CN113423837A - 产生提高的水平的多不饱和脂肪酸的芸苔属植物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了产生ω‑3二十二碳五烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十碳五烯酸(EPA)中的一者或多者的芸苔属(Brassica)植物以及制备此类植物的方法。

Description

产生提高的水平的多不饱和脂肪酸的芸苔属植物
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求分别于2019年2月14日和2019年9月5日提交的美国临时申请序列号62/805,743和62/896,343的优先权的权益，这两篇申请的公开内容以引用方式全文并入本文。
序列表
本专利申请包含已经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并且该序列表据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2020年2月14日，命名为2012383.txt，并且大小为53,248字节。
技术领域
本公开描述了在转基因芸苔属(Brassica)植物的种子中产生提高的水平的ω-3二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)和/或二十碳五烯酸(EPA)。具有更高水平的DHA、DPA和/或EPA的种子和得自此类种子的油在其脂肪酸谱方面具有某些有益效果，诸如饱和脂肪酸(例如硬脂酸)水平的降低。
背景技术
水产养殖行业发展迅速，在该行业中虾和各种鱼类诸如鲑鱼、罗非鱼、大比目鱼、鲤鱼、斑点叉尾鮰、鳟鱼、鲷鱼和鲈鱼可在受控条件下养殖。通常，养殖鱼是用包含鱼油和/或ω-3长链多不饱和脂肪酸(诸如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA))的配方饲喂，以确保养殖鱼可向消费者提供ω-3鱼油的健康有益效果。预计水产养殖规模在未来几十年内翻几番，但鱼粉和鱼油产量将大致恒定。因此，需要ω-3长链多不饱和脂肪酸的替代来源。
发明内容
本公开至少部分地基于以下发现：可生产芸苔属植物，其中来自这些植物的种子产出具有提高的水平的长链多不饱和脂肪酸(诸如ω-3二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)和/或二十碳五烯酸(EPA))的油。例如，本文所述的芸苔属植物或其部分可具有更高水平的EPA、更高水平的DPA、更高水平的DHA、更高水平的EPA和DHA、更高水平的DHA和DPA、更高水平的DPA和EPA或更高水平的EPA、DHA和DPA。
在一个方面，本公开提供了芸苔属植物或其部分，该芸苔属植物或其部分包含可遗传地整合进其基因组中的一个或多个外源多核苷酸，该外源多核苷酸包含一个或多个表达盒，该一个或多个表达盒具有编码一个或多个d12DES、一个或多个d6Elo、一个或多个d6Des、一个或多个d5Des、一个或多个d5Elo、一个或多个d4Des和/或一个或多个o3Des的核苷酸序列。该植物可以是第二亲本芸苔属植物与包含该一个或多个外源多核苷酸的第一亲本芸苔属植物杂交的结果。与第一亲本芸苔属植物和/或第二亲本芸苔属植物相比，该芸苔属植物在其种子中产生更大量的选自EPA、DPA和DHA的一种或多种多不饱和脂肪酸。芸苔属植物的一部分包括来源于植物的任何部分，包括细胞、组织、根、茎、叶、非活体收获材料、青贮饲料、种子、种子粉和花粉。
在另一方面，提供了生产芸苔属植物或其部分的方法，该方法包括将第二芸苔属亲本植物与在其种子中产生选自EPA、DPA和DHA中的一种或多种多不饱和脂肪酸的第一芸苔属亲本植物杂交，以生产产生EPA、DPA和DHA中的一者或多者的子代植物。在一些实施方案中，与第一芸苔属亲本或第二芸苔属亲本相比，子代芸苔属植物产生更高水平的DHA和/或EPA。在一些实施方案中，第一芸苔属植物具有可遗传地整合进其基因组中的一个或多个外源多核苷酸(例如，T-DNA)。在一些实施方案中，第二芸苔属植物贡献部分或全部赋予更高的量的EPA、DPA和DHA中的一者或多者的至少一个基因组序列。该基因组序列可称为数量性状基因座(QTL)。来自第二亲本的基因组序列可以是选自以下的基因组序列的全部或部分：a)染色体N1上的核苷酸位置8879780和11922690之间的基因组序列；b)染色体N1上的核苷酸位置22823086和24045492之间的基因组序列；和c)染色体N6上的核苷酸位置19156645和20846412之间的基因组序列。
本公开还提供了芸苔属植物或其部分，该芸苔属植物或其部分包含(i)可遗传地整合进其基因组中的一个或多个外源多核苷酸(例如，T-DNA)，该外源多核苷酸包含一个或多个表达盒，该一个或多个表达盒具有编码一种或多种去饱和酶和/或一种或多种延伸酶的核苷酸序列；和(ii)甘蓝型油菜(B.napus)亲本基因组的至少一个基因组序列的全部或部分，所述至少一个基因组序列赋予更高的量的选自EPA、DPA和DHA的一种或多种多不饱和脂肪酸，其中该基因组序列选自：a)染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的基因组序列；b)染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的基因组序列；和c)染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的基因组序列；其中与缺乏(i)和/或(ii)的对照芸苔属植物的种子相比，该芸苔属植物的种子具有更大量的选自EPA、DPA和DHA的一种或多种多不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，基因组序列包含染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的基因组序列的全部或部分，和染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的基因组序列的全部或部分。在一些实施方案中，基因组序列包含染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的基因组序列的全部或部分,和染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的基因组序列的全部或部分。在一些实施方案中，基因组序列包含染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的基因组序列的全部或部分，和染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的基因组序列的全部或部分。在一些实施方案中，基因组序列可包含甘蓝型油菜亲本基因组的基因组序列的25至50、25至100、50至200、100至500、250至1,000、500至5,000、2,000至10,000、5,000至20,000、10,000至100,000、50,000至400,000、25,000至1,000,000、100,000至1,000,000、200,000至1,000,000或500至1,000,000个连续核苷酸。
染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的基因组序列可包含在选自以下位置的一个位置处的一个单核苷酸多态性(SNP)：8,952,616、9,040,901、9,046,609、9,048,617、9,136,686、9,143,608、9,248,592、9,347,120、9,352,326、9,454,361、9,549,523、9,641,936、9,652,028、9,794,198、9,847,417、9,921,975、9,952,792、10,052,015、10,402,684、10,425,211、10,558,464、10,613,015、10,659,284、10,706,805、10,748,492、10,852,010、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,343,118、11,455,979、11,565,970、11,659,776、11,726,807、11,850,103和11,956,477。在一些实施方案中，基因组序列包含在选自以下位置的不同位置处的5、10、15、20、30、35或40个SNP：8,952,616、9,040,901、9,046,609、9,048,617、9,136,686、9,143,608、9,248,592、9,347,120、9,352,326、9,454,361、9,549,523、9,641,936、9,652,028、9,794,198、9,847,417、9,921,975、9,952,792、10,052,015、10,402,684、10,425,211、10,558,464、10,613,015、10,659,284、10,706,805、10,748,492、10,852,010、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,343,118、11,455,979、11,565,970、11,659,776、11,726,807、11,850,103和11,956,477。
