PT637339E - Construcoes de adn e plantas que as incorporam - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "CONSTRUÇÕES DE ADN E PLANTAS QUE AS INCORPORAM" A presente invenção refere-se a construções de ADN e a plantas que as incorporam. Em particular, refere-se a cassetes de expressão e a sequências promotoras para a expressão de genes em plantas. A expressão de genes é controlada por regiões a montante (5’) da região codificante da proteína, vulgarmente referidas como "promotor". Um promotor pode ser constitutivo, específico de tecido, programado a nível de desenvolvimento, ou indutível. A manipulação de plantas de colheita para melhorar as suas características (como a produtividade e a qualidade), requer a expressão de genes estranhos, ou endógenos nos tecidos da planta. Esta manipulação genética baseia-se, portanto, na disponibilidade de meios para controlar a expressão de genes, como necessário; por exemplo, na disponibilidade e utilização de promotores adequados que são eficazes em plantas. É vantajoso poder escolher entre uma variedade de diferentes promotores, de modo a que se possa seleccionar o promotor mais adequado para um gene, construção, célula, tecido, planta ou ambiente particular. Conhece-se uma gama de promotores que são operacionais em plantas.

Na região do promotor, há vários domínios que são necessários para a função completa do promotor. 0 primeiro 1 b

destes domínios situa-se imediatamente a montante do gene estrutural e forma a "região promotora nuclear", que contém sequências de consensos, normalmente os 70 pares de bases, imediatamente a montante do gene. A região promotora nuclear contém as caixas CAAT e TATA características, mais sequências envolventes, e representa uma sequência de iniciação da transcrição que define o ponto de partida da transcrição para o gene estrutural. O comprimento exacto da região promotora nuclear é indefinido, mas é normalmente facilmente reconhecível. Esta região está normalmente presente, com alguma variação, em todos os promotores. As sequências de bases que ficam entre as "caixas", bem caracterizadas, parecem não ter grande importância. A presença da região promotora nuclear define que uma sequência é um promotor: se esta região está ausente, o promotor é não funcional. Além disso, a região promotora nuclear é insuficiente para proporcionar uma actividade de promotor completa. Uma série de sequências reguladoras a montante da região nuclear constituem o restante do promotor. As sequências reguladoras determinam o nível de expressão, o padrão espacial e temporal de expressão e, para um subconjunto de promotores importante, a expressão sob condições inductíveis. São conhecidos alguns promotores que ocorrem naturalmente e sistemas de expressão de genes associados. Os sistemas reguladores melhor caracterizados são os de bactérias, em que as interacções específicas entre as proteínas de ligação ao ADN (repressores) e as sequências ADN alvo (operadores) resultam na repressão negativa da actividade dos genes. 2 0 sistema de activaçâo de genes alcA/alcR do fungo Aspergillus nidulans está também bem caracterizado. A via de utilização do etanol em A. nidulans é responsável pela degradação de álcoois e aldeídos. Verificou-se que estão envolvidos três genes na via de utilização do etanol. Verificou-se que os genes alcA e alcR se situam próximo um do outro no grupo de ligação IV e o aldA está situado no grupo de ligação VIII (Pateman JH et al., 1984, Proc. Soc. Lond, B217:243-264; Sealy-Lewis HM e Lockington RA, 1984, Curr. Genet, 8:253-259) . O gene alcA codifica para ADHI em A nidulans e o aldA codifica para AldDH, a segunda enzima responsável pela utilização do etanol. A expressão de ambos, o alcA e o aldA, é induzida por etanol e vários outros indutores (Creaser EH et al, 1984, Biochemical J, 255:449-454), através do activador de transcrição alcR. O gene alcR e um co-indutor são responsáveis pela expressão de alcA e aldA, uma vez que várias mutações e delecções em alcR resultam na perda pleiotrópica de ADHI e aldDH (Felenbok B et al, 1988 Gene, 73:385-396; Pateman et al., 1984; Sealy-Lewis & Lockington, 1984). A proteína ALCR activa a expressão de alcA por ligação a três locais específicos no promotor de alcA (Kulmberg P et al, 1992, J. Biol. Chem, 267:21146-21153). 0 gene alcR foi clonado (Lockington RA et al., 1985, Gene, 33:137-149) e sequenciado (Felenbok et al, 1988). A expressão do gene alcR é indutível, autoregulada e sujeita a repressão pela glucose, mediada pelo repressor CREA (Bailey c e Arst HN, 1975, Eur. J. Biochem, 51:573-577; Lockington RA et al, 1987, Mol. Microbiology, 1:275-281; Dowzer CEA e Kelly JM, 1989, Curr. Genet, 15:457-459; Dowzer CEA e Kelly JM, 1991, Mol. Cell. Biol. 11:5701-5709). A proteína reguladora ALCR contém 6 cisteinas próximo do seu terminal N, coordenadas num cacho ("cluster") binuclear de zinco (Kulmberg P et al, 1991, FEBS Letts, 280:11-16). Este cacho ("cluster") está relacionado com domínios de ligação a ADN altamente conservados, encontrados em factores de transcrição de outros ascomicetes. Verificou-se que os factores de transcrição GAL4 e LAc9 têm complexos binucleares que têm uma estrutura do tipo folha de trevo, contendo dois átomos de Zn (II) (Pan T e Coleman JE, 1990, Biochemistry, 29:3023-3029; Halvorsen YDC et al., 1990, J. Biol. Chem, 265:13283-13289). A estrutura de ALCR é semelhante a este tipo, excepto quanto à presença de um laço ("loop") assimétrico de 16 resíduos, entre Cys-3 e Cys-4. O ALCR activa de forma positiva a expressão de si próprio, por ligação a dois locais específicos na sua região promotora (Kulmberg P et al., 1992, Molec. Cell. Biol., 12: 1932-1939). A regulação destes três genes, alcR, alcA e aldA, envolvidos na via de utilização do etanol, ocorre ao nível da transcrição (Lockington et al, 1987; Gwynne D et al, 1987, Gene, 51:205-216; Picket et al, 1987, Gene, 51:217-226). Há duas outras álcool desidrogenases que estão presentes em A nidulans. A ADHII está presente em micélios crescidos em meio não induzido e é reprimível pela presença de etanol. A ADHII é codificada por alcB e está também sob o controlo de alcR (Sealy-Lewis & Lockington, 1984). Já foi também clonada uma terceira álcool desidrogenase por complementação com uma estirpe adh de S. cerevisiae. Este gene alcC, está localizado no grupo de ligação VII, mas não está ligado a alcA e alcR. O gene alcC, codifica para ADHII e utiliza o etanol de uma forma extremamente fraca (McKnight GL et al, 1985, EMBO J, 4:2094-2099). Verificou-se que a ADHIII está envolvida na sobrevivência de A nidulans durante períodos de stresse 4

anaeróbico. A expressão de alcC não é reprimida pela presença de glucose, sugerindo que poderá não estar sob o controlo de alcR (Roland LJ e Stromer JN, 1986, Mol. Cell. Biol. 6:3368-3372) .

Em resumo, a A. nidulans expressa a enzima álcool desidrogenase I (ADHI) codificada pelo gene alcA, apenas quando é crescida na presença de vários álcoois e cetonas. A indução é assegurada através de uma proteína reguladora codificada pelo gene alcR e é expressa de forma constitutiva. Na presença de um indutor (álcool ou cetona), a proteína reguladora activa a expressão do gene alcA. a proteína reguladora também estimula a sua própria expressão na presença de indutor. Isto significa que são produzidos níveis elevados da enzima ADHI sob condições indutoras (i.e. quando estão presentes álcool ou cetona). Pelo contrário, o gene alcA e o seu produto, ADHI, não são expressos na ausência de indutor. A expressão de alcA e a produção da enzima são também reprimidas na presença de glucose.

Assim, o promotor do gene alcA é um promotor indutível, activado pela proteína reguladora alcR, na presença de indutor (i.e. pela combinação proteína/álcool ou proteína/cetona).

Os genes alcR e alcA (incluindo os promotores respectivos) foram clonados e sequenciados (Lockington RA et al., 1985, Gene, 33:137-149; Felenbok B et al., 1988, Gene, 73:385-396; Gwyne et al., 1987, Gene, 51:205-216).

