como células sincitiales o gigantes. El nivel de resistencia a los nematodos que tiene una planta se puede determinar de diversas maneras, por ejemplo, al contar los nematodos capaces de establecer parasitismo en esa planta, o al medir los tiempos de desarrollo de los nematodos, la proporción de nematodos machos y hembras o, en el caso de los nematodos del quiste, al contar la cantidad de quistes o huevos de nematodos producidos en las raíces de una planta infectada o sistema de ensayo de plantas.

El término "planta" pretende abarcar las plantas en cualquier etapa de maduración o desarrollo, así como cualquier tejido u órgano (partes de plantas) obtenidos o derivados de cualquiera de esas plantas, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Las partes de plantas incluyen, sin limitación, tallos, raíces, flores, óvulos, estambres, semillas, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejidos de callo, cultivos de anteras, gametofitos, esporofitos, polen, microesporas, protoplastos, cultivos raíces filamentosas y similares. La presente invención también incluye semillas producidas por las plantas de la presente invención. En una forma de realización, las semillas son de línea genéticamente pura para una mayor resistencia a la infección por nematodos, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la semilla de la planta. Como se usa en la presente, una "célula de planta" incluye, sin limitación, un protoplasto, una célula que produce gametos y a una célula que se regenera en una planta completa. Los cultivos de tejido de diversos tejidos de la planta y la regeneración de plantas a partir de ellos son conocidos en el arte y se publicaron extensamente.

Como se usa en la presente, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula de planta, callo, tejido de planta o parte de planta que contiene la totalidad o parte de al menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, la totalidad o parte del polinucleótido recombinante está integrado en forma estable en un cromosoma o elemento extracromosómico estable, de manera que sea transmitido a las generaciones sucesivas A los fines de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que fue alterado, reordenado o modificado por ingeniería genética Los ejemplos incluyen cualquier polinucleótido o polinucleótido clonado que se une o liga a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a alteraciones de polinucleótidos que son el resultado de eventos naturales, tales como mutaciones espontáneas, o de mutagénesis no espontánea seguida de reproducción selectiva.

Como se usa en la presente, el término "cantidad suficiente para inhibir la expresión" se refiere a una concentración o cantidad de dsARN que es suficiente para reducir los niveles o la estabilidad del mARN o proteina producida de un gen blanco en una planta. Como se usa en la presente, "inhibir la expresión" se refiere a la ausencia o disminución notable del nivel de proteína y/o producto de mARN de un gen blanco. La inhibición de la expresión del gen blanco de planta puede ser letal para el nematodo parasitario, o dicha inhibición puede demorar o impedir el comienzo de una etapa particular del desarrollo (por ejemplo, la metamorfosis), si la enfermedad de la planta se asocia con una etapa particular del ciclo de vida del nematodo parasitario. Las consecuencias de la inhibición se pueden confirmar mediante el análisis de las propiedades manifestadas del nematodo (como se indica más adelante en los ejemplos).

De acuerdo con la invención, una planta transcribe un dsARN, que inhibe específicamente la expresión de un gen blanco de planta que afecta el desarrollo del sitio de alimentación del nematodo, el mantenimiento del sitio de alimentación, la supervivencia del nematodo, la metamorfosis del nematodo o la reproducción del nematodo. En una forma de realización preferida, el dsARN es codificado por un vector de expresión que se transformó en un antecesor de la planta infectada. Con mayor preferencia, el vector de expresión comprende un ácido nucleico que codifica el dsARN bajo el control transcripcional de un promotor específico de raíz o de un promotor específico de la célula de alimentación inducida por nematodos parasitarios. Con máxima preferencia, el vector de expresión comprende un ácido nucleico que codifica el dsARN bajo el control transcripcional de un promotor específico de la célula de alimentación inducida por nematodos parasitarios.

En una forma de realización, el dsARN de la invención se dirige a un gen CLASP1 vegetal. Se demostró que los genes CLASP, PROTEÍNA ASOCIADA A CLIP, en plantas participan en la estabilidad microtubular y, por ello, están involucradas en varias funciones celulares, tales como división y expansión celular, movimiento de las organelas y trafico intracelular. Como se indica en el Ejemplo 1 , se aisló el gen GmCLASPI de G. max de longitud completa y se representa en SEQ ID NO: 1 La secuencia de genes GmCLASPI de G. max descrita en SEQ ID NO:1 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO.2. Como se describe en el Ejemplo 6, se usó la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:2 para identificar la secuencia de aminoácidos homologa CLASP de papa, StCLASP BQ506533. La correspondiente secuencia de aminoácidos homologa se indica en SEQ ID NO:64. El alineamiento de aminoácidos de las secuencias proteicas CLASP representativas, o los fragmentos de las secuencias, se indican en SEQ ID NO:2, 5, 7, 9 y 64 y se muestran en las Figuras 17a-c. Los genes CLASP1 vegetales de ejemplo que son el blanco del dsARN de esta forma de realización incluyen genes que tienen secuencias indicadas en SEQ ID NO:1 , 3, 4, 6, 8, 63 o 65; genes CLASP1 vegetales que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 , 3, 4, 6, 8, 63 o 65; y genes CLASP1 vegetales que se hibridan en condiciones rigurosas con la secuencia indicada en SEQ ID NO:1 , 3, 4, 6, 8, 63 o 65.

De acuerdo con esta forma de realización, el dsARN codificado por el vector de expresión de la invención comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un gen blanco CLASP1 de un genoma vegetal y una segunda cadena que es sustancialmente complementaria de la primera cadena. Preferentemente, la primera cadena de dsARN de CLASP1 comprende al menos 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido CLASP1 vegetal seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:1 , 3, 4, 6, 8, 63 o 65; (b) un polinucleótido CLASP1 vegetal que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 , 3, 4, 6, 8, 63 o 65; y (c) un polinucleótido CLASP1 vegetal que se híbrida en condiciones rigurosas con el polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:1 , 3, 4, 6, 8, 63 o 65.

En otra forma de realización, el dsARN de la invención se dirige a un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica vegetal. Los genes de la subunidad delta de proteinasa aspártica se localizan en vacuolas de células vegetales y participan en la degradación de las proteínas. Como se indica en el Ejemplo 1 , se aisló el gen de la subunidad delta de proteinasa GmAspártica de G. max de longitud completa y se representa en SEQ ID NO: 10. Los ejemplos de genes de la subunidad delta de proteinasa aspártica vegetal que son el blanco del dsARN de esta forma de realización incluyen genes que tienen secuencias indicadas en SEQ ID NO: 10, 12, 13 o 15; genes de la subunidad delta de proteinasa aspártica vegetal que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 10, 12, 13 o 15; y genes de la subunidad delta de proteinasa aspártica vegetal que se hibridan en condiciones rigurosas con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 10, 12, 13 o 15.

De acuerdo con esta forma de realización, el dsARN codificado por el vector de expresión de la invención comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un gen blanco de la subunidad delta de proteinasa aspártica de un genoma vegetal y una segunda cadena que es sustancialmente complementaria de la primera cadena. Preferentemente, la primera cadena de dsARN de la subunidad delta de proteinasa aspártica comprende al menos 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido de la subunidad delta de proteinasa aspártica vegetal seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 10, 12, 13 o 15; (b) un polinucleótido de la subunidad delta de proteinasa aspártica vegetal que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:10, 12, 13 o 15; y (c) un polinucleótido de la subunidad delta de proteinasa aspártica vegetal que se híbrida en condiciones rigurosas con el polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:10, 12, 13 o 15.

En otra forma de realización, el dsARN de la invención se dirige a un gen de la proteína 1 secretada vegetal. Los genes de las proteínas secretadas contienen un motivo proteico secretor básico y, en general, se desconoce su función en las plantas, aunque algunas proteínas secretoras pueden participar en la respuesta de defensa de la planta. Como se indica en el Ejemplo 1 , se aisló el gen de la proteína 1 GmSecretada de G. max de longitud completa y se representa en SEQ ID NO: 17. Los ejemplos de genes de la proteína 1 secretada vegetal que son el blanco del dsARN de esta forma de realización incluyen genes que tienen secuencias indicadas en SEQ ID NO: 17, 19, 20 o 22; genes de la proteína 1 secretada vegetal que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:17, 19, 20 o 22; y genes de la proteína 1 secretada vegetal que se hibridan en condiciones rigurosas con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 17, 19, 20 o 22.

De acuerdo con esta forma de realización, el dsARN codificado por el vector de expresión de la invención comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un gen blanco de la proteína 1 secretada de un genoma vegetal y una segunda cadena que es sustancialmente complementaria de la primera cadena. Preferentemente, la primera cadena de dsARN de la proteína 1 secretada comprende al menos 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido de la proteína 1 secretada vegetal seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 17, 19, 20 o 22; (b) un polinucleótido de la proteína 1 secretada vegetal que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:17, 19, 20 o 22; y (c) un polinucleótido de la proteína 1 secretada vegetal que se híbrida en condiciones rigurosas con el polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 17, 19, 20 o 22.

En otra forma de realización, el dsARN de la invención se dirige a un gen tipo receptor de quinasa lectina vegetal. Los genes tipo receptores de quinasa lectina contienen motivos de lectina extracelulares y un dominio de quinasa y pueden participar en varios procesos vegetales, que incluyen crecimiento, desarrollo y respuesta a los estímulos. Como se indica en el Ejemplo 1 , se aisló el gen tipo receptor de quinasa GmLectina de G. max de longitud completa y se representa en SEQ ID NO: 24. Los ejemplos de genes tipo receptores de quinasa lectina que son el blanco del dsARN de esta forma de realización incluyen las secuencias indicadas en SEQ ID NO:24, 26 o 27; genes tipo receptores de quinasa lectina vegetal que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:24, 26 o 27; y genes tipo receptores de quinasa lectina vegetal que se hibridan en condiciones rigurosas con la secuencia indicada en SEQ ID NO:24, 26 o 27.