染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的基因组序列可包含在选自以下位置的一个位置处的至少一个SNP：9,136,686、9,641,936、10,613,015、9,040,901、9,048,617、9,352,326、9,921,975和10,706,805。在一些实施方案中，基因组序列包含在选自以下位置的不同位置处的2、3、4、5、6、7或8个SNP：9,136,686、9,641,936、10,613,015、9,040,901、9,048,617、9,352,326、9,921,975和10,706,805。
染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的基因组序列可包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：22,823,086、22,880,595、22,902,670、22,949,738、23,011,207、23,044,228、23,099,592、23,176,771、23,201,595、23,257,618、23,302,268、23,367,822、23,380,089、23,457,696、23,520,607、23,552,773、23,598,941、23,670,623、23,682,848、23,745,365、23,792,572、23,855,829、23,910,029、23,947,522、24,021,883。在一些实施方案中，基因组序列包含在选自以下位置的不同位置处的5、10、15、20、25或30个SNP：22,823,086、22,880,595、22,902,670、22,949,738、23,011,207、23,044,228、23,099,592、23,176,771、23,201,595、23,257,618、23,302,268、23,367,822、23,380,089、23,457,696、23,520,607、23,552,773、23,598,941、23,670,623、23,682,848、23,745,365、23,792,572、23,855,829、23,910,029、23,947,522、24,021,883、24,056,999。
染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的基因组序列可包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：23,089,542、23,089,635、23,090,743、23,090,785、23,091,367、23,092,042、23,150,402、23,150,595、23,155,220、23,155,766、23,314,197、23,318,357、23,343,089、23,679,276、23,679,287、23,679,396、23,886,929、23,925,895、23,963,309、24,029,270、24,029,279、24,029,294。在一些实施方案中，基因组序列包含在选自以下位置的不同位置处的5、10、15、20或25个SNP：23,089,542、23,089,635、23,090,743、23,090,785、23,091,367、23,092,042、23,150,402、23,150,595、23,155,220、23,155,766、23,314,197、23,318,357、23,343,089、23,679,276、23,679,287、23,679,396、23,886,929、23,925,895、23,963,309、24,029,270、24,029,279、24,029,294。
染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的基因组序列可包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：19,156,645、19,199,109、19,325,186、19,402,086、19,513,420、19,583,431、19,601,021、19,706,563、19,800,643、19,906,666、20,000,119、20,095,002、20,205,211、20,300,571、20,406,148、20,407,023、20,505,840、20,601,198、20,631,917和20,702,631。在一些实施方案中，基因组序列包含在选自以下位置的不同位置处的至少5、10、15、20、25、30个SNP：19,156,645、19,199,109、19,325,186、19,402,086、19,513,420、19,583,431、19,601,021、19,706,563、19,800,643、19,906,666、20,000,119、20,095,002、20,205,211、20,300,571、20,406,148、20,407,023、20,505,840、20,601,198、20,631,917和20,702,631。
染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的基因组序列可包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：19,336,744、19,336,819、19,337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,476,836、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、20,191,826、20,300,548、20,375,643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570、20,827,573。在一些实施方案中，基因组序列包含在选自以下位置的不同位置处的至少5、10、15、20、25、30、35或40个SNP：19,336,744、19,336,819、19,337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,476,836、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、20,191,826、20,300,548、20,375，643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570、20,827,573。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述了用于本公开的方法和材料；也可使用本领域已知的其他合适的方法和材料。这些材料、方法和示例仅仅是说明性的，而不旨在进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均全文以引用方式并入本文。如发生矛盾，将以本说明书及其所包括的定义为准。
本发明的一个或多个实施方案的细节在以下的附图和描述中示出。根据描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。
附图说明
图1是导致产生ARA、EPA和DHA的不同酶活性的示意图。
图2示出了来自279个芸苔属种质的EPA、DPA和DHA含量的分布。箭头示出了来自PUFA供体品系(donor line)Kumily LBFLFK的平均含量。
图3是示出N01上的有关EPA的两个基因嵌段的曼哈顿图。
图4是示出N01上的有关DPA的基因嵌段的曼哈顿图。
图5是示出N01上的有关DHA的两个基因嵌段的曼哈顿图。
图6是示出N06上的有关EPA的基因嵌段的曼哈顿图。
具体实施方式
如本文所述，可生产芸苔属植物，其中来自这些植物的种子产出具有提高的水平的长链多不饱和脂肪酸的油。如本文所用，术语“多不饱和脂肪酸(PUFA)”是指在长度为例如18至24个碳原子的脂肪酸链中包含至少两个(例如，至少三个、四个、五个或六个)双键的脂肪酸。在一些实施方案中，该术语涉及在脂肪酸链中具有20至24个碳原子的极长链PUFA(VLC-PUFA)。PUFA可以是例如二高-γ亚麻酸(DHGLA，20∶3(8，11，14))、花生四烯酸(ARA，20∶4(5，8，11，14))、EPA(20∶5(5，8，11，14，17))、二十二碳五烯酸(DPA，22∶5(4，7，10，13，16))、DHA(22∶6(4，7，10，13，16，19))和/或二十碳四烯酸(ETA，20∶4(8，11，14，17))。在一些实施方案中，本文所提供的芸苔属植物的种子可产生更高水平的EPA、更高水平的DPA、更高水平的DHA、更高水平的ARA、更高水平的EPA和DHA、更高水平的DHA和DPA、更高水平的DPA和EPA、更高水平的ARA、EPA和DHA或更高水平的EPA、DHA和DPA。