Os genes da álcool desidrogenase (adh) foram investigados nalgumas espécies de plantas. No milho e outros cereais, são ligados por condições anaeróbicas. A região promotora dos genes adh do milho contém um elemento regulador de 300 pb necessário 5 para a expressão sob condições anaeróbicas. No entanto, não se encontrou nenhum equivalente da proteína reguladora alcR em nenhuma planta. Assim, o sistema regulador do tipo de gene alcR/alcA não é conhecido em plantas. A expressão constitutiva de alcR em células de plantas não resulta na activação da actividade endógena de adh. O conhecimento dos mecanismos pelos quais a expressão genética é regulada em eucariotas é muito menos detalhado do que o conhecimento de sistemas bacterianos. Nas células de levedura e de mamífero foram identificados, em sequências promotoras, um grande número de locais de ligação para proteínas reguladoras putativas e, nalguns casos, as proteínas responsáveis também foram isoladas. No entanto, apenas nalguns são conhecidos os pormenores moleculares das interacções proteína-ADN e o mecanismo pelo qual a transcrição é regulada. Nas plantas, a regulação da expressão genética é entendida apenas a um nível rudimentar. Foram identificados alguns elementos reguladores em sequências promotoras e algumas proteínas reguladoras foram analisadas a um nível preliminar. Muitas destas proteínas terão ainda de ser isoladas e os pormenores dos mecanismos envolvidos terão ainda que ser analisados. 0 controlo da expressão de genes heterólogos em tecidos de plantas é importante para uma manipulação genética de sucesso, de plantas, para alterar e/ou melhorar características fenotípicas. Têm-se utilizado promotores e/ou componentes reguladores de bactérias, vírus, fungos e plantas para controlar a expressão de genes em células de plantas. Por exemplo, têm sido utilizados dois sistemas operador-repressor bem caracterizados, para mostrar a regulação negativa ("down") 6 da expressão de genes em células de plantas. Verificou-se que um sistema operador-repressor tet bacteriano, modificado, reprime a expressão genética em células de plantas tratadas por electroporação. A expressão genética do gene CAT foi reduzida, colocando operadores tet no promotor 35S (Gatz e Quail, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:1394-1397). 0 repressor tet funcional expresso a partir de um gene integrado também reprime a expressão de um gene de β-glucoronidase integrado (gus), conduzido pelo promotor 35S que contém dois operadores tet inseridos (Gatz et al, 1991, Mol. Gen. Genet, 227:229-237). 0 sistema operador-repressor lac tem sido utilizado para reprimir a expressão de genes em células de tabaco. A proteína LacI funcional, expressa a partir de um gene lacl integrado de forma estável reprimiu a expressão de um gene gus integrado de forma estável, controlado pelo promotor da proteína de ligação à clorofila a/b (CAB) de milho, que contém um operador lac. A des-repressão da actívidade de gus ocorreu quando as células foram incubadas com o indutor iso-propíl tiogalactósido (IPTG), o que mostra que a repressão da actívidade do gene é especificamente devida ao produto do gene lacl (Wilde RJ et al; 1992, EMBO J, 11:1251-1259).

Schena et al (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol 88, 1991, pp 10421-10425) descreve um sistema de expressão genética indutível por esteróides, para células de plantas, em que se utilizam hormonas esteróides de mamífero como indutores selectivos da expressão de genes de plantas. Um receptor de glucocorticóides, expresso em células de plantas, é capaz de activar um gene alvo ligado a elementos de resposta de glucocorticóides quando as células transfectadas são tratadas com a hormona glucocorticóide. 7 A EP-A-0 459 643 descreve uma molécula de promotor recombinante para melhorar a expressão de um gene estrutural expressável em plantas, numa célula de planta monocotiledónea, que compreende uma pluralidade de elementos potenciadores, seleccionados de elementos ARE e OCS, um promotor expressável em plantas, truncado, e um intrão. Não há referência ou sugestão sobre a cassete de expressão de genes de plantas, indutível quimicamente.

Como referido acima, uma manipulação genética de sucesso depende da disponibilidade de meios para controlar a expressão genética, como necessário. 0 cientista pode utilizar uma cassete de expressão adequada (incorporando um ou mais promotores e outros componentes), para regular a expressão de genes do modo desejado. A capacidade de aumentar, ou reduzir, a expressão genética para alcançar um efeito fenotípico desejado, de acordo com circunstâncias externas é particularmente vantajoso. Os requerentes propõem agora uma nova cassete de expressão de genes de plantas que permite a activação externa da expressão de genes alvo em plantas.

De acordo com um primeiro aspecto, a invenção proporciona uma cassete de expressão de genes de plantas quimicamente indutível, que compreende um primeiro promotor ligado de forma operacional à sequência reguladora alcR, obtida a partir de Aspergillus nidulans, que codifica para a proteina reguladora ALCR e um promotor indutível, ligado de forma operacional a um gene alvo, em que o promotor indutível é activado pela proteína reguladora na presença de um indutor exógeno eficaz, em que a aplicação do indutor leva à expressão do gene alvo. O primeiro promotor pode ser constitutivo, ou especifico de tecido, programado a nível do desenvolvimento ou mesmo indutível. 0 promotor indutível é de preferência o promotor do gene alcA, que se pode obter a partir de Aspergillus nidulans, ou um promotor "quimérico", derivado a partir de sequências reguladoras do promotor de alcA e a região promotora nuclear de um promotor genético que opera em células de plantas (incluindo qualquer promotor genético de plantas). 0 promotor de alcA, ou um promotor "quimérico" relacionado, é activado pela proteína reguladora ALCR, quando se aplica um indutor álcool ou cetona . 0 promotor indutível pode também ser derivado do promotor do gene aldA, do promotor do gene alcB ou do promotor do gene alcC, obtido de Aspergillus nidulans. 0 gene alvo pode ser um gene de planta endógeno ou um gene estranho e pode ser um único gene ou uma série de genes. A sequência de gene alvo codifica para pelo menos parte de uma proteína funcional ou uma sequência de sentido inverso. 0 promotor indutível pode ser qualquer químico eficaz (tal como um álcool ou cetona). Os químicos adequados para utilização com uma cassete derivada de alcA/alcR incluem os enumerados por Creaser et al. (1984, Biochem J, 225, 449-454), tal como butan-2-ona (etil metil cetona), ciclohexanona, acetona, butan-2-ol, ácido 3-oxobutírico, propan-2-ol, etanol. A cassete de expressão genética responde a um indutor químico, exógeno, aplicado, permitindo a activação externa da expressão do gene alvo regulada pela cassete. A cassete de 9 expressão é altamente regulada e adequada para utilização geral em plantas.

As duas partes da cassete de expressão podem estar na mesma construção, ou em construções separadas. A primeira parte compreende o ADNc regulador, ou sequência genética, subclonada num vector de expressão com um promotor operacional em plantas, que conduz a sua expressão. A segunda parte compreende pelo menos parte de um promotor indutível, que controla a expressão de um gene alvo a jusante. Na presença de um indutor adequado, a proteína reguladora produzida pela primeira parte da cassete irá activar a expressão do gene alvo por estimulação do promotor indutível, na segunda parte da cassete.

Como um exemplo da invenção, construiu-se uma cassete de expressão genética, compreendendo o gene alcR de Aspergillus nidulans sob o controlo de um promotor constitutivo e um promotor "quimérico” indutível alcA: 35S, ligado ao gene de cloramfenicol acetil transferase (CAT) de E. coli. As construções que representam as duas partes desta cassete de expressão foram testadas em Aspergillus nidulans. Por exemplo: (1) Um ADNc de alcR foi expresso em A nidulans colocando-o a jusante do promotor 35S ou nos de CaMV. Verificou-se que os transformantes de uma estirpe alcR’ eram do tipo selvagem (alcR+), em relação ao crescimento em etanol como única fonte de carbono, mostrando que a construção alcR estava a expressar a proteína reguladora. (2) Testou-se uma construção contendo um gene CAT a jusante do promotor "quimérico" alcA: 35S numa estirpe de A nidulans (alcR+) . Utilizou-se o gene CAT como gene alvo, pois este 10 é um gene repórter adequado para a monitorização da expressão genética. A actividade de CAT era indutivel por álcool (i.e. a proteína repressora mais o indutor estavam a activar o promotor "quimérico"), mostrando que o promotor "quimérico" é funcional. (3) A construção reguladora alcR e a construção repórter alcA foram co-transformadas numa estirpe de delecção alcR~A~. Qualquer expressão do gene repórter CAT é induzida pela proteína reguladora alcR produzida pela construção reguladora, sem interferência de uma proteína reguladora do tipo selvagem. 0 promotor quimérico alcA:35S pode ser induzido: o promotor conduz a expressão do gene repórter CAT quando a proteína reguladora e o indutor estão presentes. Assim, a cassete de expressão genética (compreendendo as construções alcR e alcA) é funcional e quimicamente indutivel (i.e. sujeita a activação externa). A presente invenção baseia-se na construção do tipo de cassete de expressão acima descrito e no reconhecimento, por parte dos requerentes, de que os elementos funcionais da cassete são adequados para aplicação noutros organismos, particularmente em plantas (tais como tabaco, tomate, canola, beterraba, girassol, milho ou trigo).

Na prática, a construção, ou construções, que compreendem a cassete de expressão da invenção serão inseridas numa planta por transformação. A expressão de genes alvo na construção, estando sob o controlo de um promotor accionável quimicamente, de acordo com a invenção, pode ser então activada pela aplicação de um indutor químico à planta. 11

Pode-se utilizar qualquer método de transformação adequado para a planta alvo, ou células de planta, incluindo infecção por Aqrobacterium tumefaciens contendo plasmideos Ti recombinantes, electroporação, microinjecção de células e protoplastos, transformação de microprojécteis e transformação de tubos de pólen. As células transformadas podem então, quando adequado, ser regeneradas em plantas totais, em que o novo material nuclear é incorporado de forma estável no genoma. Podem-se obter, deste modo, ambas as plantas monocotiledóneas e dicotiledóneas, transformadas.