De acuerdo con esta forma de realización, el dsARN codificado por el vector de expresión de la invención comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un gen blanco tipo receptor de quinasa lectina de un genoma vegetal. Preferentemente, la primera cadena de dsARN del receptor de quinasa lectina comprende al menos 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido tipo receptor de quinasa lectina vegetal seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID N0.24, 26 o 27; (b) un polinucleótido tipo receptor de quinasa lectina vegetal que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:24, 26 o 27; y (c) un polinucleótido tipo receptor de quinasa lectina vegetal que se híbrida en condiciones rigurosas con el polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 24, 26 o 27.

En otra forma de realización, el dsARN de la invención se dirige a un gen tipo pectina metilesterasa vegetal. Como se indica en el Ejemplo 1 , se aisló el gen tipo pectina metilesterasa de G. max de longitud completa y se representa en SEQ ID NO: 29. Los ejemplos de genes tipo receptores de quinasa lectina vegetales que son el blanco del dsARN de esta forma de realización incluyen las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 29, 31 o 32; los genes tipo receptores de quinasa lectina vegetales que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 29, 31 o 32; y genes tipo receptores de quinasa lectina vegetales que se hibridan en condiciones rigurosas con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 29, 31 o 32.

De acuerdo con esta forma de realización, el dsARN codificado por el vector de expresión de la invención comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un gen blanco tipo pectina metilesterasa de un genoma vegetal y una segunda cadena que es sustancialmente complementaria de la primera cadena. Preferentemente, la primera cadena de dsARN de la pectina metilesterasa comprende al menos 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 29, 31 o 32; (b) un polinucleótido tipo pectina metilesterasa vegetal que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 29, 31 o 32; y (c) un polinucleótido tipo pectina metilesterasa vegetal que se híbrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 29, 31 o 32.

En otra forma de realización, el dsARN se dirige a un gen NPY vegetal. Los genes NPY pertenecen a una familia génica que participa en la localización del PIN en la célula vegetal que realiza la respuesta a auxina y la localización. GmNPYI (SEQ ID NO:34), GmNPY-tipo2 (SEQ ID NO:37), GmNPY-tipo3 (SEQ ID NO:39), GmNPY-tipo4 (SEQ ID NO:41), GmNPY-tipo5 (SEQ ID NO:43), GmNPY-tipo6 (SEQ ID NO:47) y GmNPY-tipo7 (SEQ ID NO:49) pertenecen a la familia de genes NPY (Naked Pins in Yuc Mutants), que incluye NPY1 (At4g31820) de Arabidopsis thaliana. Los genes de esta familia contienen un dominio de interacción entre proteínas BTB/POZ (pfam00651) y un dominio NPH3 (pfam03000). Como se indica en el Ejemplo 1 , se aisló el gen GmNPYI de G. max de longitud completa y se representa en SEQ ID NO: 34 La secuencia de genes GmNPYI de G. max descrita en SEQ ID NO:34 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:35. La secuencia de genes GmNPY-tipo5 de G. max descrita en SEQ ID NO:43 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:44. Como se muestra en el Ejemplo 6, las secuencias de aminoácidos descritas por SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:44 se usaron para identificar secuencias de aminoácidos NPY homologas de la soja, GmNPY-tipo7, del maíz, ZmLOC 100280048 y ZM07MC01162_BFb0263J23, del arroz, OsAK103674.1 , Os12g0583500 y Os09g0420900, y algodón, TA26692_3635_Gh. Las correspondientes secuencias de aminoácidos homologas se indican en SEQ ID NO:50, 52, 54, 56, 58, 60 y 62. El alineamiento de aminoácidos de secuencias de proteínas NPY representativas, o los fragmentos de secuencias, indicadas en SEQ ID NO:35, 38, 40, 42, 44, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 y 62 se muestran en las Figuras 18a-d. Las correspondientes secuencias de ADN de NPY homologas, o los fragmentos de secuencias, se describen en SEQ ID NO:49, 51 , 53, 55, 57, 59 y 61. El alineamiento de secuencias de ADN de los genes NPY representativos descritos por SEQ ID NO:34 a SEQ ID NO: 36, 37, 39, 41 , 43, 45, 46, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59 y 61 se muestra en la Figura 20a-l. Los ejemplos de genes NPY1 que son el blanco del dsARN de esta forma de realización incluyen las secuencias indicadas en SEQ ID NO:34, 36, 37, 39, 41 , 43, 45, 46, 47, 52, 54, 56, 58, 60 o 62; genes de NPY vegetales que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:34, 36, 37, 39, 41 , 43, 45, 46, 47, 52, 54, 56, 58, 60 o 62; y genes NPY vegetales que se hibridan en condiciones rigurosas con la secuencia indicada en SEQ ID NO:34, 36, 37, 39, 41 , 43, 45, 46, 47, 52, 54, 56, 58, 60 o 62.

De acuerdo con esta forma de realización, el dsARN codificado por el vector de expresión de la invención comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un gen blanco NPY1 de un genoma vegetal y una segunda cadena que es sustancialmente complementaria de la primera cadena. Preferentemente, la primera cadena de dsARN de NPY comprende al menos 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido NPY vegetal seleccionado del grupo que consiste en: (a) un poiinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 34, 36, 37, 39, 41, 43, 45, 46, 47, 52, 54, 56, 58, 60 o 62; (b) un poiinucleótido NPY vegetal que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 34, 36, 37, 39, 41 , 43, 45, 46, 47, 52, 54, 56, 58, 60 o 62; y (c) un poiinucleótido NPY vegetal que se híbrida en condiciones rigurosas con el poiinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 34, 36, 37, 39, 41 , 43, 45, 46, 47, 52, 54, 56, 58, 60 o 62.

Se pueden aislar otros cADN correspondientes a los genes blanco vegetales de la invención de plantas que no sean G. max con la información provista en la presente y las técnicas conocidas por los expertos en el arte de la biotecnología. Por ejemplo, se puede aislar una molécula de ácido nucleico de una planta que se híbrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 , 3, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31 , 32, 34, 36, 37, 39, 41 , 43, 45, 46 o 47 de bibliotecas de cADN de plantas. Como se usa en la presente con respecto a la hibridación de ADN en un blot de ADN, el término "condiciones rigurosas" se refiere a la hibridación durante la noche a 60°C en solución de Denhart 10X, 6X SSC, 0,5% de SDS y 100 µ?/??? de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los blots se lavan secuencialmente a 62°C durante 30 minutos cada vez en 3X SSC/0,1% de SDS, seguido de 1X SSC/0,1% de SDS y, finalmente, 0,1X SSC/0,1% de SDS. Como también se usa en la presente, en una forma de realización preferida, la frase "condiciones rigurosas" se refiere a la hibridación en una solución 6X SSC a 65°C. En otra forma de realización, "condiciones altamente rigurosas" se refiere a la hibridación durante la noche a 65°C en solución de Denhart 10X, 6X SSC, 0,5% de SDS y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los blots se lavan secuencialmente a 65°C durante 30 minutos cada vez en 3X SSC/0,1% de SDS, seguido de 1X SSC/0,1% de SDS y, finalmente, 0.1X SSC/0,1% de SDS. Los métodos para la hibridación de ácidos nucleicos se describen en Meinkoth and Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138:267-284; y son muy conocidos en el arte. Alternativamente, se puede aislar mARN de células de plantas, y se puede preparar cADN mediante el uso de transcriptasa inversa Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación de la reacción en cadena de polimerasa se pueden diseñar sobre la base de la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:1 , 3, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31 , 32, 34, 36, 37, 39, 41 , 43, 45, 46 o 47. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a los genes blanco de planta de la invención se pueden amplificar mediante cADN o, alternativamente, ADN genómico, como plantilla, y cebadores adecuados de oligonucleótidos de acuerdo con las técnicas estándar de amplificación por PCR. Las moléculas de ácido nucleico amplificadas de esta manera se pueden clonar en vectores adecuados y caracterizar mediante análisis de secuencia de ADN.

Como se analizó con anterioridad, los fragmentos de dsARN mayores a alrededor de 19-24 nucleótidos de longitud se clivan intracelularmente por nematodos y plantas en siARN de alrededor de 19-24 nucleótidos de longitud, y estos siARN son los verdaderos mediadores del fenómeno ARNL La tabla de las Figuras 22a-aa provee ejemplos de 21-meros del gen CLASP1 de la soja, SEQ ID NO:1 , gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, SEQ ID NO:10, gen de la proteína 1 secretada SEQ ID NO:17, gen tipo receptor de quinasa lectina, SEQ ID NO:24, gen tipo pectina metilesterasa, SEQ ID NO:29, gen NPY1 , SEQ ID NO:34, y gen NPY-tipo5, SEQ ID NO:43 y sus respectivos fragmentos y homólogos, como se indica en los SEQ ID NO de la tabla. Esta tabla también se puede usar para calcular los 19, 20, 22, 23 o 24-meros mediante la adición o sustracción de la cantidad adecuada de nucleótidos de cada 21 mero.

El vector de expresión de la invención codifica al menos un dsARN que puede variar en longitud de alrededor de 19 nucleótidos a alrededor de 200 nucleótidos consecutivos o hasta la longitud total del gen blanco. El dsARN codificado por el vector de expresión de la invención puede tener la forma de un miARN que se dirige a un único sitio correspondiente a una porción del gen blanco que comprende 19, 20 ó 21 nucleótidos consecutivos de éste. Alternativamente, el dsARN codificado por el vector de expresión de la invención tiene una longitud de alrededor de 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos a alrededor de 200 nucleótidos consecutivos del gen blanco. En otra forma de realización, el dsARN codificado por el vector de expresión de la invención tiene una longitud de alrededor de 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos a alrededor de 400 nucleótidos consecutivos, o de alrededor de 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos a alrededor de 600 nucleótidos consecutivos del gen blanco.