在一些实施方案中，芸苔属植物或其部分可产生在合成期间出现的VLC-PUFA的一种或多种中间体。此类中间体可由底物通过去饱和酶、酮脂酰-CoA-合酶、酮脂酰-CoA-还原酶、脱水酶或烯脂酰-CoA-还原酶多肽的一种或多种活性而形成。在一些实施方案中，底物可以是亚油酸(LA，18∶2(9，12))、γ亚麻酸(GLA 18∶3(6，9，12))、DHGLA、ARA、二十碳二烯酸20∶2(11，14)、ETA或EPA。
在一些实施方案中，可通过将第一芸苔属植物与第二芸苔属植物杂交并且选择子代来生产本文所提供的芸苔属植物或其部分。在一些实施方案中，第一芸苔属植物可包含一个或多个表达盒，该一个或多个表达盒包含编码一种或多种去饱和酶和/或一种或多种延伸酶的至少一条多核苷酸序列。在一些实施方案中，第二芸苔属植物贡献部分或全部负责更高水平的DHA和/或EPA的至少一种基因组序列。
根据本公开的术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸或核糖核酸。除非另行指出，否则本文的“多核苷酸”是指单链DNA多核苷酸或双链DNA多核苷酸。如本文所用，术语核苷酸/多核苷酸和核苷酸序列/多核苷酸序列可互换使用，并且此类术语涵盖双链核酸和单链核酸两者。
术语“去饱和酶”涵盖催化具有不同长度和数目的不饱和碳原子双键的脂肪酸去饱和的所有酶和酶活性。例如，去饱和酶可以是催化第4个和第5个碳原子脱氢的Δ4(d4)-去饱和酶；催化第5个和第6个碳原子脱氢的Δ5(d5)-去饱和酶；催化第6个和第7个碳原子脱氢的Δ6(d6)-去饱和酶；催化第8个和第9个碳原子脱氢的Δ8(d8)-去饱和酶；催化第9个和第10个碳原子脱氢的Δ9(d9)-去饱和酶；催化第12个和第13个碳原子脱氢的Δ12(d12)-去饱和酶；或催化第15个和第16个碳原子脱氢的Δ15(d15)-去饱和酶。
术语“延伸酶”涵盖催化具有不同长度和数目的不饱和碳原子双键的脂肪酸延伸的所有酶和酶活性。在一些实施方案中，术语“延伸酶”是指将两个碳分子引入脂肪酸的碳链的延伸酶的活性。
在一些实施方案中，一个或多个表达盒可具有编码一个或多个d5Des、一个或多个d6Elo、一个或多个d5Des、一个或多个o3Des、一个或多个d5Elo和一个或多个d4Des(例如，编码至少一个CoA依赖性d4Des和至少一个磷脂依赖性d4Des)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，也编码一个或多个d12Des。
在一些实施方案中，一个或多个表达盒可具有编码至少两个d6Des、至少两个d6Elo和/或至少两个o3Des的多核苷酸序列。在一些实施方案中，一个或多个表达盒还可编码至少一个CoA依赖性d4Des和至少一个磷脂依赖性d4Des。
编码表现出Δ-6-延伸酶活性的多肽的多核苷酸已描述于例如WO2001/059128、WO2004/087902、WO2005/012316和WO 2015/089587中，这些专利全文并入本文。非限制性示例性A-6-延伸酶包括来自小立碗藓(Physcomitrella patens)和塔胞藻(Pyramimonascordata)的那些。
编码表现出Δ-5-去饱和酶(d5Des)活性的多肽的多核苷酸已描述于例如WO2002/026946、WO2003/093482和WO 2015/089587中，这些专利全文并入本文。非限制性示例性Δ-5-去饱和酶包括来自破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)、盐生巴夫藻(Pavlova salina)和塔胞藻的那些。
编码表现出Δ-6-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸已描述于WO2005/012316、WO2005/083093、WO2006/008099和WO2006/069710和WO 2015/089587中，这些专利全文并入本文。非限制性示例性Δ-6-去饱和酶包括来自金牛鸵球藻(Ostreococcus tauri)、细小微胞藻(Micromonas pusilla)和绿色鞭毛藻(Osreococcus lucimarinus)的那些。
编码表现出Δ-5-延伸酶活性的多肽的多核苷酸已描述于WO2005/012316、WO2005/007845、WO2007/096387、WO2006/069710和WO2015/089587中，这些专利全文并入本文。非限制性示例性Δ-5-延伸酶包括来自金牛鸵球藻和塔胞藻的那些。
编码表现出Δ-12-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸已描述于例如WO2006100241和WO 2015/089587中，这些专利全文并入本文。非限制性示例性Δ-12-去饱和酶包括来自大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)和克鲁维拉钱斯氏酵母(Lachancea kluyveri)的那些。
编码表现出Δ-4-去饱和酶(d4Des)活性的多肽的多核苷酸已描述于例如WO2004/090123、WO2002026946、WO2003078639、WO2005007845和WO2015/089587中，这些专利全文并入本文。非限制性示例性Δ-4-去饱和酶包括来自细小裸藻(Euglena gracilis)、破囊壶菌属、鲁兹巴夫藻(Pavlova lutheri)和盐生巴夫藻的那些。分别参见例如Δ-4去饱和酶“P1DES 1”和WO2003078639的图3a至图3d以及WO2005007845的图3a、图3b。
编码表现出ω-3-去饱和酶(o3Des)活性的多肽的多核苷酸已描述于例如WO2008/022963、WO2005012316、WO2005083053和WO2015/089587中，这些专利全文并入本文。非限制性示例性ω-3-去饱和酶包括来自畸雌腐霉(Phytium irregular)、致病疫霉(Phytophthora infestans)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的那些。
编码表现出Δ-15-去饱和酶活性的多肽的多核苷酸已描述于例如WO2010/066703中，该专利全文并入本文。非限制性示例性Δ-15去饱和酶包括来自异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)C5的Δ-15去饱和酶。
编码如上所述的具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽的另外的多核苷酸可得自多种生物体，包括但不限于Ostreococcus、破囊壶菌属、裸藻属(Euglena)、海链藻属(Thalassiosira)、疫霉属(Phytophthora)、腐霉属(Phytium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)或小立碗藓属(Physcomitrella)的生物体。可从其他物种鉴定出具有合适的去饱和酶或延伸酶活性的直系同源物、旁系同源物或其他同源物。在一些实施方案中，此类直系同源物、旁系同源物或同源物得自植物，诸如藻类，例如等鞭金藻(Isochrysis)、Mantoniella或隐甲藻属(Crypthecodinium)；藻类/硅藻类，诸如褐指藻属(Phaeodactylum)；苔藓类，诸如角齿藓属(Ceratodon)；或高等植物，诸如报春花科(Primulaceae)如粉报春(Aleuritia)、Calendula stellata、Osteospermum spinescens或Osteospermum hyoseroides；微生物，诸如真菌如曲霉属(Aspergillus)、虫霉属(Entomophthora)、毛霉属(Mucor)或被孢霉属(Mortierella)；细菌，诸如希瓦氏菌属(Shewanella)；酵母；或动物。非限制性示例性动物是线虫，诸如新杆状线虫(Caenorhabditis)、昆虫或脊椎动物。在脊椎动物中，在一些实施方案中，核酸分子可来源于硬骨脊椎动物(Euteleostomi)、辐鳍鱼纲(Actinopterygii)；新鳍亚纲(Neopterygii)；真骨鱼总目(Teleostei)；正真骨鱼群(Eutelostei)、原棘鳍总目(Protacanthopterygii)、鲑形目(Salmoniformes)；鲑科(Salmonidae)或大麻哈鱼属(Oncorhynchus)，诸如来自鲑形目，诸如鲑科，诸如鳟属(Salmo)，例如来自虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和Trutta trutta或亚东鲑(Salmo trutta fario)属或种。此外，核酸分子可得自硅藻类，诸如海链藻属或褐指藻属。
如本文所用，术语“多核苷酸”还涵盖适用于本公开的实施方案的上述特定多核苷酸的变体、突变蛋白或衍生物。