Exemplos de plantas geneticamente modificadas que podem ser produzidas, incluem plantações, cereais, frutos e vegetais, tais como: canola, girassol, tabaco, beterraba, algodão, soja, milho, trigo, centeio, arroz, sorgo, tomates, mangas, pêssegos, maçãs, peras, morangos, bananas, melões, batatas, cenoura, alface, couve, cebola. A invenção proporciona ainda uma célula de planta contendo uma cassete de expressão genética de acordo com a invenção. A cassete de expressão genética pode ser incorporada de forma estável no genoma da planta, por transformação. A invenção proporciona também um tecido de planta ou uma planta compreendendo estas células e plantas, ou sementes derivadas destas. A invenção proporciona ainda um método para controlar a expressão de genes de plantas, compreendendo a transformação de uma célula de planta com uma cassete de expressão de genes de plantas, quimicamente indutível, que tem um primeiro operador, ligado de forma operacional à sequência reguladora alcR, obtida a partir de Aspergillus nidulans, que codifica para a proteína 12 reguladora ALCR, e um promotor indutível, ligado de forma operacional a um gene alvo, em que o promotor indutível é activado pela proteína reguladora, na presença de um indutor exógeno eficaz, em que a aplicação do indutor leva à expressão do gene alvo.

Como exemplo da invenção, os requerentes demonstraram o funcionamento de construções alcR/alcA em células de plantas e mostraram que o sistema é útil como uma cassete de expressão de genes de planta, indutível. As construções reguladora e repórter foram transformadas, separadamente e em conjunto, em protoplastos de milho, para testes de expressão genética transiente. A expressão do gene CAT a partir do promotor alcA em protoplastos de milho, incubados na presença de etanol (indutor), é dependente da presença do gene alcR (que expressa a proteína reguladora). Também se produziram plantas de tabaco transformadas de forma estável, que contêm a cassete de expressão alcR/alcA-CAT. Apenas se obtiveram níveis elevados de expressão do gene repórter (CAT) na presença do produto do gene regulador alcR e após indução química por ciclohexanona. Não se obtiveram níveis elevados de actividade a partir da construção de gene repórter alcA-CAT numa gama de condições de crescimento, tais como anaerobiose, indicando que a expressão do gene repórter não era indutível por condições que se poderia esperar, normalmente, que induzissem álcool desidrogenases de plantas. A parte de promotor indutível que faz parte da cassete de expressão genética de acordo com a invenção, pode ser uma sequência de promotor "quimérico", criada como acima descrito, por fusão de regiões heterólogas a montante e a jusante. Um promotor quimérico deste tipo pode ter uma utilidade 13 independente como promotor de plantas alternativo para utilização em manipulações genéticas. Comai et al. descreveram previamente um promotor de plantas quimérico que combina elementos dos promotores de CaMV 35S e manopina sintetase (mas) (1990, Plant Mol Biol, 15:373-381). Em células de tabaco tratadas por electroporação, verificou-se que a proteína GAL4 de levedura estimula a expressão do gene CAT controlada a partir de um promotor de 35S, que tinha locais de ligação a GAL4 a montante da caixa TATA (Ma J et al, 1988, Nature, 334:631-633).

De acordo com um terceiro aspecto da invenção, proporciona-se um promotor quimérico, que compreende uma região a montante que contém uma sequência reguladora promotora, que se pode obter a partir do promotor do gene alcA de Aspergillus nidulans e uma região a jusante, que contém uma sequência de iniciação da transcrição, caracterizada por as regiões a montante e a jusante serem heterólogas e por o promotor ser quimicamente indutível. A região a montante pode conter uma sequência reguladora, promotora, constitutiva, especifico de tecido, programado a nível de desenvolvimento ou indutível. Pode haver uma ou mais sequências reguladoras na região a montante. A região a jusante é uma região promotora nuclear. As regiões a montante e a jusante correspondem a sequências isoladas, respectivamente, de fontes diferentes. As regiões a montante e a jusante estão fundidas uma à outra. As regiões a montante e/ou a jusante podem ser sintetizadas. A sequência a montante é derivada, de preferência, a partir do promotor do gene alcA indutível, que se pode obter a 14 partir de Aspergillus nidulans. A sequência a montante pode também ser derivada a partir dos promotores dos genes aldA, alcB ou alcC, qe se podem obter de Aspergillus nidulans. A sequência a jusante pode ser derivada a partir da região promotora nuclear de qualquer promotor operacional em plantas (tal como o promotor CaMV 35S, MFS14, MFS18, GSTII-27, pMR7, promotores de poligalacturonase) ou pode ser sintetizado, a partir de sequências de consenso. 0 promotor quimérico pode ser ligado de forma operacional a uma ou mais sequências de genes alvo, que codificam para pelo menos parte de uma proteína funcional, ou ARN de sentido inverso. 0 gene alvo pode ser qualquer gene de planta endógeno ou qualquer gene estranho.

Na prática, o promotor da invenção será inserido como uma sequência promotora numa construção de genes recombinante, destinada para ser utilizada em plantas. A construção será então inserida numa planta, por transformação. Qualquer espécie de planta pode ser transformada com a construção e pode-se utilizar qualquer método de transformação adequado. A invenção proporciona ainda uma célula de planta que contém um promotor quimérico de acordo com a invenção. 0 promotor quimérico pode ser incorporado de forma estável no genoma da planta, por transformação. A invenção proporciona também um tecido de planta, ou uma planta compreendendo estas células e plantas, ou sementes derivadas a partir destas.

Como exemplo da invenção, produziu-se uma sequência promotora de genes, quimérica, fundindo a região reguladora do promotor do gene alcA de Aspergillus nidulans a parte da região 15

nuclear -70 do promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor (CaMV) (veja-se Exemplo 2 e Figura 3) . A sequência promotora quimérica alcA:35S foi ligada ao gene de cloranfenicol acetil transferase (CAT)de E. coli e transformada numa estirpe de A nidulans (alcR+) . O gene CAT foi utilizado como um gene repórter para monitorizar a expressão genética. A produção de CAT indicou que o promotor quimérico estava a funcionar correctamente (veja-se Exemplo 3). O promotor quimérico alcA: 35S também é adequado para utilização em plantas. Os testes de expressão transiente em protoplastos de milho (Exemplo 4) e a expressão de genes incorporados de forma estável em tabaco (Exemplo 5), mostraram que o promotor alcA:35S está totalmente funcional em células de plantas. A invenção será em seguida descrita a título de exemplo, apenas com referência as figuras, em que: A Figura 1 mostra um esquema para a produção de uma construção reguladora 35S. A Figura 2 mostra um esquema para a produção de uma construção reguladora pNOS. A Figura 3 mostra a produção da construção repórter. A Figura 4 é um gráfico que mostra a expressão de CAT a partir de transformantes alcA-CAT de A nidulans. A Figura 5 é um gráfico que mostra a expressão de CAT a partir de um transformante alcA-CAT de A nidulans, em função da concentração de ciclohexanona. A Figura 6 é um gráfico que mostra a expressão de CAT a partir de um transformante alcA-CAT de A nidulans e um transformante 35S-CAT. 16

A Figura 7 é um gráfico que mostra os níveis relativos de expressão de CAT em protoplastos de milho. A Figura 8 é um gráfico que mostra os níveis relativos de expressão de CAT em protoplastos de milho. A Figura 9 é um gráfico que mostra os níveis relativos de expressão de CAT em tabaco transformado de forma estável. EXEMPLO 1

PRODUÇÃO DA CONSTRUÇÃO REGULADORA alcR A sequência de ADN genómico alcR já foi publicada, permitindo o isolamento de uma amostra de ADNc de alcR. O ADNc de alcR foi clonado em dois vectores de expressão diferentes, pJRl (pUC) e pNOS. O pJRl contém o promotor 35S do vírus de mosaico de couve-flor e o pNOS contém o promotor do gene nos do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaclens. Ambos os promotores são promotores de plantas constitutivos e irão expressar continuamente a proteína reguladora. 0 sinal de poliadenilação nos é utilizado em ambos os vectores de expressão. A Figura 1 ilustra a produção da construção reguladora 35S por ligação de ADNc de alcR em pJRl. A restrição parcial do clone de ADNc de alcR com BamHI foi seguida por electroforese em gel de agarose e excisão e purificação de um fragmento de 2,6 Kb. 0 fragmento foi em seguida ligado no vector pJRl, que tinha sido cortado com as enzimas de restrição BamHI e fosfatado, para impedir a recircularização. 0 gene alcR foi assim colocado sob o controlo do promotor 35S de CaMV e o sinal de poliadenilação 3' nos, nesta construção "35S-alcR". 17 A Figura 2 ilustra a produção da construção reguladora pNOS por ligação do ADNc de alcR em pNOS. A restrição do clone de ADNc alcR com EcoRI e Sall foi seguida por electroforese e excisão e purificação de um fragmento de 2,8 Kb. O vector pNOS foi cortado com as enzimas de restrição EcoRI e Xhol, fosfatado e em seguida ligado ao fragmento de alcR de 2,8 Kb. 0 gene alcR foi então colocado sob o controlo do promotor do gene nos e o sinal de poliadenilação 3’ nos nesta construção "nos-alcR". EXEMPLO 2

PRODUÇÃO DA CONSTRUÇÃO REPÓRTER alcA-CAT CONTENDO O PROMOTOR QUIMÉRICO 0 plasmídeo pCaMVCN contém o gene repórter de cloranfenicol transferase (CAT) bacteriana entre o promotor 35S e o terminador de transcrição nos (construção "35S-CAT"). 0 promotor alcA foi sub-clonado no vector pCaMVCN para produzir uma construção "alcA-CAT". A fusão de parte do promotor alcA e parte do promotor 35S originou um promotor quimérico, que permite a expressão de genes sob o seu controlo. A figura 3 ilustra a produção da construção repórter. 0 promotor alcA e o promotor 35S tem caixas TATA idênticas, que são utilizadas para ligar os dois promotores um ao outro, utilizando uma técnica de PCR recombinante: uma região de 24 6 pb do promotor alcA e a extremidade 5 ' do gene CAT de pCaMVCN (contendo parte da região nuclear -70 do promotor 35S) foram amplificadas em separado e em seguida cortadas e rearranjadas ("spliced") uma com a outra, por PCR. O fragmento recombinante 18

foi então digerido com as enzimas de restrição BamHI e HindIII. 0 vector pCaMVCN foi parcialmente digerido com BamHI e HindIII, em seguida corrido em electroforese, de modo a que o fragmento correcto pudesse ser isolado e ligado com o fragmento recombinante.