Como se describe en la presente, no se requiere 100% de identidad de secuencia entre el dsARN y el gen blanco para poner en práctica la presente invención. Preferentemente, el dsARN de la invención comprende una porción de 19 nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una porción de 19 nucleótidos contiguos del gen blanco. Si bien para la inhibición se prefiere un dsARN que comprenda una secuencia de nucleótidos idéntica a una porción de los genes blanco de plantas, la invención puede tolerar variaciones de secuencias en el dsARN que podrían preverse debido a la manipulación o síntesis génica, mutación genética, polimorfismo de cepas o divergencia evolutiva. En consecuencia, los dsARN de la invención también incluyen dsARN que comprenden una falta de coincidencia con el gen blanco de al menos 1 , 2 o más nucleótidos. Por ejemplo, se contempla en la presente invención que las secuencias de dsARN de 21 meros ejemplificadas en las Figuras 22a - 22aa pueden contener una adición, eliminación o sustitución de 1 , 2 o más nucleótidos, siempre que la secuencia resultante aún interfiera con la función de los genes blanco de planta.

La identidad de secuencia entre los dsARN de la invención y los genes blanco de planta se puede optimizar mediante la comparación de secuencias y los algoritmos de alineamiento conocidos en el arte (véase Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991 , y las referencias allí citadas) y calcular la diferencia porcentual entre las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, por el algoritmo de Smith-Waterman implementado en el programa de software BESTFIT mediante el uso de parámetros predeterminados (por ejemplo, University de Wisconsin Genetic Computing Group). Se prefiere más de 80 % de identidad de secuencia, 90% de identidad de secuencia, o incluso 100% de identidad de secuencia entre el ARN inhibidor y al menos 19 nucleótidos contiguos del gen blanco.

Debido a que múltiples enzimas Dicers especializadas en plantas generan siARN cuyo tamaño generalmente varía de 19nt a 24nt (véase Henderson et al., 2006. Nature Genetics 38:721-725.), los siARN codificados por el vector de expresión de la presente invención pueden variar de secuencias de alrededor de 19 nucleótidos contiguos a secuencias de alrededor de 24 nucleótidos contiguos a lo largo de la longitud de un gen blanco. Por lo tanto, cuando el dsARN codificado por el vector de expresión de la invención tiene una longitud mayor de alrededor de 21 nucleótidos, por ejemplo, de alrededor de 50 nucleótidos a alrededor de 1000 nucleótidos, se clivará aleatoriamente en siARN de 19-24 nucleótidos dentro de la célula vegetal. El clivaje de un dsARN más largo de la invención generará un pool que comprende múltiples siARN derivados del dsARN más largo. Por ejemplo, un pool de siARN producido por el vector de expresión de la invención derivado de los genes blanco de G. max descritos en la presente pueden comprender múltiples moléculas de siARN que se seleccionan del grupo que consiste en nucleótidos sustancialmente idénticos con cualquier 19mero, 20mero, 21 mero, 22meor, 23mero o 24mero derivados de SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID N0:41 , SEQ ID N0.43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60 o SEQ ID NO:62, SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 65, como se describe en las Figuras 22a - 22aa. Alternativamente, el pool de siARN codificado por el vector de expresión de la invención puede comprender múltiples moléculas de ARN que tienen una combinación de cualquiera de las secuencias de 19, 20, 21 , 22, 23 y/o 24 nucleótidos contiguos derivados de SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41 , SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60 o SEQ ID NO:62.

Por lo tanto, la invención también se ilustra como un vector de expresión aislado que comprende un ácido nucleico que codifica múltiples moléculas de ARN bicatenario, en donde cada una comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de al menos 19, 20 o 21 nucleótidos, en donde una cadena de dicha región bicatenaria deriva de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 65; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:22; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:27; (e) un polinucleótido que comprende una secuencia como se indica en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:32¡ (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41 , SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60 o SEQ ID NO:62.

El dsARN de la invención puede comprender, opcionalmente, una saliente monocatenaria en uno o ambos extremos. Preferentemente, la saliente monocatenaria comprende al menos dos nucleótidos en el extremo 3' de cada cadena de la molécula de dsARN. La estructura bicatenaria se puede formar mediante una única cadena de ARN autocomplementaria (es decir, que forma un bucle de horquilla) o dos cadenas de ARN complementarias. La formación de dobletes de ARN se puede iniciar dentro o fuera de la célula. Cuando el dsARN de la invención forma un bucle de horquilla, opcionalmente puede comprender un intrón, como se indica en US 2003/0180945A1 , o un espaciador de nucleótidos, que es un fragmento de la secuencia entre las cadenas de ARN complementarias para estabilizar el transgén de horquilla en las células.. Los métodos para obtener varias moléculas de dsARN se indican, por ejemplo, en WO 99/53050 y en la patente estadounidense No. 6.506.559. El ARN se puede introducir en una cantidad que permita suministrar al menos una copia por célula. Dosis más altas de material bicatenario pueden producir una inhibición más eficaz.

El vector de expresión aislado de la invención comprende un polinucleótido que codifica una molécula de dsARN, como se describió con anterioridad, en donde la expresión del vector en una célula huésped vegetal da como resultado mayor resistencia a los nematodos parasitarios, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped vegetal. Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que estaba ligada. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden unir segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula vegetal huésped en la que se introducen. Otros vectores se integran en el genoma de una célula vegetal huésped luego de la introducción en la célula huésped y, de este modo, se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se ligan operativamente. En la presente, dichos vectores se denominan "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante tienen forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar de manera indistinta ya que el plásmido es la forma de vector más usada. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, virus X de la papa, virus cascabel del tabaco y virus Gemini), que tienen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión aislados de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped vegetal; esto significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, por ejemplo, promotores, seleccionadas sobre la base de las células huésped vegetales que se usarán para la expresión, que se ligan operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que se desea expresar. Como se usan en la presente, los términos "ligado operativamente" y "en asociación operativa" son intercambiables y significan que la secuencia de nucleótidos de interés se liga a las secuencia(s) reguladora(s) de una manera tal que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en una célula huésped vegetal cuando se introduce el vector en la célula huésped vegetal). El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, mejoradores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber and Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108, CRC Press: Boca Ratón, Florida y similares. Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en varios tipos de células huésped y las que dirigen la expresión directa de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células huésped o en ciertas condiciones. Los expertos en el arte notarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores, tales como la elección de la célula huésped que se desea transformar, el nivel de expresión de dsARN deseado y similares. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células huésped vegetales para así producir moléculas de dsARN de la invención codificadas por los ácidos nucleicos descritos en la presente.

De acuerdo con la invención, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia reguladora ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos que es un molde para una o ambas cadenas de las moléculas de dsARN de la invención. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico también comprende un promotor que flanquea alguno de los extremos de la molécula de ácido nucleico, en donde los promotores dirigen la expresión de cada cadena de ADN, para así generar dos ARN complementarios que se hibridan y forman el dsARN. En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que se transcribe en ambas cadenas del dsARN en una unidad de transcripción, en donde la cadena sentido se transcribe desde el extremo 5' de la unidad de transcripción y la cadena antisentido se transcribe desde el extremo 3', y las dos cadenas están separadas por 3 a 500 pares de bases o más, y en donde después de la transcripción, el transcripto de ARN se pliega sobre sí mismo para formar una horquilla De acuerdo con la invención, la región espadadora del transcripto de horquilla puede ser cualquier fragmento de ADN.

De acuerdo con la presente invención, el polinucleótido introducido se puede mantener en forma estable en la célula vegetal, si se incorpora en un replicón autónomo no cromosómico o se integra en los cromosomas de las plantas. Alternativamente, el polinucleótido introducido puede estar presente en un vector extracromosómico no replicante y se puede expresar o estar activo en forma transitoria. Ya sea que esté presente en un vector extracromosómico no replicante o en un vector que está integrado en un cromosoma, el polinucleótido reside, preferentemente, en un cásete de expresión de planta. Preferentemente, un cásete de expresión vegetal contiene secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión génica en células vegetales que están ligadas operativamente, de manera que cada secuencia pueda cumplir con su función, por ejemplo, la terminación de la transcripción de las señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son las que derivan de t-ADN de Agrobacteríum tumefaciens, tales como el gen 3 conocido como octopina sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) o sus equivalentes funcionales, pero también son adecuados todos los otros terminadores funcionalmente activos en plantas. Debido a que frecuentemente la expresión génica en plantas no está limitada en los niveles de transcripción, un cásete de expresión vegetal contiene, preferentemente, otras secuencias ligadas operativamente, tales como mejoradores de la traducción, tales como la secuencia overdríve que contiene la secuencia guía 5' no traducida proveniente del virus del mosaico del tabaco que mejora la relación entre polipéptido y ARN (Gallie et al., 1987, Nucí. Acids Research 15:8693-8711). Los ejemplos de vectores de expresión vegetal incluyen los que se detallan en: Becker, D. et al., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucí. Acid. Res. 12:8711-8721 ; y Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

La expresión de genes vegetales se debe ligar operativamente a un promotor apropiado que confiere expresión génica en un momento preferido, en un lugar preferido, en un tipo de célula preferida y/o en un tejido preferido. Los promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen cualquier promotor capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal presente en las raíces de la planta. Dichos promotores incluyen, sin limitación, los que se pueden obtener de plantas, virus y bacterias vegetales que contienen genes que se expresan en plantas, tales como Agrobacterium y Rhizobium. Preferentemente, el cásete de expresión de la invención comprende un promotor específico de raíz, un promotor inducible por patógenos o un promotor inducible por nematodos. Con mayor preferencia, el promotor inducible por nematodos es un promotor específico del sitio que se alimenta de los nematodos parasitarios. Un promotor específico del sitio de alimentación de los nematodos parasitarios puede ser específico de células sincitiales o células gigantes o específico de ambos tipos de células. Un promotor es inducible, si su actividad, medida sobre la cantidad de ARN producido bajo el control del promotor, es al menos 30%, 40%, 50%, preferentemente, al menos 60%, 70%, 80%, 90%, con mayor preferencia, al menos 100%, 200%, 300% mayor en el estado inducido que en el estado no inducido. Un promotor es específico de célula, tejido u órgano, sí su actividad, medida sobre la cantidad de ARN producido bajo el control del promotor, es al menos 30%, 40%, 50%, preferentemente, al menos 60%, 70%, 80%, 90%, con mayor preferencia, al menos 100%, 200%, 300% mayor en un tipo de célula, tejido u órgano particular que en otros tipos de células o tejidos de la misma planta, preferentemente, los otros tipos de células o tejidos son tipos de células o tejidos del mismo órgano vegetal, por ejemplo, una raíz. En el caso de los promotores específicos de órgano, la actividad del promotor se debe comparar con la actividad del promotor en otros órganos vegetales, por ejemplo, hojas, tallos, flores o semillas.