根据本公开的核酸变体或衍生物是因至少一个核苷酸的置换、添加和/或缺失而与给定的参考多核苷酸不同的多核苷酸。如果参考多核苷酸编码蛋白质，则该蛋白质的功能在变体或衍生多核苷酸中是保守的，使得变体核酸序列应仍编码具有如上文指定的去饱和酶或延伸酶活性的多肽。变体或衍生物还涵盖包含能够例如在严格杂交条件下与上述特定核酸序列杂交的核酸序列的多核苷酸。这些严格条件是本领域已知的，并且可见于例如，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。严格杂交条件的非限制性示例是在大约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中的杂交条件，然后会在50℃至65℃下在0.2X SSC、0.1％的SDS中进行一次或多次洗涤步骤。技术人员知道这些杂交条件根据核酸的类型而变化，并且例如当存在有机溶剂时，杂交条件根据缓冲液的温度和浓度而变化。例如，在“标准杂交条件”下，在浓度为0.1′至5′的′SSC(pH7.2)的含水缓冲液中，根据核酸类型温度会在42℃和58℃之间变化。如果上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％的甲酰胺，则标准条件下的温度为大约42℃。DNA：DNA杂交体的杂交条件是例如0.1X的SSC以及20℃至45℃的温度，诸如30℃和45℃之间。DNA：RNA杂交体的杂交条件是例如0.1X的SSC以及30℃至55℃的温度，诸如45℃和55℃之间。例如对于长度为大约100bp(＝碱基对)且G+C含量为50％的核酸，在不存在甲酰胺的情况下确定上述杂交温度。技术人员知道如何通过参考教科书(诸如上述的教科书或以下的教科书)来确定所需的杂交条件：Sambrook等人，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989年；Hames和Higgins(编者)1985年，“Nucleic Acids Hybridization：A PracticalApproach”，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(编者)1991年，“Essential Molecular Biology：A Practical Approach”，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford。另选地，多核苷酸变体可通过基于PCR的技术(诸如基于混合寡核苷酸引物的DNA扩增，即使用针对本公开的多肽的保守结构域的简并引物)来获得。适用于本公开的实施方案的多肽的保守结构域可通过对本公开的多核苷酸的核酸序列或多肽的氨基酸序列进行序列比较来鉴定。适合作为PCR引物的寡核苷酸以及合适的PCR条件在所附的实施例中进行描述。可使用来自细菌、真菌、植物或动物的DNA或cDNA作为模板。此外，变体包含含有与T-DNA序列的任一个T-DNA序列中所示的核苷酸编码序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的核酸序列的多核苷酸。当然，变体必须保持相应酶的功能，即，Δ-4-去饱和酶的变体必须保持Δ-4-去饱和酶活性。
在一些实施方案中，百分比同一性值是在整个氨基酸或核酸序列区域上计算的。技术人员可使用基于多种算法的一系列程序来比较不同的序列。在一些实施方案中，两个氨基酸序列之间的百分比同一性如下确定：使用Needleman和Wunsch算法(Needleman，1970年，J.Mol.Biol.第48卷：第444-453页)，该算法已并入EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice，P.、Longden，I.和Bleasby，A，Trends in Genetics，第16卷第6期，第276-277页，2000年)中的needle程序，并且还使用BLOSUM62打分矩阵以及10的空位开放罚分和0.5的空位延伸罚分。要用于使用needle程序比对两个氨基酸序列的参数的非限制性示例为默认参数，包括EBLOSUM62打分矩阵、10的空位开放罚分和0.5的空位延伸罚分。在另一个实施方案中，使用EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包，Rice，P.、Longden，I.和Bleasby，A，Trends in Genetics，第16卷第6期，第276-277页，2000年)中的needle程序，并且使用EDNAFULL打分矩阵以及10的空位开放罚分和0.5的空位延伸罚分来确定两个核酸序列之间的百分比同一性。与使用needle程序比对两个核酸序列结合使用的参数的非限制性示例为默认参数，包括EDNAFULL打分矩阵、10的空位开放罚分和0.5的空位延伸罚分。本公开的核酸和蛋白质序列还可用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，从而例如鉴定其他家族成员或相关序列。可使用Altschul等人的BLAST系列程序(版本2.2)(Altschul，1990年，J.Mol.Biol.第215卷：第403-410页)进行此类搜索。可用BLASTn、BLASTx或tBLASTx程序使用默认参数执行BLAST，使用本公开的去饱和酶和延伸酶核酸序列作为查询序列，以获得与本公开的去饱和酶和延伸酶序列同源的核苷酸序列(BLASTn、tBLASTx)或氨基酸序列(BLASTx)。可用BLASTp或tBLASTn程序使用默认参数执行BLAST，使用本公开的去饱和酶和延伸酶蛋白质序列作为查询序列，以获得与本公开的去饱和酶和延伸酶序列同源的氨基酸序列(BLASTp)或核酸序列(tBLASTn)。为了获得用于比较目的的空位比对结果，可如Altschul等人所述(Altschul，1997年，Nucleic Acids Res.，第25卷第17期：第3389-3402页)利用使用默认参数的空位BLAST。
在一些实施方案中，上文提及的变体多核苷酸或片段编码保持达到显著程度的去饱和酶或延伸酶活性的多肽，诸如为任何本文所公开的T-DNA中的任何T-DNA所包含的多肽中的任何多肽表现出的去饱和酶或延伸酶活性的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
可用于本公开的实施方案的另外的酶包括但不限于酰基转移酶和转酰酶(参见例如WO 2011161093)，诸如例如溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、磷脂二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)、二酰基甘油二酰基甘油转酰酶(DDAT)和溶血磷脂酰基转移酶(LPLAT)。LPLAT可具有作为溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶(LPEAT)和溶血磷脂胆碱酰基转移酶(LPCAT)的活性。
如本文所用，术语“表达控制序列”是指能够管控(即引发和控制)所关注的核酸序列(在本例中为上述核酸序列)的转录的核酸序列。此类序列通常包含或由启动子序列或启动子和增强子序列的组合组成。多核苷酸的表达包括核酸分子转录成例如可翻译的mRNA。另外的调控元件可包括转录增强子以及翻译增强子。以下启动子和表达控制序列可例如用于根据本公开的表达载体中。cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子用于例如革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，对于革兰氏阳性菌，可使用启动子amy和SPO2。在一些实施方案中，可使用酵母或真菌启动子ADC1、AOX1r、GAL1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。在一些实施方案中，对于动物细胞或生物体表达，可使用CMV-启动子、SV40-启动子、RSV启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40增强子。来自植物的启动子CaMV/35S(Franck，1980年，Cell，第21卷：第285-294页]、PRP1(Ward，1993年，Plant.Mol.Biol.第22卷)、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或泛素或菜豆蛋白启动子。在一些实施方案中，可使用诱导型启动子，诸如EP 0388186 A1(即苄磺酰胺诱导型启动子)、Gatz 1992年，PlantJ.，第2卷：第397-404页(即四环素诱导型启动子)、EP 0335528 A1(即脱落酸诱导型启动子)或WO 93/21334(即乙醇或环己烯醇诱导型启动子)中所述的启动子。其他合适的植物启动子是胞质FBPase的启动子或来自马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus，1989年，EMBO J.，第8卷，第2445页)、来自大豆(Glycine max)(Genbank登录号U87999)的磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶启动子或EP 0249676 A1中所述的节点特异性启动子。