As misturas de ligação foram transformadas em E. coli e plaqueadas em meio de agar rico. 0 ADN de plasmídeo foi isolado por miniprep a partir das colónias resultantes e os clones recombinantes foram recuperados por electroforese em função do tamanho e mapeamento de restrição. As junções de ligação foram sequenciadas, para verificar que os recombinantes correctos tinham sido recuperados. EXEMPLO 3

EXPRESSÃO EM ASPERGILLUS NIDULANS

As construções alcR e alcA completas foram transformadas em A. nidulans, para testar o seu funcionamento. A integração das construções no genoma é verificada por transferência de manchas Southern de fragmentos de ADN, enquanto que a expressão correcta é verificada por transferência de manchas Northern, para identificar os transcritos de ARN.

Condições de crescimento 0 A. nidulans foi mantido em meio completo ou minimo contendo agar a 1%. Os micélios de A nidulans foram crescidos a partir de suspensões de conidios em meio minimo suplementado, com glucose a 1% como fonte de carbono e tartarato de amónio 10 mM como fonte de azoto, durante 16 horas, a 200 revs/min num 19 incubador orbital a 37 °C. Os micélios foram recolhidos por crivagem através de um tecido de nylon e lavagem com água destilada fria. Os micélios foram secos por prensagem entre folhas de papel absorvente e congelados em azoto líquido. Os micélios podem ser armazenados a -70 °C, se necessário.

Transformação de A nidulans O processo de transformação de A nidulans foi desenvolvido a partir dos métodos de Ballance e Turner (1983) e Cambell EJ et al. (1989, Curr. Genet, 16:53-56). Os plasmideos foram transformados em estirpes de A nidulans pelo método de co-transformação. Utilizou-se um plasmídeo contendo o gene argB ou o gene N crassa pyr4, para complementar a mutação argB2 ou pyrG89 em A nidulans. Os transformantes foram obtidos seleccionando os protoplastos transformados em meio mínimo, sem os suplementos argB ou pyr4. Adicionando um excesso de cinco vezes de outro plasmídeo com o plasmídeo de complementação, obtiveram-se alguns transformantes que também continham uma cópia genómica do outro plasmídeo. Colocaram-se discos de celofane de 9 cm de diâmetro, em placas de petri de meio completo. Fez-se uma suspensão de conídios raspando 1 cm2 de conídios de uma placa de A nidulans confluente, fresca e resuspendendo em 3 ml de água destilada. A suspensão de conídios foi espalhada em 10 placas de celofane, 200 μΐ por placa e incubada a 37 °C durante 15 horas, até os poros terem germinado. Os celofanes foram transferidos para duas placas de petri, contendo cada uma 15 ml de solução de novozima 234 (5 mg/ml de novozima 234 em MgS0<i 0,8 M, tampão PO4 10 mM pH 5,8) e incubada a 30 °C durante 1,5-2 horas. Os celofanes foram lavados em 30 ml de solução A (MgSOí 0,8 M em tampão PO4 10 mM pH 5,8) e a solução de lavagem e a solução de novozima foram 20

crivadas através de um funil de cintilação de vidro, tamanho 1. Os protoplastos foram centrifugados a 3000 revs/min, durante 10 minutos e ressuspendidos em 6 ml de solução B (sorbitol 1,2 M, CaCl2 50 mM, Tris 10 mM pH 7,5). Os protoplastos foram centrifugados a 2500 revs/min, durante 5 minutos e ressuspendidos em 6 ml de solução B e em seguida centrifugados a 2500 revs/min, durante 5 minutos. O pelete de protoplastos foi então ressuspendido em 400 μΐ de solução B. Transferiram-se alíquotas de 50 μΐ da suspensão de protoplastos para "bijou’s" de plástico e adicionou-se até 5 mg de ADN de plasmídeo (1 mg/ml) . A razão de plasmídeos transformados era de 5:1 (i.e. utilizaram-se cinco vezes mais de plasmídeo de interesse em relação ao plasmídeo transformante). Adicionaram-se 12,5 μΐ de solução C (PEG 4000 a 50%, CaCl2 50 mM, Tris 10 mM, pH 7,5) a cada "bijou" de protoplastos e a suspensão foi misturada suavemente. As células foram incubadas em gelo durante 20 minutos e em seguida adicionaram-se 0,5 ml de solução c e misturou-se com as células. Imediatamente, adicionou-se 1 ml de solução B e as células foram misturadas com 5 ml de meio de selecção pré-arrefecido (55 °C) contendo sorbitol 1,2 M e nitrato de sódio 10 mM como única fonte de azoto. Adicionou-se uma alíquota de protoplastos não transformados a meio de selecção, como controlo. Os protoplastos foram incubados a 30 °C durante a noite, em seguida a 37 °C durante 2-3 dias até se obterem colónias com formação de conidios. Antes das experiências, testaram-se as colónias transformadas quanto aos seus marcadores, em meios selectivos.

Indução de micélios de A nidulans

Cresceram-se suspensão de conidios de A nidulans em meio mínimo suplementado, contendo fructose a 1% como fonte de 21

carbono, durante 20 horas, a 200 revs/min, num incubador orbital, a 37 °C. Adicionou-se um químico indutor aos micélios após 20 horas e deixou-se crescer durante mais 4 horas. Os micélios foram recolhidos como anteriormente. Deixaram-se crescer os micélios não induzidos durante 24 horas no meio acima descrito.

Extracçdes de proteína a partir de micélios de A nidulans

Moeram-se 300 mg de micélios, congelados em azoto líquido, num almofariz arrefecido, com uma quantidade igual de areia lavada com ácido, durante 20 segundos. Adicionou-se 1 ml de tampão de extracção (Tris 0,1 M pH 7,5) e os micélios foram moídos por mais 30 segundos. Adicionou-se mais 1 ml de tampão de extracção e os micélios foram moídos mais uma vez durante 30 segundos. Transferiu-se 1 ml de mistura de micélios moídos para eppendorfs e centrifugou-se a 13.000 revs/min, durante 5 minutos, numa microcentrífuga. 0 sobrenadante foi transferido para novos eppendorfs e a concentração de proteína foi estimada utilizando o teste de Bradford.

Extracção de ADN a partir de micélios de A nidulans

Moeram-se 300 mg de micélios num almofariz pré-arrefecido em azoto líquido, até se obter um pó fino. Os micélios foram transferidos para um tubo corex de 30 ml contendo 7 ml de tampão de extracção de ADN e em seguida adicionaram-se 7 ml de fenol e misturou-se. Adicionaram-se 7 ml de clorofórmio:iaa e a mistura de extracção foi agitada suavemente durante 10 minutos. A mistura foi centrifugada a 14.000 revs/min durante 30 minutos e em seguida o sobrenadante foi cuidadosamente transferido para vários tubos eppendorf de 1,5 ml. 0 sobrenadante foi extraído 22 com um volume iqual de fenol, em seguida fenol/clorofórmio, e em seguida clorofórmio. Adicionaram-se 100 μΐ de ARNase tratada pelo calor (5 mg/ml) e incubou-se a 37 °c durante 30 minutos. Adicionaram-se dois volumes de etanol e 0,1 volumes de acetato de sódio 3M e misturou-se e incubou-se à temperatura ambiente durante 10 minutos. 0 ADN foi sedimentado por centrifugação a 13.000 revs/min durante 10 minutos numa microcentrífuga e em seguida lavados em etanol a 70% e secos à temperatura ambiente durante 30-60 minutos, 0 ADN foi dissolvido de novo em TE ou água destilada estéril a uma concentração de 1 mg/ml.

RESULTADOS (A) Construções reguladoras (alcR)

As experiências demonstraram que as construções reguladoras de alcR funcionam em A nidulans. Os promotores constitutivos conduzem a expressão do gene alcR para produzir a proteína reguladora.