El promotor puede ser constitutivo, inducible, preferido de una etapa del desarrollo, preferido de un tipo de célula, preferido de tejido o preferido de órgano. Los promotores constitutivos son activos en la mayoría de las condiciones. Los ejemplos no limitantes de promotores constitutivos incluyen los promotores CaMV 19S y 35S (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), el promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302), el promotor Sep1 , el promotor de actina del arroz (McEIroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171), el promotor de actina de Arabidopsis, el promotor de ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu (Last et al., 1991 , Theor. solicitudes Genet. 81 :581-588), el promotor 35S del virus del mosaico de la higuera, el promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723-2730), el promotor GRP1-8, el promotor de cinamil alcohol deshidrogenasa (patente estadounidense No. 5.683.439), promotores de T-ADN de Agrobacterium, tales como manopina sintasa, nopalina sintasa y octopina sintasa, el promotor de la subunidad pequeña de ribulosa bifosfato carboxilasa (ssuRUBISCO) y similares. Se prefieren los promotores que expresan el dsARN en una célula que entra en contacto con nematodos parasitarios. Alternativamente, el promotor puede dirigir la expresión del dsARN en un tejido de planta alejado del sitio de contacto con el nematodo, y el dsARN luego puede ser transportado por la planta hasta la célula que está en contacto con el nematodo parasitario, en particular, células del sitio de alimentación de los nematodos o cercanas a éste, por ejemplo, células sincitiales o gigantes.

Los promotores inducibles son activos en ciertas condiciones ambientales, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frío, luz, ataque de patógenos, condiciones anaeróbicas y similares. Por ejemplo, se demostró que los promotores TobRB7, AtRPE, AtPykIO, Gemini19 y AtHMGI son inducidos por nematodos (para una reseña de promotores inducibles por nematodos, véase Ann. Rev. Phytopathol. (2002) 40:191-219; véase también la patente estadounidense No. 6.593.513). Un método para aislar promotores adicionales, que son inducibles por nematodos, se indica en las patentes estadounidenses Nos. 5.589.622 y 5.824.876. Otros promotores inducibles incluyen el promotor hsp80 de Brassica es inducible por shock de calor; el promotor PPDK es inducido por la luz; el promotor PR-1 del tabaco, Arabidopsis, y el maíz son inducibles por infección con un patógeno; y el promotor Adh1 es inducido por hipoxia y estrés por frío. La expresión génica en plantas también se puede facilitar mediante un promotor inducible (para una reseña, véase Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Los promotores inducibles químicamente son especialmente adecuados si se desea la expresión génica en un momento específico. Los ejemplos no limitantes de esos promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (solicitud PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al., 1992, Plant J. 2:397-404) y un promotor inducible por etanol (solicitud PCT No. WO 93/21334).

Los promotores preferidos de la etapa del desarrollo se expresan, preferentemente, en ciertas etapas del desarrollo. Los promotores preferidos de tejidos y órganos incluyen los que se expresan, preferentemente, en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas o xilema. Los ejemplos de promotores preferidos de tejido y órgano incluyen, pero sin limitación promotores preferidos de fruta, preferidos de óvulo, preferidos de tejido masculino, preferidos de semilla, preferidos de integumento, preferidos de tubérculo, preferidos de tallo, preferidos de pericarpio y preferidos de hoja, preferidos de estigma, preferidos de polen, preferidos de antera, preferidos de pétalo, preferidos de sépalo, preferidos de pedicelo, preferidos de silicua, preferidos de tallo, preferidos de raíz y similares. Los promotores preferidos de semilla con preferencia se expresan durante el desarrollo y/o germinación de la semilla. Por ejemplo, los promotores preferidos de semilla pueden ser preferidos de embrión, preferidos de endosperma y preferidos de recubrimiento de semilla. Véase Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Los ejemplos de promotores preferidos de semilla incluyen, pero sin limitación, celulosa sintasa (celA), Cim1 , zeína gama, globulina-1 , zeína de 19 kD de maíz (cZ19B1 ) y similares.

Otros promotores adecuados preferidos de tejido y preferidos de órgano incluyen, pero sin limitación, el promotor del gen napina de la colza (patente estadounidense No. 5.608.152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 , Mol Gen Genet. 225(3):459-67), el promotor de oleosina de Arabidopsis (solicitud PCT No. WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (patente estadounidense No. 5.504.200), el promotor Bce4 de Brassica (solicitud PCT No. WO 91/13980) o el promotor B4 de legúmina (LeB4¡ Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), así como promotores que confieren expresión específica de semilla en plantas monocotiledóneas, tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores adecuados para tener en cuenta son el promotor del gen Ipt2 o Ipt1 de la cebada (solicitud PCT No. WO 95/15389 y solicitud PCT No. WO 95/23230) o los descritos en la solicitud PCT No. WO 99/16890 (promotores del gen de hordeína de la cebada, gen de glutelina del arroz, gen de orizina del arroz, gen de prolamina del arroz, gen de gliadina del trigo, gen de glutelina del trigo, gen de glutelina de la avena, gen de kasirina del sorgo y gen secalina del centeno).

Otros promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen pero sin limitación, promotor principal de la proteína de unión a clorofila a/b, promotores de histona, el promotor Ap3, el promotor de ß-conglicina, el promotor de napina, el promotor de lectina de soja, el promotor de zeína de maíz de 15kD, el promotor de zeína de 22kD, el promotor de zeína de 27kD, el promotor de g-zeína, los promotores waxy, shrunken 1 , shrunken 2 y bronze, el promotor de Zm13 (patente estadounidense. Nro. 5.086.169), los promotores de poligalacturonasa (PG) de maíz (patentes estadounidenses. Nros 5.412.085 y 5.545.546) y el promotor SGB6 (patente U.S. Nro. 5.470.359), así como promotores sintéticos u otros promotores naturales.

Son de particular utilidad en la presente invención los promotores preferidos de sitios sincitiales o inducidos por el sitio de alimentación de los nematodos, que incluyen, sin limitación, promotores del promotor tipo tn3 descrito en el documento copendiente de propiedad conjunta WO 2008/095887, el promotor tipo Mtn21 descrito en el documento copendiente de propiedad conjunta WO 2007/096275, el promotor tipo peroxidasa descrito en el documento copendiente de propiedad conjunta WO 2008/077892, el promotor tipo trehalosa-6-fosfato fosfatasa descrito en el documento copendiente de propiedad conjunta WO 2008/071726 y el promotor tipo At5g12170 descrito en el documento copendiente de propiedad conjunta WO 2008/095888. Todas las solicitudes anteriores se incorporan a la presente por referencia.

De acuerdo con la presente invención, el vector de expresión comprende una secuencia del control de la expresión ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos que es un molde para una o ambas cadenas de dsARN. El molde de dsARN comprende (a) una primera cadena que tiene una secuencia sustancialmente idéntica de alrededor de 19 a alrededor de 400-500, o hasta la longitud completa, a los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 , 3, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31 , 32, 34, 36, 37, 39, 41 , 43, 45, 46, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63 o 65, y (b) una segunda cadena que tiene una secuencia sustancialmente complementaria de la primera cadena. En otras formas de realización, un promotor flanquea alguno de los extremos del molde de la secuencia de nucleótidos, en donde los promotores dirigen la expresión de cada cadena de ADN, para así generar dos ARN complementarios que se hibridan y forman el dsARN. En formas de realización alternativas, la secuencia de nucleótidos se transcribe en ambas cadenas del dsARN en una unidad de transcripción, en donde la cadena sentido se transcribe desde el extremo 5' de la unidad de transcripción y la cadena antisentido se transcribe desde el extremo 3', y las dos cadenas están separadas por alrededor de 3 a alrededor de 500 pares de bases, y en donde, después de la transcripción, el transcripto de ARN se pliega sobre sí mismo para formar una horquilla En otra forma de realización, el vector contiene un promotor bidireccional, que dirige la expresión de dos moléculas de ácido nucleico, por medio del cual una molécula de ácido nucleico codifica la secuencia sustancialmente idéntica a una porción de un gen CLASP1 , de la subunidad delta de proteinasa aspártica, de la proteína 1 secretada, de tipo receptor de quinasa lectina, de tipo pectina metilesterasa y NPY de planta y la otra molécula de ácido nucleico codifica una segunda secuencia que es sustancialmente complementaria de la primera cadena y es capaz de formar un dsARN, cuando se transcriben ambas secuencias. Un promotor bidireccional es un promotor capaz de mediar la expresión en dos direcciones.

En otra forma de realización, el vector contiene dos promotores, uno que media la transcripción de la secuencia sustancialmente idéntica a una porción de un gen CLASP1 , de la subunidad delta de proteinasa aspártica, de la proteína 1 secretada, de tipo receptor de quinasa lectina, de tipo pectina metilesterasa y NPY de planta y otro promotor que media la transcripción de una segunda secuencia que es sustancialmente complementaria de la primera cadena y es capaz de formar un dsARN, cuando se transcriben ambas secuencias. El segundo promotor puede ser un promotor diferente.