在一些实施方案中，使用能够在参与脂肪酸生物合成的组织中表达的启动子。在一些实施方案中，使用种子特异性启动子，诸如根据实践的USP启动子，但也使用其他启动子，诸如LeB4、DC3、菜豆蛋白或油菜籽蛋白启动子。在一些实施方案中，可使用可用于单子叶植物或双子叶植物的种子特异性启动子，并且这些种子特异性启动子描述于US5,608,152(来自油菜的油菜籽蛋白启动子)、WO 98/45461(来自拟南芥属(Arabidopsis)的油质蛋白启动子)、US 5,504,200(来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子)、WO91/13980(来自芸苔属的Bce4启动子)、Baeumlein等人，Plant J.，第2卷，第2期，1992年：第233-239页(来自豆类的LeB4启动子)，这些启动子适用于双子叶植物。以下的启动子适用于单子叶植物：来自大麦的lpt-2或lpt-1启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)、来自大麦的大麦醇溶蛋白启动子和其他合适的启动子(其描述于WO 99/16890)。原则上，可以使用全天然启动子连同它们的调控序列(诸如上文提及的那些)以用于新型的方法。同样地，可以另外或单独使用合成启动子并且这也是有利的，尤其是当它们介导种子特异性表达时，诸如例如WO 99/16890中所述。在一个具体实施方案中，利用种子特异性启动子提高期望的PUFA或VLC-PUFA的产量。
如本文所用，术语“可操作地连接”意指表达控制序列和所关注的核酸是连接的，使得所述所关注的核酸的表达可受所述表达控制序列管控，即，表达控制序列应与所述待表达的核酸序列功能性连接。因此，表达控制序列和待表达的核酸序列可彼此物理连接，例如通过在待表达的核酸序列的5′端插入表达控制序列。另选地，表达控制序列和待表达的核酸可仅在物理上接近，使得该表达控制序列能够管控至少一种所关注的核酸序列的表达。在一些实施方案中，表达控制序列和待表达的核酸相隔不超过500bp、300bp、100bp、80bp、60bp、40bp、20bp、10bp或5bp。
除了启动子之外，本公开的多核苷酸可包括可操作地连接到编码本文所述的酶(例如，去饱和酶和/或延伸酶)的多核苷酸的终止子序列。
如本文所用，术语“终止子”是指能够终止转录的核酸序列。这些序列将使转录机器从待转录的核酸序列解离。在一些实施方案中，终止子在植物中(具体地，在植物种子中)应该是激活的。合适的终止子是本领域已知的并且包括多腺苷酸化信号(诸如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点)或Loke等人(Loke，2005年，Plant Physiol，第138卷，第1457-1468页)指出的植物特异性信号中的一个植物特异性信号，该植物特异性信号位于待表达的核酸序列的下游。
编码图1中所述的去饱和酶和延伸酶的重组核酸分子适用于本公开的实施方案。如本文所用，“重组”是指使用分子生物学领域的普通技术人员可用的技术组合核酸序列，以产生一个或多个表达盒(另选地在本文中称为基因构建体)或包含编码图1中所述的去饱和酶和延伸酶的多核苷酸的一个或多个载体，它们与表达控制序列(诸如启动子)可操作地连接，以在宿主细胞中实现去饱和酶和延伸酶的多核苷酸的表达。
本文公开了在芸苔属植物中表达去饱和酶和延伸酶的重组多核苷酸(诸如T-DNA)。在一些实施方案中，T-DNA包含左边界元件和右边界元件以及至少一个表达盒，该至少一个表达盒包含可操作地连接到编码去饱和酶和延伸酶的各种组合的多核苷酸的启动子，以及在该至少一个表达盒的下游的包括但不限于终止子的其他调控元件。
如本文所用，“T-DNA”是能够使用分子生物学领域的技术人员可用的方法通过转化最终整合进芸苔属植物的遗传物质(基因组)中的核酸。
例如，适用于本公开的实施方案的T-DNA可包含在环状核酸(例如，质粒)中，使得在左边界元件和右边界元件之间存在另外的核酸区段。另外的核酸区段可包含用于在一种或多种宿主微生物中(例如，在埃希氏菌属(Escherichia)(诸如大肠杆菌(E.coli)和/或农杆菌属(Agrobacterium)的微生物中)复制总核酸的一个或多个遗传因子，总核酸即包含T-DNA和另外的核酸区段的核酸分子。此类包含本公开的T-DNA的环状核酸尤其可用作转化载体。
在一些实施方案中，T-DNA长度应足够长以引入大量以表达盒形式存在的酶(例如，去饱和酶和延伸酶)基因，使得每个单独的基因可操作地连接到至少一个启动子和至少一个终止子，如下面的示例中所示。
T-DNA可包含一个或多个单基因的编码序列。例如，包含一个或多个单基因的编码序列的T-DNA可与包含一个或多个其他基因的其他T-DNA组合。适用于本公开的实施方案的T-DNA可包含编码一个或多个d5Des、一个或多个d6Elo、一个或多个d5Des、一个或多个o3Des、一个或多个d5Elo和一个或多个d4Des(例如，编码至少一个CoA依赖性d4Des和一个磷脂依赖性d4Des)的一个或多个表达盒。在一些实施方案中，T-DNA还编码一个或多个d12Des。
在一个实施方案中，本公开的芸苔属植物或其部分(例如，根、茎、叶、种子、花、细胞等)包含编码至少两个d6Des、至少两个d6Elo和/或至少两个o3Des的一个或多个T-DNA。在一个实施方案中，本文所述的芸苔属植物或其部分包含T-DNA，该T-DNA包含编码至少一个CoA依赖性d4Des和至少一个磷脂依赖性d4Des的一个或多个表达盒。
在一个实施方案中，适用的至少一个T-DNA包含编码至少一个d12Des的表达盒。在一个实施方案中，一个或多个T-DNA包含编码一个或多个d5Des(例如，来自破囊壶菌属的Δ5去饱和酶，Tc_GA)、一个或多个o3Des(例如，来自畸雌腐霉的ω3去饱和酶，Pir_GA)、一个或多个d6Elo(来自假微型海链藻(Thalassiosira pseuduonana)的Δ6延伸酶，Tp_GA)和/或一个或多个d6Elo(例如，来自小立碗藓的Δ-6延伸酶，Pp_GA)的一个或多个表达盒。
根据本公开，代替本文所讨论的编码序列中的一者或多者，T-DNA也可包括编码序列的功能性同源物。编码序列的功能性同源物是编码具有与被代替的编码序列相同的代谢功能的多肽的序列。作为非限制性示例，Δ-5-去饱和酶的功能性同源物将会是另一种Δ-5-去饱和酶，并且Δ-5-延伸酶的功能性同源物将会是另一种Δ-5-延伸酶。植物种子特异性启动子的功能性同源物是另一种植物种子特异性启动子。相应地，终止子的功能性同源物是终止核酸序列转录的序列。
适用于本公开的实施方案的某些T-DNA序列在PCT/EP2015/076632(以WO/2016/075327公布)中有所描述。
在一些实施方案中，可通过微生物介导的转化(例如，通过农杆菌介导的转化)将含有包含本文所述的某些去饱和酶和延伸酶的T-DNA载体的构建体转化进植物细胞中。在一些实施方案中，微生物是农杆菌属诸如根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的可转化态菌株。适用的农杆菌菌株例如在WO06024509A2中有所描述，并且使用此类微生物进行植物转化的方法例如在WO13014585A1中有所描述，该文献以引用方式并入本文。
术语“载体”涵盖噬菌体、质粒、病毒载体以及人工染色体，诸如细菌或酵母人工染色体。此外，该术语还涉及允许靶向构建体随机或定点整合进基因组DNA中的靶向构建体。在一些实施方案中，此类靶向构建体包含足够长度的DNA用于同源或异源重组，如下文所详述。适用于一些实施方案的载体还包含用于在宿主中增殖和/或选择的选择性标记。可通过本领域熟知的各种技术将载体掺入宿主细胞中。应当理解，载体还可包含允许同源重组或异源插入的核酸序列。可经由常规转化或转染技术将载体引入原核或真核细胞中。如本文上下文中所用，术语“转化”和“转染”、缀合和转导旨在包括用于将外来核酸(例如，DNA)引入宿主细胞中的多种现有技术过程，包括磷酸钙、氯化铷或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、自然感受态、基于碳的簇、化学介导的转移、电穿孔或粒子轰击。用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适的方法可见于Sambrook等人(MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989年)以及其他实验室手册，诸如Methods in Molecular Biology，1995年，第44卷，Agrobacterium protocols，编者：Gartland和Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey。另选地，可通过热休克或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒，则可在其施用于宿主细胞之前使用适当的包装细胞系在体外包装该载体。