As construções de alcR foram transformadas na estirpe A nidulans alcR125 (alcR~A+), utilizando as técnicas convencionais, acima descritas. A estirpe alcR125 é uma estirpe mutante nula, que transporta uma mutação pontual em alcR e não consegue expressar a proteína reguladora. A expressão do gene alcR introduzido na construção reguladora foi testada, analisando α álcool desidrogenase I (ADH1), uma vez que se sabe que o produto do gene alcR liga o gene alcA que codifica para ADH1. A actividade de ADH1 foi recuperada na presença de indutor, demonstrando que a construção reguladora alcR estava funcional em A nidulans. 0 produto do gene alcR pode ser também 23

testado directamente por transferência de manchas Western de proteínas, utilizando anticorpos produzidos contra o produto do gene alcR purificado, expresso em E. coli. A estirpe transformada foi cruzada com a estirpe progenitora, para determinar se a construção reguladora tinha sido integrada de forma heteróloga no genoma. Esta experiência demonstrou que a recuperação da actividade de ADH1 era devida à presença da construção reguladora e não à reversão da mutação pontual em alcR125. Como comparação controlo, o ADNc alcR foi transformado em A nidulans sem um promotor associado.

Outros pormenores destas experiências são dados a seguir. (i) Transformação de alcR125 A nidulans com a construção reguladora de ADNc de alcR; 0 alcR125, estirpe argB2 de A nidulans foi co-transformado com os plasmídeos p35SalcR/pUC e pILJ16 utilizando o método PEG. 0 plasmídeo p35SalcR/pUC contém o ADNc de alcR entre o promotor 35S e o terminador de transcrição nos. 0 plasmideo pILJl6 contem uma cópia genómica do gene argB2 de A nidulans e pode complementar as mutações argB2 em A nidulans.

Obtiveram-se cinco transformantes de A nidulans independentes, que eram capazes de crescer a níveis do tipo selvagem, em meio contendo etanol como única fonte de carbono. A capacidade de uma estirpe crescer em meio contendo etanol é o fenótipo de um gene alcR funcional. Os transformantes variavam na sua capacidade de crescer em etanol, presumivelmente como resultado da posição genómica da construção reguladora de alcR. 24

(ii) Cruzamento das estirpes alcR+ transgénicas de A nidulans com uma estirpe do tipo selvagem alcR+

Cruzaram-se dois dos transformantes de alcR+ com um alcR+ do tipo selvagem e a descendência foi testada quanto à sua capacidade de crescer num meio contendo etanol. A estirpe de tipo selvagem alcR+ era também do tipo selvagem quanto à cor do esporo. Duzentos da descendência obtida a partir do cleistotécio maduro foram crescidos em meio contendo etanol e eram positivos quanto ao seu fenótipo alcR. A razão entre o fenótipo alcR+ e alcR- encontrada na descendência era de 3:1. A razão entre o fenótipo verde e amarelo, na mesma descendência de duzentos era de 1:1. (iii) Cruzamento das estirpes transgénicas alcR+ de A nidulans com a estirpe alcR125:

Os dois transformantes alcR+ acima descritos foram cruzados com uma estirpe alcR125 e a descendência obtida era positiva para o fenótipo alcR. A estirpe alcR125 também tinha a mutação panto. Cresceram-se duzentos descendentes em meio contendo etanol e verificou-se que exibiam uma razão entre alcR+ e alcR- de 1:1. A razão entre a mutação panto e o gene do tipo selvagem era de 1:1 (B) Promotor quimérico A produção de A nidulans do tipo selvagem transformado de forma estável com a construção repórter alcA-CAT estabeleceu que o promotor quimérico está operacional em A nidulans. 0 funcionamento do promotor quimérico de alcA introduzido na construção repórter foi testado, analisando a expressão do gene 25 CAT. A iniciação da expressão do gene CAT sob condições indutoras, demonstrou que o promotor quimérico alcA:35S estava a funcionar de forma correcta. A construção repórter alcA-CAT foi transformada numa estirpe do tipo selvagem de A nidulans (alcR'A+) . A estirpe do tipo selvagem tem um gene alcR normal, que produz a proteína reguladora necessária para a activação do promotor alcA, na presença do indutor.

Obteve-se A nidulans transformado de forma estável, por co-transformação de uma estirpe pyrG89 com os plasmídeos pDJB3 e palcA-CAT/pUC, utilizando o método PEG. 0 plasmídeo palcA-CAT/pUC contém o gene repórter CAT entre o promotor quimérico alcA: 35S e o terminador de transcrição nos. Obtiveram-se dois transformantes independentes (GA2-1 e GA2-5) que continham cópias não interrompidas da construção alcA-CAT. Isto foi demonstrado por sondagem de ADN genómico, cortado com a enzima de restrição HindiII, com o fragmento Sall de 0,7 kb, do gene CAT. A actividade de CAT dos transformantes alcA-CAT de A nidulans foi medida quando estes foram crescidos sob uma variedade de condições. A Figura 4 é um gráfico que mostra a expressão de CAT a partir dos transformantes GA2-1 e GA2-5 (tipo selvagem com a construção alcA-CAT) crescidos em frutose a 0,1% (F) ou glucose a 1% (G) na ausência ou presença de etil metil cetona 50 mM como indutor (I). Verificou-se que a actividade de CAT da construção repórter alcA-CAT nas estirpes de A nidulans transformadas era elevada, apenas quando os transformantes eram crescidos em frutose a 0,1% e na presença de indutor. A indução de CAT era impedida quando os 26 mesmo na transformantes eram crescidos em glucose a 1%, presença de indutor, indicando que a função de repressão de catabolitos de carbono do promotor alcA tinha sido retida. Os dois transformantes GA2-1 e GA2-5 exibiam diferentes capacidades de indução de CAT, muito provavelmente devido às diferentes posições genómicas das construções repórter alcA-CAT.

Verificou-se que o transformante GA2-1 era mais de três vezes mais indutivel que o transformante GA2-5, quando se utilizava etil metil cetona 50 mM como indutor. Verificou-se que a ciclohexanona induzia a expressão de CAT no transformante GA2-1. Uma curva de concentração mostrou que a ciclohexanona tinha uma capacidade indutora óptima no transformante GA2-1, quando utilizada a 25 mM. A Figura 5 é um gráfico que mostra o efeito da concentração de ciclohexanona (mM) na expressão de CAT no transformante GA2-1, crescido em frutose a 0,1 %(F), ou glucose a 1% (G).

Também se obteve A nidulans transformado de forma estável por co-transformação do plasmídeo pCaMVCN (construção 35S-CAT) com o plasmídeo pDJB3 na estirpe do tipo selvagem, utilizando o método PEG. O plasmídeo pDJB3 contém o gene pyr4 de N crassa, que complementa a mutação pyrG89 em A nidulans. Obteve-se um transformante de A nidulans independente (GCMV-11), que se verificou conter a construção 35S-CAT na forma não interrompida, quando se sondou o ADN genómico, cortado com a enzima de restrição HindIII, com o fragmento Sall de 0,7 kb do gene CAT, numa hibridação Southern. A digestão do ADN genómico com Xhol e hibridação com o fragmento Sall de 0,7 kb do gene CAT, revelou múltiplas cópias da sequência 35S-CAT no transformante. A função do promotor 35S foi testada medindo a 27 expressão de CAT obtida a partir do transformante 35S-CAT de A nidulans♦ A Figura 6 é um gráfico que mostra a expressão de CAT a partir do transformante GA2-5 (tipo selvagem com construção alcA-CAT) e o transformante GCMV-11 (tipo selvagem com a construção 35S-CAT) que crescem em frutose a 0,1% (F) ou glucose a 1% (G), na ausência ou presença de etil metil cetona 50 mM como indutor (I). Verificou-se que a expressão de CAT no transformante 35S-CAT de A nidulans ocorria a um nivel inferior ao dos transformantes alcA-CAT de A nidulans. (C) Cassete de expressão de genes

As experiências seguintes estabeleceram que a cassete de expressão de genes (compreendendo a construção reguladora alcR e a construção repórter alcA) funcionam em A nidulans. A construção alcA foi transformada sozinha na estirpe mutante de A nidulans, alc500 (alcR~A~) . Este mutante contém uma delecção que se estende para além de ambos os genes, alcR e alcA: deste modo, a proteína repórter não está naturalmente presente. Observou-se uma taxa muito baixa de expressão do gene CAT. Assim, a construção alcA não era funcional na ausência da proteína reguladora alcR. Como comparação controlo, o plasmídeo pCaMVCN (que contém o gene CAT sob o controlo do promotor constitutivo 35S de CaMV) foi transformado na estirpe de delecção de A nidulans, alc500. A construção reguladora alcR e a construção repórter alcA foram então co-transformadas na estirpe de delecção alcR~A~, alc500. Qualquer expressão do gene repórter CAT é induzida pela proteína reguladora alcR, produzida pela construção reguladora, sem interferência de uma proteína reguladora do tipo selvagem. 28

Os transformantes foram crescidos ou em frutose, ou em glucose e submetidos a condições indutoras (4 horas na presença de etil metil cetona, EMK) ou condições não indutoras (na ausência de EMK) . Os resultados dos testes de CAT são apresentados na tabela 1. TABELA 1 testes EMK FONTE DE (INDUTOR) SIM frutose NÃO frutose SIM glucose NÃO glucose

Os resultados mostram que de forma correcta sob condições expressão do gene ADH1; isto presença de indutor.

de CAT μg de CAT/mg de proteína 5,67/4,58 0,12/0,08 0,01/0,00 0,07/0,00 o gene repórter CAT é expresso que iriam normalmente induzir a é crescimento em frutose, na O crescimento em glucose resulta numa expressão fraca do gene repórter CAT. Sabe-se que a glucose reprime a expressão de ADH1 nas estirpes do tipo selvagem de A nidulans. O promotor quimérico alcA: 35S é indutível. 0 promotor conduz a expressão do gene repórter CAT quando estão presentes a proteína reguladora e o indutor. Assim, a cassete de expressão do gene (que compreende as construções alcR e alcA) é funcional e quimicamente indutível. 29

Realizaram-se estudos semelhantes utilizando uma construção com o promotor de CaMV sozinho fundido com CAT. Nestas experiências, detectaram-se níveis baixos de actividade de CAT, após crescimento em glucose e estes não foram induzidos por tratamento com indutor.