Un promotor diferente significa un promotor que tiene una actividad diferente con respecto a la especificidad de célula o tejido, o que muestra la expresión en diferentes inductores, por ejemplo, patógenos, estrés abiótico o productos químicos. Por ejemplo, un promotor puede ser constitutivo o específico de tejido y otro puede ser específico de tejido o inducible por patógenos. En una forma de realización, un promotor media la transcripción de una molécula de ácido nucleico adecuada para la sobreexpresión de un gen CLASP1 , de la subunidad delta de proteinasa aspártica, de la proteína 1 secretada, de tipo receptor de quinasa lectina, de tipo pectina metilesterasa y NPY, mientras que otro promotor media la transcripción específica de tejido o de célula o la expresión inducible por patógenos del ácido nucleico complementario.

La invención también comprende una planta transgénica capaz de expresar el dsARN de la invención y, de este modo, inhibir los genes CLASP1 , de la subunidad delta de proteinasa aspártica, de la proteína 1 secretada, de tipo receptor de quinasa lectina, de tipo pectina metilesterasa y NPY en plantas. De acuerdo con la invención, la planta es una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea. La planta transgénica de la invención puede ser de cualquier especie que se pueda infectar con nematodos parasitarios de planta; esas especies incluyen, sin limitación, Medicago, Solanum, Brassica, Cucumis, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Sécale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus, Nicotiana, Cucúrbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena y Allium. Preferentemente, la planta es una planta de cultivo, tal como trigo, cebada, sorgo, centeno, tritical, maíz, arroz, caña de azúcar, arveja, alfalfa, soja, zanahoria, apio, tomate, papa, algodón, tabaco, pimiento, cañóla, colza oleaginosa, remolacha, repollo, coliflor, brócoli o lechuga.

Los métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped, incluso células vegetales, son conocidos en la industria de la biotecnología de plantas. Se puede usar cualquier método para transformar el vector de expresión recombinante en las células vegetales a fin de obtener las plantas transgénicas de la invención. Los métodos generales para transformar las plantas dicotiledóneas se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 4.940.838; 5.464.763 y similares. Los métodos para transformar plantas dicotiledóneas específicas, por ejemplo, algodón, se indican en las patentes estadounidenses Nos. 5.004.863; 5.159.135; y 5.846.797. Se pueden usar los métodos para la transformación de soja que se indican en las patentes estadounidenses Nos. 4.992.375; 5.416.01 1 ; 5.569.834; 5.824.877; 6.384.301 y en EP 0301749B1. Los métodos de transformación pueden incluir métodos de transformación directos e indirectos. Los métodos directos adecuados incluyen absorción de ADN inducida por polietilenglicol, transformación mediada por liposoma (US 4.536.475), métodos biolísticos que usan la pistola génica (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9):833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2:603, 1990), electroporación, incubación de embriones secos en una solución que comprende ADN y microinyección. En el caso de estos métodos de transformación directa, no es necesario que los plásmidos usados cumplan con ningún requisito en particular. Se pueden usar plásmidos simples, tales como los de las series pUC, pBR322, series M13mp, pACYC184 y similares. Si se deben regenerar plantas intactas a partir de las células transformadas, preferentemente se coloca un gen marcador seleccionare adicional en el plásmido. Las técnicas directas de transformación son igualmente adecuadas para las plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas.

La transformación también se puede realizar mediante infección bacteriana con Agrobacterium (por ejemplo, EP 0 116 718), infección viral con vectores virales (EP 0 067 553; US 4.407.956; WO 95/34668; WO 93/03161) o mediante polen (EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4.684.611). Las técnicas de transformación basadas en Agrobacterium (en especial, para plantas dicotiledóneas) son conocidas en el arte. La cepa de Agrobacterium (por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes) comprende un plásmido (plásmido Ti o Ri) y un elemento T-ADN que se transfiere a la planta después de la infección con Agrobacterium. El T-ADN (ADN transferido) se integra en el genoma de la célula vegetal. El T-ADN puede estar ubicado en el plásmido Ri o Ti, o puede estar comprendido por separado en un vector denominado binario. Los métodos para la transformación mediada por Agrobacterium se describen, por ejemplo, en Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229. La transformación mediada por Agrobacterium es más adecuada para las plantas dicotiledóneas, pero también fue adaptada para las plantas monocotiledóneas. La transformación de plantas con Agrobacterias se describe, por ejemplo, en White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225. La transformación puede dar como resultado la transformación y expresión transitoria o estable. Pese a que se puede insertar una secuencia de nucleótidos de la presente invención en cualquier planta o célula vegetal que entra en alguna de estas amplias clases, es particularmente útil en las células de plantas de cultivo.

Las plantas transgénicas de la invención se pueden cruzar con plantas transgénicas similares o con plantas transgénicas que carecen de los ácidos nucleicos de la invención o con plantas no transgénicas, mediante el uso de métodos conocidos de reproducción de plantas, para preparar semillas. Además, la planta transgénica de la presente invención puede comprender y/o ser cruzada con otra planta transgénica que comprende uno o más ácidos nucleicos, para así crear una "acumulación" de transgenes en la planta y/o su progenie. Luego se planta la semilla para obtener una planta transgénica fértil cruzada que comprenda el ácido nucleico de la invención. La planta transgénica fértil cruzada puede tener el cásete de expresión particular heredado de un progenitor femenino o de un progenitor masculino. La segunda planta puede ser una planta endogámica. La planta transgénica fértil cruzada puede ser un híbrido. En la presente invención también se incluyen las semillas de cualquiera de estas plantas transgénicas fértiles cruzadas. Las semillas de la presente invención se pueden cosechar de plantas transgénicas fértiles y se pueden usar para cultivar generaciones de progenies de plantas transformadas de la presente invención, que incluyen líneas de plantas híbridas que comprenden el constructo de ADN.

La "acumulación de genes" también se puede lograr al transferir dos o más genes al núcleo celular mediante la transformación de plantas. Se pueden introducir múltiples genes en el núcleo celular durante la transformación en forma secuencial o simultánea. Se pueden regular en forma descendente múltiples genes de plantas o especies de patógenos blanco mediante mecanismos de silenciamiento génico, específicamente ARNi, mediante el uso de un único transgén que se dirige a múltiples secuencias de interés ligadas parcialmente. También se pueden sobreexpresar múltiples genes acumulados bajo el control de promotores individuales para obtener un sólo fenotipo o múltiples fenotipos deseados. Los constructos que contienen acumulaciones de genes sobreexpresados y blancos silenciados también se pueden introducir en plantas para obtener un solo fenotipo o múltiples fenotipos agronómicamente importantes. En ciertas formas de realización, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden acumular con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés para crear los fenotipos deseados. Las combinaciones pueden producir plantas con va as combinaciones de rasgos que incluyen, sin limitación, resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, mejora del rendimiento, tolerancia al frío y a la sequía. Estas combinaciones acumuladas se pueden crear por cualquier método, que incluye, sin limitación, plantas obtenidas por reproducción cruzada mediante métodos convencionales o transformación genética. Si los rasgos se acumulan por transformación genética, las secuencias de polinucleótidos de interés se pueden combinar en forma secuencial o simultánea en cualquier orden. Por ejemplo, si se deben introducir dos genes, las dos secuencias pueden estar contenidas en diferentes casetes de transformación o en el mismo cásete de transformación. La expresión de las secuencias puede ser dirigida por el mismo promotor o por diferentes promotores.

De acuerdo con esta forma de realización, la planta transgénica de la invención se produce mediante un método que comprende las siguientes etapas: seleccionar un gen CLASP1 , de la subunidad delta de proteinasa aspártica, de la proteína 1 secretada, de tipo receptor de quinasa lectina, de tipo pectina metilesterasa y NPY de planta; preparar un cásete de expresión de dsARN que tiene una primera región que es sustancialmente idéntica al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos del gen CLASP1 , de la subunidad delta de proteinasa aspártica, de la proteína 1 secretada, de tipo receptor de quinasa lectina, de tipo pectina metilesterasa o NPY seleccionado, y una segunda región que es complementaria de la primera región; transformar el cásete de expresión en una planta; y seleccionar la progenie de la planta transformada que expresa el constructo de dsARN de la invención.

Una mayor resistencia a la infección por nematodos es un rasgo general que se desea sea heredado en una amplia variedad de plantas. Una mayor resistencia a la infección por nematodos es un rasgo general que se desea sea heredado en una amplia variedad de plantas. La presente invención se puede usar para reducir la destrucción de los cultivos que ocasionan los nematodos parasitarios de plantas. Preferentemente, los nematodos parasitarios pertenecen a las familias de nematodos que inducen las células gigantes o sincitiales, tales como Longidoridae, Trichodorídae, Heterodidae, Meloidogynidae, Pratylenchidae o Tylenchulidae. En particular, a las familias Heterodidae y Meloidogynidae.

Cuando los nematodos parasitarios son del género Globodera, los ejemplos de especies blanco incluyen, sin limitación, G. achilleae, G. artemisiae, G. hypolysi, G. mexicana, G. millefolii, G. mali, G. pallida, G. rostochiensis, G. tabacum y G. virginiae. Cuando los nematodos parasitarios son del género Heterodera, los ejemplos de especies blanco incluyen, sin limitación, H. avenae, H. carotae, H. ciceri, H. cruciferae, H. delvii, H. elachista, H. filipjevi, H. gambiensis, H. glycines, H. goettingiana, H. graduni, H. humuli, H. hordecalis, H. latipons, H. major, H. medicaginis, H. oryzicola, H. pakistanensis, H. rosii, H. sacchari, H. schachtii, H. sorghi, H. trifolii, H. urticae, H. vigni y H. zeae. Cuando los nematodos parasitarios son del género Meloidogyne, los ejemplos de especies blanco incluyen, sin limitación, M. acronea, M. arábica, M. arenaria, M. artiellia, M. brevicauda, M. camelliae, M. chitwoodi, M. cofeicola, M. esigua, M. graminicola, M. hapla, M. incógnita, . indica, M. inornata, M. javanica, M. lini, M. mali, M. microcephala, M. microtyla, M. naasi, M. salasi y M. thamesi.