在一些实施方案中，本文提及的载体适合作为克隆载体，即可在微生物系统中复制。此类载体确保在细菌中的有效克隆，并且在一些实施方案中，确保在酵母或真菌中的有效克隆，并且可以使植物稳定转化。具体地，必须提及的那些是各种适于T-DNA介导的转化的双元载体系统和共整合载体系统。此类载体系统的特征在于它们至少含有参与农杆菌介导的转化的vir基因，以及界定T-DNA(T-DNA边界)的序列。在一些实施方案中，这些载体系统还包含其他顺式调控区，诸如启动子和终止子和/或选择标记，可用它们鉴定合适的转化宿主细胞或生物体。虽然共整合载体系统具有布置在同一载体上的vir基因和T-DNA序列，但双元系统基于至少两个载体，其中一个载体带有vir基因，但不带有T-DNA，而另一个载体带有T-DNA，但不带有vir基因。因此，最后提及的载体相对较小，易于操纵，并且可在大肠杆菌和农杆菌两者中复制。这些双元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。在一些实施方案中，根据本公开使用的载体是Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。双元载体及其用途的概述可见于Hellens等人，Trends in Plant Science(2000年)第5卷，第446-451页。此外，通过使用适当的克隆载体，可将多核苷酸引入到宿主细胞或生物体(诸如植物或动物)中，从而用于植物的转化，诸如在以下的文献中公布和引用的那些：PlantMolecular Biology and Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993年)；F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者：Kung和R.Wu，AcademicPress，1993年，第15-38页；B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer，TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，编者：Kung和R.Wu，Academic Press(1993年)，第128-143页；Potrykus，1991年，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.第42卷，第205-225页。适用于将大T-DNA转化进植物中的双元BAC(BiBAC)载体在美国专利5,733,744和5,977,439中有所描述。
表达载体，即包含本公开的多核苷酸的载体，该多核苷酸具有可操作地连接到表达控制序列(也称为“表达盒”)的核酸序列，从而允许该核酸序列在原核植物细胞或其分离级分中表达。
芸苔属植物或种子可包含整合进其基因组中的T-DNA，该T-DNA能够实现表达去饱和酶和延伸酶(诸如图1中所述的去饱和酶和延伸酶)的多核苷酸的表达。
在一些实施方案中，本公开的植物是转基因的，即它们包含不存在于对应的野生型植物中或以不同于对应的野生型植物中的方式布置(例如，遗传因子数目不同)的遗传物质。例如，本公开的植物可包含也存在于野生型植物中的启动子，但本公开的植物包含可操作地连接到编码序列的此类启动子，使得启动子和编码序列的此类组合不存在于对应的野生型植物中。
本公开的芸苔属植物可包含本文所述的一个或多个T-DNA，该T-DNA包含表达盒，该表达盒包含编码一个或多个d5Des、一个或多个d6Elo、一个或多个d5Des、一个或多个o3Des、一个或多个d5Elo和一个或多个d4Des(诸如，编码至少一个CoA依赖性d4Des和一个磷脂依赖性d4Des)的一个或多个基因。在一个实施方案中，至少一个T-DNA包含编码至少一个d12Des的表达盒。在一个实施方案中，一个或多个T-DNA包含编码一个或多个d5Des(例如，来自破囊壶菌属的Δ5去饱和酶，TC_GA)、一个或多个o3Des(例如，来自畸雌腐霉的ω3去饱和酶，Pir_GA)、一个或多个d6Elo(来自假微型海链藻的Δ6延伸酶，Tp_GA)和/或一个或多个d6Elo(例如，来自小立碗藓的Δ-6延伸酶，Pp_GA)的一个或多个表达盒。
根据《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》的规定，将下文示例中所述的事件的种子保藏于美国菌种保藏中心(ATCC)，即事件的种子“LBFLFK”＝ATCC命名“PTA-121703”(LBFLFK如在PCT/EP2015/076632(以WO/2016/075327公布)和US20180298400中所述)。
在一些实施方案中，本文所述的芸苔属植物可使用WO 2004/071467、WO 2015/089587或WO 2016/075327中所述的用于生产芸苔属品系的方法生产。在一些实施方案中，本文所述的芸苔属植物可使用美国专利7,807,849B2中所述的用于生产拟南芥属品系的方法生产。在一些实施方案中，本文所述的芸苔属植物可使用WO 2013/153404中所述的用于生产亚麻荠属(Camelina)品系的方法生产。
在一些实施方案中，本文所提供的芸苔属植物可以是芸苔属植物品系。术语“品系”是指在共享该命名的个体中几乎不表现出或完全不表现出至少一种性状的遗传变异的一组植物。
在一些实施方案中，本文所公开的芸苔属植物和种子属于包含甘蓝(Brassicaolerace)、黑芥(Brassica nigra)和芜菁(Brassica rapa)中的一个或两个成员的基因组的物种。在一些实施方案中，本文所公开的芸苔属植物和种子属于甘蓝型油菜(Brassicanapus)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、印度芥菜(Brassica juncea)、甘蓝、黑芥或芜菁。在一些实施方案中，该植物和种子属于甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥。
在一些实施方案中，本文所提供的植物是可见于“禹氏三角”中的植物，即芸苔属植物：甘蓝型油菜(AA CC基因组；n＝19)，甘蓝型油菜是芸苔属的双二倍体植物，但认为其是由芜菁(AA基因组；n＝10)和甘蓝(CC基因组；n＝9)杂交所得。印度芥菜(AA BB基因组；n＝18)是芸苔属的双二倍体植物，一般认为芥菜是由芜菁和黑芥(BB基因组；n＝8)杂交所得。在一些生长条件下，印度芥菜可具有某些优于甘蓝型油菜的性状。这些优异的性状可包括更高的产量、更好的耐旱性和耐热性以及更好的抗病性。埃塞俄比亚芥(BB CC基因组；n＝17)是芸苔属的双二倍体植物，但认为其是由黑芥和甘蓝杂交所得。在一些生长条件下，埃塞俄比亚芥可具有优于甘蓝型油菜的性状。
在一些实施方案中，本文所提供的芸苔属植物是“油菜”植物。本文的油菜一般是指芸苔属物种的植物，该植物在种子油中具有按重量计小于2％(例如，小于1％、0.5％、0.2％或0.1％)的芥酸(Δ13-22：1)和小于约30微摩尔(例如，小于30、25、20、15或10微摩尔)的芥子油苷/克无油粗粉(粗粉级分)。通常，油菜油可包括被称为棕榈酸和硬脂酸的饱和脂肪酸、被称为油酸的单不饱和脂肪酸和被称为亚油酸和亚麻酸的多不饱和脂肪酸。油菜油可包含小于约7％(w/w)的总饱和脂肪酸(主要是棕榈酸和硬脂酸)和大于40％(w/w)的油酸(以总脂肪酸的百分比计)。传统上，油菜作物包括甘蓝型油菜和芜菁的品种。本公开的非限制性示例性芸苔属植物是春油菜(甘蓝型油菜亚种oleifera var.annua)和冬油菜(甘蓝型油菜亚种oleifera var.biennis)。此外，油菜品质印度芥菜品种(其具有类似于其他油菜类型的油和粗粉品质)已经被添加到油菜作物家族中(美国专利6,303,849；美国专利7,423,198；这些专利均以引用方式并入本文)。同样，通过将甘蓝型油菜的油菜品质的变体与黑芥杂交并且适当地选择它们的子代，任选地在与埃塞俄比亚芥、甘蓝型油菜和/或黑芥进一步回交之后，可以建立油菜品质的埃塞俄比亚芥品种。
该方法允许将十字花科(Brassicaceae)的其他成员(诸如芸苔属)的遗传物质有效地掺入包含本文所公开的T-DNA的植物的基因组中。该方法尤其可用于将包含T-DNA的事件与十字花科的其他成员中负责表现出有益性状的遗传物质组合。在本文中示例性地描述十字花科的其他成员的有益性状，涉及有益性状的显现的其他有益性状或基因和/或调控元件可在别处描述。在一些实施方案中，产生更高水平的亚麻酸的芸苔属植物可与产生EPA、DPA和DHA中的一者或多者的芸苔属植物杂交，使得子代产生与任一亲本植物相比更高水平的EPA、DPA和/或DHA中的一者或多者。在一些实施方案中，产生低水平的亚麻酸的芸苔属植物可与产生EPA、DPA和/或DHA中的一者或多者的芸苔属植物杂交，并且令人惊讶的是，子代可产生与任一亲本植物相比更高水平的EPA、DPA和/或DHA中的一者或多者。在一些实施方案中，产生更高水平的亚油酸的芸苔属植物可与产生EPA、DPA和/或DHA中的一者或多者的芸苔属植物杂交，使得子代产生与任一亲本植物相比更高水平的EPA、DPA和/或DHA中的一者或多者。在一些实施方案中，产生低水平的亚油酸的芸苔属植物可与产生EPA、DPA和/或DHA中的一者或多者的芸苔属植物杂交，并且令人惊讶的是，子代可产生与任一亲本植物相比更高水平的EPA、DPA和/或DHA中的一者或多者。在一些实施方案中，产生中等范围水平的亚油酸的芸苔属植物可与产生EPA、DPA和/或DHA中的一者或多者的芸苔属植物杂交，并且令人惊讶的是，子代可产生与任一亲本植物相比更高水平的EPA、DPA和/或DHA中的一者或多者，并且在一些实施方案中，与由产生高亚油酸的芸苔属亲本和产生EPA、DPA和/或DHA中的一者或多者的芸苔属植物杂交所得的植物相比更高水平的DHA和/或EPA。