Os vectores de expressão que não possuem o gene regulador alcR foram também transformados em A nidulans com as construções alcA. Houve apenas um nível baixo de expressão do gene CAT, que mostra que este é um gene regulador que controla a expressão do gene repórter, através da acção da proteína reguladora no promotor de fusão alcA. EXEMPLO 4

EXPRESSÃO EM PLANTAS: EXPRESSÃO TRANSIENTE EM PROTOPLASTOS DE MILHO

As construções alcA-CAT e 35S-alcR foram introduzidas em protoplatos de milho para determinar a expressão de CAT em testes transientes, após a incubação na presença de etanol.

Isolamento de protoplastos de milho

Os protoplastos de milho foram preparados a partir de uma cultura em suspensão de células de Black Mexícan Sweet (BMS), utilizando o seguinte método.

As células foram recolhidas dois dias após uma sub-cultura e digeridas em solução de enzima EI (2,0% de celulase RS, 0,2% de pectolase Y23, manitol 0,5M, CaCl2 .2H20 5 mM, MES a 0,5% pH 30

5,6) . Adicionaram-se 10 ml de solução de enzima a cada grama de tecido e incubou-se durante 2 horas a 25 °C sob luz suave, com rotação cuidadosa. A mistura de digestão foi crivada sequencialmente através de crivos de 250 μιη e 38 μτη, lavando com tampão de lavagem (KC1 0, 358 Μ, NH4.NO3 1,0 mM, CaCl2.2H20 5,0 mM, KH2PO4 0,5 mM pH 4,8). Os protoplastos foram centrifugados a 700 revs/min durante 3,5 minutos e ressuspendidos duas vezes em 30 ml de tampão de lavagem. Os protoplastos foram contados utilizando um hemocítómetro Fuchs-Rosenthal. Os protoplastos foram então utilizados para testes transientes.

Introdução de ADN em protoplastos de milho 0 ADN foi introduzido nos protoplastos pelo processo de absorção de PEG. Os protoplastos foram ressuspendidos a 2 x 106/ml em meio MaMg e removeram-se aliquotas de 0,5 ml por tratamento. Os protoplastos foram submetidos a choque pelo calor a 45 °C durante 5 min, em seguida deixados arrefecer à temperatura ambiente durante 10 minutos. Adicionou-se uma quantidade padrão de ADN (a 1 mg/ml) às aliquotas de protoplastos. Adicionaram-se 25 pg de plasmídeo controlo a uma aliquota de protoplastos; a quantidade dos outros plasmídeos adicionados variava de acordo com o seu tamanho. Adicionaram-se 0,5 ml de solução PEG a 45 °C e misturou-se cuidadosamente com os protoplastos. Os protoplastos foram incubados à temperatura ambiente durante 20 minutos e em seguida adicionaram-se 5 ml de solução de KCl, 1 ml de cada vez. Os protoplastos foram incubados à temperatura ambiente durante 10-15 minutos e em seguida foram centrifugados a 700 revs/min, durante 3,5 minutos. O sobrenadante foi removido e cada amostra foi 31 ressuspendida em 1,5 ml de BMS + manitol a 9% e incubados a 25 °C no escuro, durante 22 horas.

Os protoplastos de milho foram transformados com as seguintes construções: (a) promotor CaMV35S fundido com o gene de cloranfenicol acetil transferase (35S-CAT); (b) promotor quimérico alcA: 35S, fundido com o gene CAT (alcA-CAT) ; (c) promotor 35S fundido com o gene alcR, mais a construção alcA-CAT (alcA-CAT/35S-alcR); (d) promotor 35S fundido com o intrão I de milho e o gene alcR, mais a construção alcA-CAT (alcA-CAT/35S-Il-alcR). [verificou-se anteríormente que o intrão I do gene adhl de milho (Callis et al, 1987, Genes and Development, 1:1183-1200) aumenta a expressão de vários genes em células de milho]

Cada combinação de plasmideo foi introduzida nos protoplastos em três aliquotas separadas.

Testes de expressão de CAT transiente

Após incubação durante 22 horas em meio contendo metanol 17 mM, como indutor do produto genético de alcR, os protoplastos foram recolhidos e as proteínas extraídas como se segue. 32

As amostras de protoplastos foram transferidas para eppendorfs e centrifugadas a 13.000 revs/min durante 3 minutos. Adicionaram-se 100 μΐ de Tris 0,1 M pH 7,8 e as células foram ressuspendidas utilizando uma micropipeta. Os eppendorfs foram agitados num vortex durante 30 segundos e em seguida centrifugados mais uma vez a 13000 revs/min durante 5 minutos. Utilizaram-se 5 μΐ de sobrenadante para medir a actividade de CAT e o resto para estimar a concentração de proteína, utilizando o método de Bradford. A actividade de CAT foi medida em amostras do extracto de proteína. Os testes de CAT foram realizados de acordo com o método de Dupont, em que se utiliza um contador de cintilações para medir a transferência de [14C]acetil cloranfenicol do extracto de proteína para um fluido de cintilação imiscível, ao longo do tempo.

Colocaram-se 50 μΐ de extracto de proteína num frasco de cintilação de plástico, descartável, juntamente com 200 μΐ de cloranfenicol 1,25 mM em Tris 100 mM pH 7,8 e 0,1 pci de [14C]acetil CoA. Colocou-se uma camada de 5 ml de econoflúor (950 ml/L de tolueno e 50 ml/1 cint 7), cuidadosamente sobre a mistura reaccional e os frascos foram rolhados. Os frascos foram contados (cpm) sequencialmente num contador de cintilação, durante 30 segundos, durante um período de 1-2 horas. Os valores de cpm das amostras foram representados graficamente em função do tempo e o gradiente foi tomado como medida da actividade de CAT na amostra. As concentrações de proteína das amostras foram medidas utilizando o método de Bradford. As actividades de CAT das amostras foram expressas como 14-[C]-acetil cloranfenicol produzido por minuto, por mg de proteína. 33

RESULTADOS

Os dados desta experiência são apresentados na Figura 7. A expressão de CAT é dada como uma percentagem da actividade de CAT observada em células transformadas com a construção 35S-CAT (produção de CAT sob o controlo de um promotor constitutivo). A actividade de CAT da construção 35S-CAT foi expressa como 100%, de modo a comparar resultados de lotes separados de protoplastos. Também se apresenta a expressão a partir de protoplastos não transformados.

As células que contêm a construção de alcA-CAT sozinha apresentaram um nivel de actividade de CAT semelhante ao presente em células controlo que não contêm ADN (protoplastos não transformados) .

As células que contêm as construções alcA-CAT e as construções reguladoras (35S-alcR e 35S-Il-alcR) apresentam níveis de expressão de CAT que são 7 vezes e 16 vezes maiores, respectivamente, do que o das células que contêm apenas o gene alcA-CAT. Isto estabelece que a expressão do gene CAT a partir do promotor alcA:35S em protoplastos de milho incubados em meio contendo etanol 17 mM (como indutor) é dependente da presença do gene alcR. Também há um aumento aparente na expressão de CAT na presença da construção 35S-Il~alcR, presumivelmente devido a um nível maior de expressão de alcR, mediada pela inclusão do intrão I de milho. A construção 35S-Il-alcR aumenta a expressão de CAT a partir da construção alcA-CAT de 13% para 31%, em relação à da construção 35S-CAT.