Los siguientes ejemplos no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones de la invención, sino ejemplificar ciertas formas de realización. Cualquier variación de los métodos ejemplificados que se les puedan ocurrir a los expertos en el arte pretende estar incluida en el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 : Clonación de genes blanco y construcción de vector Con una secuencia de clon de cADN disponible para los genes blanco de soja, se usó PCR para aislar fragmentos de ADN de aproximadamente 200-500 bp de longitud que se usaron para construir los vectores binarios descritos en la Tabla 1 y analizados en el Ejemplo 2. Los productos de PCR se clonaron en el vector TOPO pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y las inserciones se confirmaron mediante secuenciación. Con este método se aislaron fragmentos génicos de los genes blanco GmCLASPI , subunidad delta de proteinasa GmAspártica, proteína 1 GmSecretada, tipo receptor de quinasa GmLectina, tipo GmPectina metiesterasa, GmNPYI y GmNPY-tipo5.

A fin de obtener un cADN de longitud completa de los genes blanco GmCLASPI , subunidad delta de proteinasa GmAspártica, proteína 1 GmSecretada, tipo receptor de quinasa GmLectina, tipo GmPectina metiesterasa, GmNPYI y GmNPY-tipo5 de la soja, se realizó 5' RACE con ARN total de raíces de soja infectadas con SCN y el kit GeneRacer (L1502-1) de Invitrogen.

Las secuencias de longitud completa de los genes blanco GmCLASPI , subunidad delta de proteinasa GmAspártica, proteína 1 GmSecretada, tipo receptor de quinasa GmLectina, tipo GmPectina metiesterasa, GmNPYI y GmNPY-tipo5 se unieron en cADN correspondientes a los siete genes blanco, designados como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO:43.

Los vectores binarios de transformación de plantas para expresar los constructos de dsARN descritos por SEQ ID NO: 3, 12, 19, 26, 31 , 36, 45 y 46 se generaron con promotores inducibles por nematodos de quiste de la soja (SCN) o mediante un promotor constitutivo. Para ello, los fragmentos génicos descritos por SEQ ID NO: 3, 12, 19, 26, 31 , 36, 45 y 46 se ligaron operativamente al promotor GmMTN3 inducible por SCN (WO 2008/095887), al promotor tipo At tre alosa-6-fosfato fosfatasa (WO2008/071726) o al superpromotor (US 5.955.646) como se indica en la Tabla 1. Los vectores binarios de plantas resultantes contienen un marcador seleccionare de transformación de plantas que consiste en un gen AHAS de Arabidopsis modificado que confiere tolerancia al herbicida Arsenal (BASF Corporation, Florham Park, NJ).

Tabla 1 Ejemplo 2: Bioensayo de dsARN dirigido a genes blanco de G. max Los vectores binarios descritos en la Tabla 1 se usaron en el sistema de ensayo de plantas enraizadas descrito en la publicación de patente estadounidense copendiente 2008/0153102. Las raíces transgénicas se generaron después de la transformación con los vectores binarios descritos en el Ejemplo 1. Múltiples líneas de raíces transgénicas se subcultivaron e inocularon con juveniles SCN de segunda etapa (J2) Race 3 descontaminados en la superficie al nivel de alrededor de 500 J2/cavidad. Cuatro semanas después de la inoculación con nematodos, se contó la cantidad de quistes de cada cavidad Para cada constructo de transformación, se calculó la cantidad de quistes por línea para determinar el conteo promedio de quistes y el error estándar del constructo. Los valores del conteo de quistes para cada constructo de transformación se compararon con los valores del conteo de quistes de un vector de control vacío evaluado en paralelo para determinar si el constructo evaluado da como resultado una reducción del conteo de quistes. Los resultados del bioensayo de los constructos que contenían las secuencias horquilla descritas por SEQ ID NO 3, 12, 19, 26, 31 , 36 y 46 dieron como resultado una tendencia general a un menor conteo de quistes de nematodos de quiste de la soja en muchas de las líneas evaluadas en el constructo designado que contenía un promotor inducible por SCN ligado operativamente a cada uno de los genes descritos.

Ejemplo 3: Identificación de gen homólogo blanco de la papa y construcción del vector Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP2593-3 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 1 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor inducible por SCN y se expresa en raíces de la soja. Como se describe en el Ejemplo 1 , la secuencia putativa de transcriptos de longitud completa del gen descrito por SEQ ID NO:1 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO:2. Se usó la secuencia de aminoácidos descrita por SEQ ID NO:2 para identificar genes homólogos de otras especies de plantas. Un fragmento de un gen de muestra con secuencias de aminoácidos y ADN homologas a SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, se identificó de la papa y se describe en SÉQ ID NO:63 y SEQ ID NO:64.

Los fragmentos génicos del gen blanco StCLASP BQ506533 se aislaron con secuencias del clon de cADN disponibles para amplificar, mediante PCR, un fragmento de ADN de 267 bp de longitud. El fragmento de ADN aislado se usó para construir el vector binario descrito en la Tabla 2 y que se analiza en el Ejemplo 4. El producto de PCR se clonó en el vector TOPO pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la inserción se confirmó mediante secuenciación.

Tabla 2 Ejemplo 4: Bioensayo in vitro de nemátodos de nudo radicular en Solanum tuberosum de dsARN dirigido a gen blanco de la papa El vector binario RTP2622 descrito en la Tabla 2 se usó en un sistema de ensayo de plantas de papa enraizadas descrito en la publicación de la patente estadounidense copendiente 2008/0153102. Se generaron raíces transgénicas luego de la transformación con el vector binario RTP2622 descrito en el Ejemplo 3 y se seleccionaron en un medio de crecimiento que contenía el agente de selección Arsenal. Se subcultivaron e inocularon múltiples líneas de raíces transgénicas con juveniles RKN (Medicago incógnita) de segunda etapa (J2) descontaminados en la superficie al nivel de alrededor de 200 J2 por muestra. Cuatro semanas luego de la inoculación con nemátodos, se trataron las raíces con tintura Erioglaucine Azul Brillante, y se contaron las masas de huevos para cada muestra. El conteo de masas de huevos normalizada al peso de raíz fresca se usó para calcular el conteo de masas de huevos promedio y el error estándar para el constructo RTP2622. Los conteos de masas de huevos promedio para las raíces de papa transformadas con el constructo binario RTP2622 se compararon con los conteos de masas de huevos promedio de un vector de control vacío que se evaluó en paralelo para determinar si los constructos evaluados generaban una reducción en el conteo de masas de huevos. Los datos del bioensayo para el constructo RTP2622 que contiene la secuencia de horquilla descrita en SEQ ID NO:65 muestran una tendencia general a un menor conteo de masas de huevos de nematodos de nudo radicular, con respecto a varias de las líneas evaluadas en el constructo designado que contienen un promotor constitutivo ligado operativamente al gen descrito.

Ejemplo 5: Identificación de secuencias de soja adicionales que son el blanco de constructos binarios Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP2593-3 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 1 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor inducible por SCN y se expresa en raíces de la soja. El fragmento sentido del gen GmCLASPI contenido en RTP2593-3, descrito por SEQ ID NO: 3, corresponde a los nucleótidos 3661 a 4056 de la secuencia de GmCLASPI de longitud completa descrita por SEQ ID NO: 1. Al menos uno de los 21 meros resultantes derivados del procesamiento de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2593-3 se puede dirigir a otras secuencias de soja descritas en SEQ ID NO: 4, 6 y 8. En la Figura 2 se muestra el alineamiento de aminoácidos de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2593-3 descrita por el gen blanco GmCLASPI SEQ ID NO: 2, Glyma03g32710.1 descrito por SEQ ID NO: 5, Glyma13g 19230.1 descrito por SEQ ID NO: 7 y Glyma10g04850.1 descrito por SEQ ID NO: 9. En la Figura 9 se muestra el alineamiento de nucleótidos del marco de lectura abierto de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2593-3 descrita por el gen blanco GmCLASPI SEQ ID NO: 1, el fragmento sentido del gen GmCLASPI contenido en RTP2593-3 descrito por SEQ ID NO: 3, Glyma03g32710.1 descrito por SEQ ID NO: 4, Glyma13g19230.1 descrito por SEQ ID NO: 6 y Glyma10g04850.1 descrito por SEQ ID NO: 8. En la Figura 16a se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa del gen GmCLASPI descrito por SEQ ID NO: 2 y transcriptos blancos de soja adicionales de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP2593-3 descrito por SEQ ID NO: 5, 7 y 9, entre sí. En la Figura 16b se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencias de ADN de la secuencia de transcriptos del marco de lectura abierto del gen GmCLASPI descrito por SEQ ID NO: 1 y transcriptos blancos de soja adicionales de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP2593-3 descrito por SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, entre sí.

Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP31 13-1 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 10 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor inducible por SCN y se expresa en raíces de la soja. El fragmento sentido del gen de la subunidad delta de proteinasa GmAspártica contenido en RTP31 13-1 , descrito por SEQ ID NO: 12, corresponde a los nucleótidos 557 a 950 de la secuencia de longitud completa de la subunidad delta de proteinasa GmAspártica descrita por SEQ ID NO: 10. Al menos uno de los 21 meros resultantes derivados del procesamiento de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP3113-1 se puede dirigir a otras secuencias de soja descritas en SEQ ID NO: 13 y 15. En la Figura 3 se indica el alineamiento de aminoácidos de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP3113-1 descrita por el gen blanco de la subunidad delta de proteinasa GmAspártica SEQ ID NO: 11 y Glyma15g 11670.1 descrito por SEQ ID NO: 14 y Glyma07g39240.1 descrito por SEQ ID NO: 16. En la Figura 10 se indica el alineamiento de nucleótidos del marco de lectura abierto de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP3113-1 descrita por el gen blanco de la subunidad delta de proteinasa GmAspártica SEQ ID NO: 10, el fragmento sentido del gen de la subunidad delta de proteinasa GmAspártica contenido en RTP3113-1 descrito por SEQ ID NO: 12 y Glyma15g11670.1 descrito por SEQ ID NO: 13 y Glyma07g39240.1 descrito por SEQ ID NO: 15. En la Figura 16c se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa del gen de la subunidad delta de proteinasa GmAspártica descrito por SEQ ID NO:1 1 y transcriptos blanco de soja adicionales de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP3113-1 descrito por SEQ ID NO: 14 y 16, entre sí. En la Figura 16d se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de ADN de la secuencia de transcriptos del marco de lectura abierto del gen de la subunidad delta de proteinasa GmAspártica descrito por SEQ ID NO: 10 y transcriptos blanco de soja adicionales de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP3113-1 descrito por SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15, entre sí.

Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP3923-4 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 17 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor inducible por SCN y se expresa en raíces de la soja. Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP3924-1 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 17 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor constitutivo y se expresa en raíces de la soja. El fragmento sentido del gen de la proteína 1 GmSecretada contenido en RTP3923-4 y RTP3924-1 , descrito por SEQ ID NO: 19, corresponde a los nucleótidos 386 a 701 de la secuencia de longitud completa de la proteína 1 GmSecretada descrita por SEQ ID NO: 17. Al menos uno de los 21 meros resultantes derivados del procesamiento de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP3923-4 o RTP3924-1 se puede dirigir a otras secuencias de soja descritas en SEQ ID NO: 20 y 22. En la Figura 4 se indica el alineamiento de aminoácidos de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP3923-4 y RTP3924-1 descrita por el gen blanco de la proteína 1 GmSecretada SEQ ID NO; 18, el gen de la proteína 2 GmSecretada descrita por SEQ ID NO:21 y Glyma20g26600.1 descrita por SEQ ID NO: 23. En la Figura 11 se muestra el alineamiento de nucleótidos del marco de lectura abierta de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP3923-4 y RTP3924-1 descrita por el gen blanco de la proteína 1 GmSecretada SEQ ID NO: 17, el fragmento sentido del gen de la proteína 1 GmSecretada contenido en RTP3923-4 y RTP3924-1 descrito por SEQ ID NO: 19, el gen de la proteína 2 GmSecretada descrito por SEQ ID NO: 20 y Glyma20g26600.1 descrito por SEQ ID NO: 22. En la Figura 16e se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa del gen de la proteína 1 GmSecretada descrito por SEQ ID NO: 18 y un transcripto blanco de soja adicional de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP3923-4 y RTP3924-1 descrita por SEQ ID NO: 21 y 23, entre sí. En la Figura 16f se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de ADN de la secuencia de transcriptos del marco de lectura abierto del gen de la proteína 1 GmSecretada descrito por SEQ ID NO: 17 y transcriptos blanco de soja adicionales de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP3923-4 y RTP3924-1 descrita por SEQ ID NO.20 y SEQ ID NO: 22, entre sí.

Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP4280-2 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO:24 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor inducible por SCN y se expresa en raíces de la soja. Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP4279-1 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO:24 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor constitutivo y se expresa en raíces de la soja. El fragmento sentido del gen tipo GmLRK contenido en RTP4280-2 y RTP4279-1 , descrito por SEQ ID NO:26,corresponde a los nucleótidos 1001 a 1300 de la secuencia de longitud completa tipo GmLRK descrita por SEQ ID NO:24. Al menos uno de los 21 meros resultantes derivados del procesamiento de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP4280-2 o RTP4279-1 se puede dirigir a otra secuencia de soja descrita en SEQ ID NO: 27. En la Figura 5 se indica el alineamiento de aminoácidos de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP4280-2 y RTP4279-1 descrita por el gen blanco tipo GmLRK SEQ ID NO: 25 y Glyma18g40290.1 descrito por SEQ ID NO: 28. En la Figura 12 se indica el alineamiento de nucleótidos del marco de lectura abierto de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP4280-2 y RTP4279-1 descrita por el gen blanco tipo GmLRK SEQ ID NO:24, el fragmento sentido del gen tipo GmLRK contenido en RTP4280-2 y RTP4279-1 descrito por SEQ ID NO: 26 y el gen Glyma18g40290.1 descrito por SEQ ID NO: 27. En la Figura 16g se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa del gen tipo GmLRK descrito por SEQ ID NO:25 y un transcripto blanco de soja adicional de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP4280-2 y RTP4279-1 descrito por SEQ ID NO: 28, entre sí. En la Figura 16h se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de ADN de la secuencia de transcriptos del marco de lectura abierta del gen tipo GmLRK descrito por SEQ ID NO: 24, el fragmento sentido del gen tipo GmLRK contenido en RTP4280-2 y RTP4279-1 descrito por SEQ ID NO: 26 y un transcripto blanco de soja adicional de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP4280-2 y RTP4279-1 descrito por SEQ ID NO: 27, entre sí.

Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP3856-4 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 29 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor inducible por SCN y se expresa en raíces de la soja. El fragmento sentido del gen tipo GmPME contenido en RTP3856-4, descrito por SEQ ID NO: 31 , corresponde a los nucleótidos 1474 a 1813 de la secuencia de longitud completa tipo GmPME descrita por SEQ ID NO: 29. Al menos uno de los 21 meros resultantes derivados del procesamiento de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP3856-4 se puede dirigir a otra secuencia de soja descrita en SEQ ID NO: 32. En la Figura 6 se indica el alineamiento de aminoácidos de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP3856-4 descrita por el gen blanco tipo GmPME SEQ ID NO:30 y Glyma16g01650.1 descrita por SEQ ID NO: 33. En la Figura 13 se indica el alineamiento de nucleótidos del marco de lectura abierto de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP3856-4 descrita por el gen blanco tipo GmPME SEQ ID NO: 29, el fragmento sentido del gen tipo GmPME contenido en RTP3856-4 descrito por SEQ ID NO: 31 y la secuencia Glyma16g01650.1 descrita por SEQ ID NO: 32. En la Figura 16i se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa del gen tipo GmPME descrito por SEQ ID NO: 30 y un transcripto blanco de soja adicional de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP3856-4 descrita por SEQ ID NO: 33, entre sí. En la Figura 16j se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de ADN de la secuencia de transcriptos del marco de lectura abierto del gen tipo GmPME descrito por SEQ ID NO: 29, el fragmento sentido del gen tipo GmPME contenido en RTP3856-4 descrito por SEQ ID NO: 31 y un transcripto blanco de soja adicional de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP3856-4 descrita por SEQ ID NO: 32, entre sí.

Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP2362-1 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 34 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor inducible por SCN y se expresa en raíces de la soja. Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP2361-4 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 34 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor constitutivo y se expresa en raíces de la soja. El fragmento sentido del gen GmNPYI contenido en RTP2362-1 y RTP2361-4, descrito por SEQ ID NO: 36, corresponde a los nucleótidos 1458 a 1827 de la secuencia de longitud completa GmNPYI descrita por SEQ ID NO: 34. Al menos uno de los 21 meros resultantes derivados del procesamiento de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2362-1 o RTP2361-4 se puede dirigir a otras secuencias de soja descritas por SEQ ID NO:37, SEQ ID NO 39 ' y SEQ ID NO:41. En la Figura 7 se muestra el alineamiento de aminoácidos de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2362-1 y RTP2361-4 descrita por el gen blanco GmNPYI SEQ ID NO: 35, GmNPY-tipo2 descrito por SEQ ID NO: 38, GmNPY-tipo3 descrito por SEQ ID NO: 40 y GmNPY-tipo4 descrito por SEQ ID NO: 42. En la Figura 14 se indica el alineamiento de nucleótidos de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2362-1 y RTP2361-4 descrita por el gen blanco GmNPYI SEQ ID NO: 34, el fragmento sentido del gen GmNPYI contenido en RTP2362-1 y RTP2361-4 descrito por SEQ ID NO:36, el gen GmNPY-tipo2 descrito por SEQ ID NO: 37, el gen GmNPY-tipo3 descrito por SEQ ID NO: 39 y el gen GmNPY-tipo4 descrito por SEQ ID NO: 41. En la Figura 16k se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa del gen GmNPYI descrito por SEQ ID NO: 35 y transcriptos blanco de soja adicionales de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP2362-1 y RTP2361-4 descrito por SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 42, entre sí. En la Figura 161 se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de ADN de la secuencia de transcriptos del marco de lectura abierto del gen GmNPYI descrito por SEQ ID NO: 34, el fragmento sentido del gen GmNPYI contenido en RTP2362-1 y RTP2361-4 descrito por SEQ ID NO: 36 y transcriptos blanco de soja adicionales de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP2362-1 y RTP2361-4 descrito por SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 41 , entre sí.

Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP4082-1 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 43 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor constitutivo y se expresa en raíces de la soja. El fragmento sentido del gen GmNPY-tipo5 contenido en RTP4082-1 , descrito por SEQ ID NO: 45, corresponde a los nucleótidos 344 a 558 de la secuencia de longitud completa GmNPY-tipo5 descrita por SEQ ID NO: 43. Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP4083-1 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 43 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor constitutivo y se expresa en raíces de la soja. El fragmento sentido del gen GmNPY-tipo5 contenido en RTP4083-1, descrito por SEQ ID NO: 46, corresponde a los nucleótidos 1798 a 2089 de la secuencia de longitud completa GmNPY-tipo5 descrita por SEQ ID NO: 43. El fragmento sentido del gen GmNPY-tipo5 contenido en RTP4083-1 incluye una secuencia exón del nucleótido 1 a 193, que corresponde a una secuencia exón en GmNPY-tipo5 descrita por SEQ ID NO: 43 del nucleótido 1798 a 1990. El fragmento sentido del gen tipo GmNPY contenido en RTP4083-1 incluye una secuencia 3' UTR del nucleótido 194 a 295, que corresponde a una secuencia 3' UTR del gen GmNPY-tipo5 descrito por SEQ ID NO: 43 del nucleótido 1991 a 2091. Al menos uno de los 21 meros resultantes derivados del procesamiento de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP4082-1 o RTP4083-1 se puede dirigir a otra secuencia de soja descrita por SEQ ID NO: 47. En la Figura 8 se indica el alineamiento de aminoácidos de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP4082-1 o RTP4083-1 descrita por el gen blanco GmNPY-tipo5 SEQ ID NO: 44 y GmNPY-tipo6 descrita por SEQ ID NO: 48. En la Figura 15 se muestra el alineamiento de nucleótidos del marco de lectura abierto de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP4082-1 o RTP4083-1 descrita por el gen blanco GmNPY-tipo5 SEQ ID NO: 43, el fragmento sentido del gen GmNPY-tipo5 contenido en RTP4082-1 descrito por SEQ ID NO: 45, el fragmento sentido del gen GmNPY-tipo5 contenido en RTP4083-1 descrito por SEQ ID NO: 46 y la secuencia GmNPY-tipo6 descrita por SEQ ID NO: 47. En la Figura 16m se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa del gen GmNPY-tipo5 descrita por SEQ ID NO: 44 y un transcripto blanco de soja adicional de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP4082-1 y RTP4083-1 descrita por SEQ ID NO: 48, entre sí. En la Figura 16n se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de ADN de la secuencia de transcriptos del marco de lectura abierto del gen GmNPY-tipo5 descrito por SEQ ID NO: 43 y un transcripto blanco de soja adicional de la molécula de ARN bicatenario expresada por RTP4082-1 y RTP4083-1 descrita por SEQ ID NO: 47, entre sí.

Ejemplo 6: Identificación de homólogos de CLASP y NPY1 Como se indica en el Ejemplo 3, el homólogo de CLASP de la papa descrito por SEQ ID NO: 64 se identificó sobre la base de las búsquedas de similitud de secuencia con los blancos identificados, descritos mediante secuencias de soja SEQ ID NO: 2, 5, 7 y 9, de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2593-3. En la Figura 17 se indica el alineamiento de aminoácidos del homólogo parcial identificado de la papa, descrito por SEQ ID NO: 64 con los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2593-3 descrita por las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 2, 5, 7 y 9. En la Figura 21a se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de aminoácidos del homólogo parcial identificado de la papa, descrito por SEQ ID NO: 64 con los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2593-3 descrita por las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 2, 5, 7 y 9, entre sí. En la Figura 19 se muestra el alineamiento de secuencias de ADN del homólogo parcial identificado de la papa SEQ ID NO: 63 y la cadena sentido contenida en RTP2622 descrita por SEQ ID NO: 65 con los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2593-3 descrita por las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 1 , 4, 6 y 8 y la cadena sentido contenida en RTP2593-3 descrita por SEQ ID NO: 3. En la Figura 21b se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de secuencia de ADN de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2593-3 descrita por el gen blanco GmCLASPI SEQ ID NO: 1 , el gen blanco Glyma03g32710.1 SEQ ID NO: 4, el gen blanco Glyma13g19230.1 SEQ ID NO: 6, el gen blanco Glyma10g04850.1 SEQ ID NO: 8, la cadena sentido contenida en RTP2593-3 -1 descrita por SEQ ID NO: 3, el homólogo parcial identificado de la papa SEQ ID NO: 63 y la cadena sentido contenida en RTP2622 descrita por SEQ ID NO:65, entre sí.

Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP2362-1 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 34 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor inducible por SCN y se expresa en raíces de la soja. Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP2361-4 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 34 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor constitutivo y se expresa en raíces de la soja. Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP4082-1 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 43 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor constitutivo y se expresa en raíces de la soja. Como se describe en el Ejemplo 2, el constructo RTP4083-1 genera la expresión de una molécula de ARN bicatenario que se dirige a SEQ ID NO: 43 y da como resultado un menor conteo de quistes cuando se liga operativamente a un promotor constitutivo y se expresa en raíces de la soja. Como se describe en el Ejemplo 1 , la secuencia putativa de transcriptos de longitud completa del gen descrito por SEQ ID NO: 34 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO: 35, y la secuencia putativa de transcriptos de longitud completa del gen descrito por SEQ ID NO: 43 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO: 44. Se usaron las secuencias de aminoácidos descritas por SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 44 para identificar genes homólogos de soja y de otras especies de plantas. Los genes de muestra con secuencias de ADN homologas a SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 43 se identificaron mediante SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61. Las secuencias putativas de transcriptos de longitud completa de los genes descritos por SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61 contienen marcos de lectura abiertos con las secuencias de aminoácidos descritas como SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 62, respectivamente. En la Figura 18 se muestra el alineamiento de aminoácidos de los homólogos identificados de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2362-1 y RTP2361-4 descrita mediante las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 42, y de los blancos identificados de las moléculas de ARN bicatenario expresadas de RTP4082-1 y RTP4083-1 descritas mediante las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48. En la Figura 20 se muestra el alineamiento de nucleótidos de los homólogos identificados de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2362-1 y RTP2361-4, descrita mediante las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 41 , con la cadena sentido contenida en RTP2362-1 y RTP2361-4 descrita por SEQ ID NO: 36, con los blancos identificados de las moléculas de ARN bicatenario expresadas de RTP4082-1 y RTP4083-1 , descritas por las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 47, con la cadena sentido contenida en RTP4082-1 descrita por SEQ ID NO: 45 y la cadena sentido contenida en RTP4083-1 descrita por SEQ ID NO: 46. En la Figura 21c se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de aminoácidos de los homólogos identificados de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2362-1 y RTP2361-4 descrita mediante las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 42, y de los blancos identificados de las moléculas de ARN bicatenario expresadas de RTP4082-1 y RTP4083-1 , descritas mediante las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, entre sí. En la Figura 21 d se muestra una tabla matriz que indica el porcentaje de identidad de nucleótidos de los homólogos identificados de los blancos identificados de la molécula de ARN bicatenario expresada de RTP2362-1 y RTP2361-4 descrita mediante las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 41 , y de los blancos identificados de las moléculas de ARN bicatenario expresadas de RTP4082-1 y RTP4083-1 , descritas mediante las secuencias blanco de soja SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, entre sí.

Los expertos en el arte reconocerán, o podrán determinar sólo con experimentación de rutina, varios equivalentes de las formas de realización específicas de la invención descritas en la presente. Esos equivalentes pretenden estar abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión aislado caracterizado porque codifica un ARN bicatenario que comprende una primera cadena y una segunda cadena complementaria de la primera cadena, en donde la primera cadena es sustancialmente idéntica al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido blanco vegetal seleccionado del grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY de planta, en donde el ARN bicatenario inhibe la expresión del gen blanco.

2. El vector de expresión aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque el polinucleótido blanco se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 65; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO.17, SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:22; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:27¡ (e) un polinucleótido que comprende una secuencia como se indica en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:32; (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41 , SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60 o SEQ ID NO:62.

3. Un vector de expresión aislado que comprende un ácido nucleico que codifica múltiples de moléculas de ARN bicatenario, caracterizado porque cada una comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de al menos 19, 20 o 21 nucleótidos, en donde una cadena de dicha región bicatenaria deriva de un polinucleótido blanco vegetal seleccionado del grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY de planta, en donde el ARN bicatenario inhibe la expresión del gen blanco.

4. El vector de expresión aislado de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el polinucleótido blanco se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 65; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:22; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:27; (e) un polinucleótido que comprende una secuencia como se indica en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:32; (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60 o SEQ ID NO:62.

5. Una planta transgénica caracterizada porque es capaz de expresar al menos un dsARN que es sustancialmente idéntico al menos a 19, 20 o 21 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido blanco vegetal seleccionado del grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY de planta, en donde el dsARN inhibe la expresión del gen blanco en la raíz de la planta.

6. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque el polinucleótido blanco se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 65; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:22; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:27; (e) un polinucleótido que comprende una secuencia como se indica en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:32; (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41 , SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60 o SEQ ID NO:62.

7. Un método para producir una planta transgénica capaz de expresar un dsARN que comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica a una porción de un polinucleótido blanco vegetal y una segunda cadena complementaria de la primera cadena, en donde el polinucleótido blanco se selecciona del grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY de planta; caracterizado porque dicho método comprende las siguientes etapas: (i) preparar un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el dsARN, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcripto bicatenario luego de expresarse en la planta; (ii) transformar una planta receptora con dicho vector de expresión; (iii) producir uno o más vástagos transgénicos de dicha planta receptora; y (iv) seleccionar los vástagos resistentes a la infección por nematodos.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el polinucleótido blanco se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 65; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:13 o SEQ ID NO:15; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:22; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:27; (e) un polinucleótido que comprende una secuencia como se indica en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:32; (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41 , SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60 o SEQ ID NO:62.

9. Un método para conferirle a una planta resistencia a los nematodos, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (i) seleccionar un gen blanco vegetal del grupo que consiste en un gen CLASP1 , un gen de la subunidad delta de proteinasa aspártica, un gen de la proteína 1 secretada, un gen tipo receptor de quinasa lectina, un gen tipo pectina metilesterasa y un gen NPY de planta; (ii) preparar un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un dsARN que comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica a una porción del gen blanco y una segunda cadena complementaria de la primer cadena, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcripto bicatenario luego de expresarse en la planta; (iii) transformar una planta receptora con dicho ácido nucleico; (iv) producir uno o más vástagos transgénicos de dicha planta receptora; y (v) seleccionar los vástagos resistentes a los nematodos.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido blanco se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 65; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:22; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO-.24 o SEQ ID NO:27; (e) un polinucleótido que comprende una secuencia como se indica en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:32; (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41 , SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60 o SEQ ID NO:62.