在一些实施方案中，不包含本文所述的T-DNA的亲本植物是产生高亚麻酸的亲本，诸如WO2015/066082中所述的rrm1367-003品系。在一些实施方案中，不包含本文所述的T-DNA的亲本植物可以是产生低亚麻酸的亲本。在一些实施方案中，不包含本文所述的T-DNA的亲本植物是产生低亚油酸的亲本。
在一些实施方案中，亲本植物可具有赋予更高的PUFA含量的甘蓝型油菜亲本基因组的至少一个基因组序列的全部或部分，其中该基因组序列选自：a)染色体N1上的核苷酸位置8879780和11922690之间的基因组序列；b)染色体N1上的核苷酸位置22823086和24045492之间的基因组序列；和c)染色体N6上的核苷酸位置19156645和20846412之间的基因组序列。在本公开中，给定的染色体内的核苷酸位置基于甘蓝型油菜栽培品种DH12075的基因组序列中的位置。
在一些实施方案中，如本文所述的生产的芸苔属植物包含：(i)如本文所述的T-DNA和(ii)赋予更高的PUFA含量的甘蓝型油菜亲本基因组的至少一个基因组序列的全部或部分，其中该基因组序列选自：a)染色体N1上的核苷酸位置8879780和11922690之间的基因组序列；b)染色体N1上的核苷酸位置22823086和24045492之间的基因组序列；和c)染色体N6上的核苷酸位置19156645和20846412之间的基因组序列。
在一些实施方案中，赋予更高的PUFA的甘蓝型油菜亲本基因组的基因组序列可包含染色体N1的区域(例如，染色体N1上的核苷酸位置8879780和11922690之间的基因组序列和/或染色体N1上的核苷酸位置22823086和24045492之间的基因组序列)和/或染色体N6的区域(例如，染色体N6上的核苷酸位置19156645和20846412之间的基因组序列)中的例如25至50、25至100、50至200、100至500、250至1,000、500至5,000、2,000至10,000、5,000至20,000、10,000至100,000、50,000至400,000、25,000至1,000,000、100,000至1,000,000、200,000至1,000,000或500至1,000,000个连续核苷酸或更长的连续核苷酸。
在一些实施方案中，一个或多个单核苷酸多态性(SNP)可存在于赋予更高的PUFA含量的甘蓝型油菜亲本基因组的至少一个基因组序列的全部或部分中。一个或多个此类SNP的存在可用于选择合适的亲本和子代。SNP可出现在编码区和非编码区内，包括外显子、内含子和非翻译序列内。SNP的示例包括一个或多个核苷酸的置换、一个或多个核苷酸的缺失和一个或多个核苷酸的插入。在一些实施方案中，核苷酸置换可以是转换，其中一种嘌呤核苷酸置换成另一种嘌呤核苷酸(例如，A置换成G或G置换成A)，或一种嘧啶核苷酸置换成另一种嘧啶核苷酸(例如，C置换成T或T置换成C)。在一些实施方案中，核苷酸置换可以是颠换，其中嘌呤核苷酸置换成嘧啶核苷酸或嘧啶核苷酸置换成嘌呤核苷酸(例如，G置换成T或C置换成G)。导致氨基酸置换的编码序列内的核苷酸置换也可称为非同义SNP。
在一些实施方案中，芸苔属植物可包含赋予更高的PUFA含量的染色体N1上的核苷酸位置8879780和11922690之间的基因组序列的全部或部分。在一些实施方案中，赋予更高的PUFA含量的染色体N1上的核苷酸位置8879780和11922690之间的基因组序列可包含一个或多个SNP(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个或更多个不同的SNP)。表9提供了染色体N1内分布在核苷酸位置8879780和11922690之间的整个基因组序列中的SNP的示例，该基因组序列包含在以下的位置处的SNP：8,952,616、9,040,901、9,046,609、9,048,617、9,136,686、9,143,608、9,248,592、9,347,120、9,352,326、9,454,361、9,549,523、9,641,936、9,652,028、9,794,198、9,847,417、9,921,975、9,952,792、10,052,015、10,402,684、10,425,211、10,558,464、10,613,015、10,659,284、10,706,805、10,748,492、10,852,010、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,343,118、11,455,979、11,565,970、11,659,776、11,726,807和11,850,103。表10提供了染色体N1内的核苷酸位置8879780和11922690之间的候选基因(例如，编码参与脂质生物合成或亲本中的增加PUFA的相关途径的产物的基因)中的SNP的示例，这些候选基因包含在以下的位置处的SNP：9,136,686、9,641,936、10,613,015、9,040,901、9,048,617、9,352,326、9,921,975和10,706,805。在一些实施方案中，赋予更高的PUFA含量的染色体N1上的核苷酸位置8879780和11922690之间的基因组序列的全部或部分可包含在以下的位置处的一个或多个非同义SNP：9,136,686、9,143,608、9,454,361、9,952,792、9,549,523、9,641,936、9,652,028、10,613,015、9,352,326、9,794,198、9,847,417、9,921,975、10,402,684、10,706,805、10,659,284、10,748,492、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,455,979、11,659,776或11,850,103。
在一些实施方案中，芸苔属植物可包含赋予更高的PUFA含量的染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的基因组序列的全部或部分。与更高的PUFA含量相关联的染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的基因组序列可包含一个或多个SNP(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个或更多个不同的SNP)。表11提供了染色体N1内分布在核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的整个基因组序列中的SNP的示例，该基因组序列包含在以下的位置处的SNP：22,823,086、22,880,595、22,902,670、22,949,738、23,011,207、23,044,228、23,099,592、23,176,771、23,201,595、23,257,618、23,302,268、23,367,822、23,380,089、23,457,696、23,520,607、23,552,773、23,598,941、23,670,623、23,682,848、23,745,365、23,792,572、23,855,829、23,910,029、23,947,522和24,021,883。表12提供了染色体N1内的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的候选基因(例如，编码参与脂质生物合成或亲本中的增加PUFA的相关途径的产物的基因)中的SNP的示例，这些候选基因包含在以下的位置处的SNP：23,089,542、23,089,635、23,090,743、23,090,785、23,091,367、23,092,042、23,150,402、23,150,595、23,155,220、23,155,766、23,314,197、23,318,357、23,343,089、23,679,276、23,679,287、23,679,396、23,886,929、23,925,895、23,963,309、24,029,270、24,029,279和24,029,294。在一些实施方案中，赋予更高的PUFA含量的染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的基因组序列的全部或部分可包含在以下的位置处的一个或多个非同义SNP：23,089,542、23,089,635、23,090,743、23,090,785、23,091,367、23,092,042、23,099,592、23,150,402、23,150,595、23,155,220、23,155,766、23,201,595、23,257,618、23,314,197、23,318,357、23,380,089、23,457,696、23,520,607、23,552,773、23,598,941、23,679,276、23,679,287、23,679,396、23,682,848、23,745,365、23,855,829、23,925,895、23,947,522、24,021,883、24,029,270、24,029,279或24,029,294。