Outras experiências com protoplastos de milho mostraram que a cassete de expressão de genes de plantas está a funcionar

O 34 correctamente. Por exemplo, a Figura 8 é um gráfico que mostra o efeito da construção reguladora 35S-alcR na expressão de CAT a partir da construção alcA-CAT, na presença de etanol 17 mM. Utilizou-se uma construção 35S-I1-CAT como controlo positivo nesta experiência. EXEMPLO 5

EVOLUÇÃO NO TEMPO DA EXPRESSÃO NUMA PLANTA DE TABACO TRANSFORMADA DE FORMA ESTÁVEL

Construção de vectores de transformação de tabaco

Produziram-se derivados de Binl9 da construção alcA-CAT e 355-alcR/alcA-CAT, utilizando processos convencionais. O Binl9 é um vector de transformação de plantas conhecido (Bevan, 1984, Nucleic Acids Research 12, 8711-8721). O plasmídeo palcA-CAT/BIN contém o gene repórter CAT entre o promotor quimérico alcA: 35S e o terminador de transcrição nos Este foi construído como se segue: o fragmento HindiII de 1,4 kb do plasmídeo alcA-CAT/pUC (contendo o promotor de fusão alcA:35S, o gene CAT e o terminador de transcrição nos) foi clonado no local de HindIII do vector pJRli/BIN19. As colónias transformadas foram transferidas para uma membrana de nylon e sondadas com a sequência alcA-CAT. Verificou-se que as colónias positivas eram correctas, quando o ADN de plasmídeo miniprep digerido com HindIII originou um fragmento de 1,4 kb. 0 plasmídeo p355alcR-alcA-CAT/BIN contém o ADNc de alcR entre o promotor 35S e o terminador de transcrição nos e o gene 35

repórter CAT entre o promotor quimérico alcA:355 e o terminador de transcrição nos. Este foi construído como se segue: o plasmídeo 35S-alcR/pUC foi totalmente digerido com HindiII e parcialmente digerido com EcoRI. 0 fragmento de 3,5 kb foi isolado e clonado no vector pJRli/BIN19, que tinha sido cortado com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII. O fragmento HindIII de 1,4 kpb contendo a sequência alcA-CAT de palcA-CAT/pUC foi então clonado no local de HindIII no plasmídeo 35S-alcR/JRli/BIN. Verificou-se que o plasmídeo correcto continha o fragmento HindIII de 1,4 kpb da sequência alcA-CAT e os fragmentos EcoRI de 8,0 kpb e 0,5 kpb da sequência 35S-alcR. Foi possível observar um fragmento EcoRI/HindIII parcial de 3,5 kpb nos mesmos fragmentos digeridos. A orientação da sequência alcA-CAT em relação à sequência 35A-alcR no plasmídeo final é estimada como sendo cabeça-cauda.

Transformação de Agrobacterium tumefaciens A estirpe de Agrobacterium tumefaciens desarmada, LBA4404 (pAL4404) (Hoekema et al, 1983, Nature 303, 179-180) foi transformada com os vectores acima descritos, utilizando o método de congelação-descongelação. Cresceu-se uma única colónia em 40 ml de meio LB a 28 °C num incubador orbital, a 200 revs/min, durante a noite, até a cultura atingir uma DOseo de 0,5-1,0. As células foram ressuspendidas em 1 ml de solução CaClí arrefecida em gelo e em seguida colocados em eppendorfs pré-arrefecidos, 100 μΐ por tubo. Adicionou-se ADN às células, a 0,1 μg/100 μΐ de cólulas, e em seguida as células foram congeladas em azoto líquido. As células foram então descongeladas a 37 °C num banho de água durante 5 minutos. Adicionou-se 1 ml de meio LB a cada tubo e as células foram incubadas a 28 °c durante 2-4 horas com agitação suave, para 36 permitir que as bactérias expressem os genes de resistência a antibióticos. As células foram centrifugadas durante 30 segundos a 13.000 revs/min numa microcentrífuga e desprezou-se o sobrenadante. As células foram ressuspendidas em 100 μΐ de meio LB. As células foram espalhadas em placas de agar LA contendo 50 μg/ml de canamicina, ou outra selecção de antibiótico contribuída pelo plasmídeo introduzido. As placas foram incubadas a 28 °C durante 2 dias, altura provável para o aparecimento de colónias.

Minipreps de plasmideos de Agrobacterium tumefaciens

Cresceram-se colónias individuais em 20 ml de meio LB, contendo antibiótico como agente selectivo, durante a noite, a 28 °C, num incubador orbital. As células foram centrifugadas a 3000 revs/min durante 5 minutos e o pelete foi ressuspendido em 0,5 ml de solução miniprep (5 mg/ml de lisozima em glucose 50 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8,0). As células foram incubadas em gelo durante uma hora e em seguida adicionou-se 1 ml de SDS alcalino (NaOH 0,2 M, SDS a 1%). Após incubação em gelo durante 10 minutos, adicionaram-se 0,75 ml de acetato de sódio 3 M e a mistura foi deixada no gelo durante 30 minutos. A mistura de lise foi centrifugada a 15.000 revs/min, durante 10 minutos, a 4 °C e o sobrenadante foi transferido para tubos corex de 15 ml. Adicionaram-se 5 ml de etanol frio e os tubos foram armazenados a -70 °C, durante 30 minutos. Os tubos foram então centrifugados a 15.000 revs/min durante 15 minutos, a 4 "C e o sobrenadante foi removido. O pelete foi dissolvido em 0,5 ml de T.E. e transferido para eppendorfs. A solução de ADN foi extraída com um volume igual de fenol/clorofórmio, três vezes e uma vez com um volume igual de clorofórmio. 0 ADN foi precipitado por adição de 1 ml de etanol e incubação a -70 °C, 37 durante 30 minutos. Após centrifugação a 13.000 revs/min durante 15 minutos, numa microcentrifuga, o pelete de ADN foi lavado com etanol a 70%, seco à temperatura ambiente durante alguns minutos e redissolvido em 50 μΐ de T.E. Utilizaram-se 20 μΐ de solução de ADN por fragmentos de enzima de restrição. Em geral, era necessário um aumento de 2-3 vezes em enzimas de restrição e pelo menos 4 horas de digestão para o ADN de Agrobacterium ser digerido de forma adequada.

Transformações de tabaco

Produziu-se tabaco transgénico pelo método de discos de folha, utilizando Agrobacterium tumefaciens transformada. Foram necessárias cerca de 20 plantas crescidas em cultura de tecidos, por transformação. As plantas tinham cerca de 3-4 semanas de idade e foram crescidas em meio M.S. sem antibióticos. Todas as manipulações foram realizadas em chaminés estéreis, utilizando instrumentos estéreis.

As folhas foram cortadas das plantas de tecido de cultura, colocadas em meio NBM em placas de petri e incubadas durante a noite num compartimento de crescimento de plantas. A estirpe de Agrobacterium transformada foi crescida durante a noite em 100 ml de LB contendo canamicina a 50 pg/ml. No dia seguinte, a cultura foi centrifugada a 3000 revs/min, durante 10 minutos e ressuspendida num volume igual de solução MS. Colocaram-se 20 ml de solução de Agrobacterium em placas de petri de 9 cm. Os discos de folha foram feitos a partir de folhas, utilizando um escalpelo estéril e foram colocados na solução de Agrobacterium em placas de petri, durante 20 minutos. Os bocados de folha foram então transferidos para placas NBM e incubados durante a noite, num compartimento de crescimento de plantas. Após 48 38 horas, os discos de folha foram transferidos para meio NBM contendo carbenicilina a 500 pg/ml e canamicina a 100 pg/ml em vasos de neoplantas. Os vasos foram incubados num compartimento de crescimento de plantas, durante 4-6 semanas. Os rebentos que emergem do tecido caloso foram transferidos para meio MS contendo carbenicilina a 200 pg/ml e canamicina a 100 pg/ml em vasos de neoplantas (7 por cada vaso) . Após 3 semanas, os rebentos que criaram raízes foram transferidos para meio MS fresco e crescidos até terem cerca de 5 cm de altura. Fizeram-se cortes extra nesta fase. As plantas foram então transferidas para adubo em vasos de 13 cm e seladas em sacos de polietileno, para impedir a desidratação, durante as primeiras semanas.

Indugâo de plantas de tabaco transgénicas

Aplicou-se ciclohexanona as folhas de planta como uma tinta. A tinta de ciclohexanona consistia de uma solução a 10% de ciclohexanona 950 g/1, NDE 1800 "syperonic" 35 g/1, Tween 85 16,5 g/1 em espessante. Aplicou-se tinta a ambas as superfícies da folha, a 100 μΐ de solução por 16-25 cm2 de superfície de folha, aos dias 0 e 2. Recolheu-se tecido da folha antes da aplicação de indutor e a tempos adequados após a segunda aplicação de tinta. Removeu-se 1 cm2 de tecido de folha com um escalpelo estéril, colocou-se num eppendorf e imergiu-se em azoto líquido. Os testes de CAT foram realizados dentro de 4 horas da amostragem de folhas.

Extracção de proteínas do tecido de folha de tabaco

Deixou-se descongelar o tecido de folhas à temperatura ambiente durante vários minutos, após armazenamento em azoto líquido. ULilizou-se um micro-pilão estéril para moer o tecido 39

de folhas no eppendorf, durante 30 segundos e em seguida adicionaram-se 100 μΐ de Tris 100 mM pH 7,8. A mistura de plantas foi agitada num vortex durante 20 segundos e centrifugada a 13.000 revs/min durante 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo eppendorf. Utilizaram-se 50 μΐ de extracto de folha para um teste CAT e o resto foi utilizado para determinar a concentração de proteína, pelo método de Bradford.

Teste de CAT

Os testes de CAT foram realizados de acordo com o método de Dupont, como descrito no Exemplo 4

RESULTADOS

(A) Produção de tabaco transformado, de forma estável, com a construção repórter alcA-CAT

Utilizou-se o plasmídeo palcA-CAT/BIN para produzir plantas de tabaco transgénicas. Obtiveram-se 44 transformantes de tabaco independentes, dos quais se verificou que 23 continham a construção alcA-CAT quando o ADN genómico foi amplificado utilizando PCR com os oligos C3 e A3. Verificou-se que quatro plantas continham a construção na forma não interrompida, quando o ADN genómico, cortado com a enzima de restrição HinUII, foi sondado com o fragmento SalT de 0,7 kb do gene CAT. 40 (B) Produção de tabaco transformado, de forma estável, com o repórter alcA-CAT e a cassete reguladora alcR-ADNc 0 plasmídeo p35SalcR-alcA-CAT/BIN foi utilizado para produzir plantas de tabaco transgénicas. Obtiveram-se doze transformantes de tabaco independentes e analisaram-se quanto à presença de construções reguladora alcR e repórter alcA-CAT, utilizando PCR. Verificou-se que dez destas plantas continham a construção reguladora alcR, utilizando os oligos, L4 e L6, em PCR. Verificou-se que uma das plantas, D3, continha a construção repórter alcA-CAT por PCR, utilizando os oligos A3 e C3. (C) Análise da expressão de CAT encontrada no tabaco transgénico antes da indução

Utilizou-se tecido de planta para medir a actividade de CAT das plantas transgénicas. Verificou-se que todas as plantas transgénicas alcA-CAT exibiam niveis baixos de actividade de CAT. Os niveis de expressão de CAT variaram entre plantas individuais, mas nenhuma apresentava niveis de expressão de CAT maiores do que os de plantas de tabaco controlo. Nenhuma das plantas de tabaco transgénicas alcR reguladora/alcA-CAT repórter tinha niveis de expressão de CAT elevados. As actividades de CAT eram baixas e não eram superiores às do tabaco controlo. (D) Efeito da ciclohexanona nas actividades de CAT das plantas

Nenhuma das plantas transgénicas alcA-CAT apresentava niveis elevados de expressão de CAT após a aplicação da tinta de ciclohexanona nas folhas. Os níveis de expressão de CAT 41 variavam entre as plantas, mas nenhum apresentava níveis de expressão superiores aos das plantas de tabaco controlo. De entre as plantas de tabaco transgénicas 35S-alcR/alcA-CAT uma, a D3, exibia um nível de expressão de CAT elevado, após a aplicação de ciclohexanona nas suas folhas. O nível era muito superior ao encontrado em plantas de tabaco controlo. (E) Experiência de evolução no tempo da actividade de CAT após aplicação da ciclohexanona

Verificou-se, por PCR, que a planta conhecida como D3 contém ambas as fusões de gene regulador alcR e repórter alcA-CAT (ie a cassete total de expressão de genes).

Esta experiência era uma análise da evolução temporal da planta D3 em comparação com uma planta que contém apenas a construção alcA-CAT (conhecida como S34) e com um controlo não transformado (conhecido como Tl), após tratamento com uma tinta de folha formulada, contendo o indutor de alcR, a ciclohexanona. Verificou-se recentemente que esta última é um indutor potente da ADHI expressa a partir do gene alcA, em células de Aspergillus.

Os dados obtidos a partir desta análise são apresentados na Figura 9: para cada ponto de tempo, os resultados são dados pela ordem S34:D3:T1. As folhas foram tratadas com tinta de folha ciclohexanona ao dia 0 e dia 2. Recolheram-se amostras de tecido de folha imediatamente antes de cada tratamento (0-0 e 2-0, na Figura 9) e em seguida a sete intervalos até ao dia 3. Fizeram-se extractos de proteína a partir das amostras de folha e a actividade de CAT foi determinada nas amostras, utilizando o teste de difusão, descrito acima. 42

Após a pintura com ciclohexanona, a actividade de CAT aumenta nas folhas da planta D3 (que contém os genes 35S-alcR/alcA-CAT), atingindo um pico aos 160 minutos após o segundo tratamento indutor e declinando em seguida (Figura 9).

Em contraste, o tratamento com ciclohexanona não teve nenhum efeito na planta não transformada (Tl), ou na planta que contém apenas o gene alcA-CAT (S34) . Nestas plantas, a actividade de CAT permaneceu em cerca de 5-20% da actividade máxima observada nas folhas 35S-alcR/alcA-CAT.

Esta experiência estabelece que em plantas transformadas de forma estável contendo a cassete de expressão genética 35S-alcR/alcA-CAT, os níveis elevados de expressão do gene repórter (CAT) são apenas obtidos na presença do produto do gene regulador alcR e após tratamento exógeno com o químico indutor, ciclohexanona. 0 indutor ciclohexanona não tem efeito em plantas que expressam o gene CAT que contêm apenas alcA-CAT. (F) Efeito de ferimentos na expressão de CAT em plantas

As folhas de plantas foram laceradas com uma lâmina de barbear e o efeito da expressão de CAT foi medido. Não se observou nenhum aumento na actividade de CAT (i.e. nenhuma indução da expressão do gene) em amostras de tecido de folha recolhidas 240 minutos após a laceração, em nenhuma das plantas. Deste modo, verificou-se que a lesão não tem nenhum efeito na cassete de expressão de alc, por este método. 43 (G) Efeito do iso-propanol na expressão de CAT em plantas 0 iso-propanol é um indutor mais fraco e um substrato para alcA, enquanto que a ciclohexanona é um indutor, mas não um substrato (Creaser et al., 1984, Biochem J, 255:449-454). 0 iso-propanol não tem nenhum efeito aparente na cassete de expressão de alc.

As folhas de plantas foram pintadas com uma solução de iso-propanol a 10% aos 0 e 60 minutos e a expressão de CAT de amostras de folhas foi medida aos 240 minutos. A expressão de CAT observada nas plantas transgénicas alcA-CAT e alcA-CAT/35S-alcR aos 0 minutos era baixa, tal como o era nas plantas de tabaco controlo, não transformadas. Após 240 minutos, não se observou nenhum aumento significativo na actividade de CAT, em nenhum dos tipos de plantas.

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Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Cassete de expressão de gene de planta, indutível quimicamente, que compreende um primeiro promotor ligado de forma operacional à sequência reguladora de alcR, obtida a partir de Aspergillus nidulans, o qual codifica para a proteina reguladora ALCR e um promotor indutível, ligado de forma operacional a um gene alvo, em que o promotor indutível é activado pela proteína reguladora na presença de um indutor exógeno eficaz, em que a aplicação do indutor origina a expressão do gene alvo.
2. 2. Cassete de expressão de gene de planta, de acordo com a reivindicação 1, em que o promotor indutível é obtido a partir do promotor do gene alcA de Aspergillus nidulans.
3. 3. Cassete de expressão de gene de planta, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o promotor indutível é um promotor quimérico.
4. 4. Cassete de expressão de gene de planta de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o indutor exógeno é um álcool ou cetona.
5. 5. Célula de planta que contém uma cassete de expressão de gene, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. 6. Célula de planta de acordo com a reivindicação 5, em que a cassete de expressão de gene é incorporada de forma estável no genoma da planta. 1
7. 7. Tecido de planta que compreende uma célula de planta de acordo com a reivindicação 5 ou 6.
8. 8. Planta que compreende uma célula de planta de acordo com a reivindicação 6.
9. 9- Planta obtida a partir de uma planta de acordo com a reivindicação 8.
10. 10. Semente transgénica obtida a partir de uma planta de acordo com a reivindicação 8 ou 9.
11. 11. Método para controlar a expressão de um gene de planta que compreende transformar uma célula de planta com uma cassete de expressão de gene de planta quimicamente indutivel, que tem um primeiro promotor ligado de forma operacional à sequência reguladora alcR, obtida a partir de Aspergillus nidulans, que codifica para a proteína reguladora ALCR, e um promotor indutivel, ligado de forma operacional a um gene alvo, em que o promotor indutivel é activado pela proteína reguladora na presença de um indutor exógeno eficaz, em que a aplicação do indutor origina a expressão do gene alvo.
12. 12. Promotor quimérico que compreende uma região a montante, contendo uma sequência reguladora promotora que se obtém a partir do promotor do gene alcA de Aspergillus nidulans e uma região a jusante contendo uma sequência de iniciação da transcrição, caracterizada por as referidas regiões a montante e a jusante serem heterólogas, por o promotor ser quimicamente indutivel e por a sequência de iniciação da transcrição ser obtida a partir da região promotora 2 nuclear, de um promotor que é activo em células de plantas.
13. 13. Célula de planta que contém um promotor quimérico de acordo com a reivindicação 12.
14. 14. Célula de planta de acordo com a reivindicação 13, em que o promotor quimérico é incorporado de forma estável no genoma da planta.
15. 15. Tecido de planta que compreende uma célula de planta de acordo com a reivindicação 13 ou 14.
16. 16. Planta que compreende uma célula de planta de acordo com a reivindicação 13 ou 14.
17. 17. Planta que se obtém a partir da planta de acordo com a reivindicação 16.
18. 18. Semente transgénica derivada a partir de uma planta de acordo com a reivindicação 16 ou 17.
19. 19. Célula de planta de acordo com a reivindicação 5 ou 13, que é uma célula de uma planta monocotiledónea.
20. 20. Célula de planta de acordo com a reivindicação 19, que é uma célula de milho.
21. 21. Célula de planta de acordo com a reivindicação 5 ou 13 que é uma célula dicotiledónea. 3
22. 22. Célula de planta de acordo com a reivindicação 21, uma célula de tabaco. que é Lisboa, 28 de Dezembro de 2001. ^AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADb INDUSTRIAL

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