在一些实施方案中，芸苔属植物可包含赋予更高的PUFA含量的染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的基因组序列的全部或部分。赋予更高的PUFA含量的染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的基因组序列可包含一个或多个SNP(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个或更多个不同的SNP)。表13提供了染色体N6内分布在核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的整个基因组序列中的SNP的示例，该基因组序列包含在以下的位置处的SNP：19,156,645、19,199,109、19,325,186、19,402,086、19,513,420、19,583,431、19,601,021、19,706,563、19,800,643、19,906,666、20,000,119、20,095,002、20,205,211、20,300,571、20,406,148、20,407,023、20,505,840、20,601,198、20,631,917和20,702,631。表14提供了染色体N6内的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的候选基因(例如，编码参与脂质生物合成或亲本中的增加PUFA的相关途径的产物的基因)中的SNP的示例，这些候选基因包含在以下的位置处的SNP：19,336,744、19,336,819、19,337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,476,836、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、20,191,826、20,300,548、20,375,643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570、20,827,573和20,912,356。在一些实施方案中，赋予更高的PUFA含量的染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的基因组序列的全部或部分可包含在以下的位置处的一个或多个非同义SNP：19,325,186、19,336,744、19,336,819、19,337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,402,086、19,513,420、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、19,906,666、20,000,119、20,095,002、20,300,548、20,375,643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570或20,827,573。
在一些实施方案中，芸苔属植物可包含赋予更高的PUFA含量的染色体N1上的核苷酸位置8879780和11922690之间的基因组序列的全部或部分，和赋予更高的PUFA含量的染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的基因组序列的全部或部分。上文描述了可见于这些区域中的每一个区域中的SNP的示例。
在一些实施方案中，芸苔属植物可包含赋予更高的PUFA含量的染色体N1上的核苷酸位置8879780和11922690之间的基因组序列的全部或部分，和赋予更高的PUFA含量的染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的基因组序列的全部或部分。上文描述了可见于这些区域中的每一个区域中的SNP的示例。
在一些实施方案中，芸苔属植物可包含赋予更高的PUFA含量的染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的基因组序列的全部或部分，并且可包含赋予更高的PUFA含量的染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的基因组序列的全部或部分。上文描述了可见于这些区域中的每一个区域中的SNP的示例。
在一些实施方案中，本文所提供的芸苔属植物(例如，甘蓝型油菜植物)产生具有基于脂肪酸(C14-C22)的总重量计至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约15％、至少约16％或至少约17％的EPA含量的种子。在一些实施方案中，EPA含量可在至少约6％至约18％(例如，约8％至约18％、约10％至约18％、约12％至约18％、约12.5％至约17.5％或约12.5％至约15％)的范围内。
在一些实施方案中，本文所提供的芸苔属植物(例如，甘蓝型油菜植物)产生具有基于脂肪酸(C14-C22)的总重量计至少约0.9％、至少约1.0％、至少约1.2％、至少约1.3％、至少约1.4％、至少约1.5％、至少约1.6％、至少约1.7％、至少约1.8％、至少约1.9％或至少约2％的DHA含量的种子。在一些实施方案中，DHA含量可在约0.9％至约2％(例如，约0.9％至约1.5％、约1.0％至约2.0％、约1.0％至约1.9％或约1.2％至约1.9％)的范围内。
在一些实施方案中，本文所提供的芸苔属植物(例如，甘蓝型油菜植物)产生具有基于脂肪酸(C14-C22)的总重量计至少约3.5％、至少约4.0％、至少约4.5％、至少约5.0％、至少约5.5％或至少约6％的DPA含量的种子。在一些实施方案中，DPA含量可在约3.5％至约6％、或约4.0％至约6％(例如，约4％至约5％、约4.75％至约6.0％、约4.75％至约5.75％或约5.0％至约6.0％)的范围内。
在一些实施方案中，本文所提供的芸苔属植物(例如，甘蓝型油菜植物)产生具有约0.5％至约2.8％的DHA含量和/或约3.5％至约15.0％的EPA含量的种子。在一些实施方案中，DHA含量可在约0.9％至约1.5％的范围内并且/或者EPA含量可在约12.5％至约15.0％的范围内。
在一些实施方案中，本文所提供的芸苔属植物(例如，甘蓝型油菜植物)产生具有至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％或至少约23％的EPA、DPA和DHA含量的种子。在一些实施方案中，芸苔属植物产生具有在约19％至约24％(例如，约20％至约24％、约20％至约23％、或约21％至约23％)的范围内的EPA、DPA和DHA含量的种子。
与对应的对照植物(例如，缺少T-DNA表达构建体和/或缺少来自染色体N1和/或染色体N6的赋予更高的PUFA含量的基因组序列的植物)相比产生具有更高水平EPA、DPA和/或DHA的种子的本文所述的芸苔属植物及其部分可用于饲料目的，诸如水产养殖饲料，例如，如AU2011289381A及其同族专利成员中所述。
在一些实施方案中，本文所提供的芸苔属植物对除草剂耐受，除草剂诸如咪唑啉酮、麦草畏、环己二酮、磺酰脲、草甘膦、草铵膦、苯氧基丙酸、L-草丁膦、三唑啉酮、三唑并嘧啶、硫代苯甲酸盐嘧啶和苯甲腈。例如，芸苔属植物可包括编码产物(例如，突变型乙酰羟酸合酶)的多核苷酸，该产物赋予对除草剂(例如，咪唑啉酮、磺酰脲、硫代苯甲酸盐嘧啶、三唑啉酮或三唑并嘧啶)的抗性。参见，例如Tans等人，Pest Manag Sci.第61卷第3期：第246-257页(2005年)和Hu等人，PLoS One.第12卷第9期：e0184917(2017年)。
本公开还涉及包含可得自本文所述的植物的多不饱和脂肪酸的油。术语“油”是指包含被酯化成甘油三酯的不饱和和/或饱和脂肪酸的脂肪酸混合物。在一些实施方案中，本公开的油中的甘油三酯包含如上所提及的PUFA或VLC-PUFA部分。在一些实施方案中，经酯化的PUFA和/或VLC-PUFA的量为大约30％、或至少50％、或至少60％、70％、80％或更高。该油还可包含游离脂肪酸，诸如上文提及的PUFA和VLC-PUFA。
根据本公开的油可具有基于总脂肪酸含量的至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约15％、至少约16％或至少约17％的EPA含量。根据本公开的油可具有基于总脂肪酸含量的至少约0.9％、至少约1.0％、至少约1.2％、至少约1.3％、至少约1.4％、至少约1.5％、至少约1.6％、至少约1.7％、至少约1.8％、至少约1.9％或至少约2％的DHA含量。在一些实施方案中，本公开的油可具有约0.5％至约2.8％的DHA含量和/或约3.5％至约15.0％EPA的EPA含量。在一些实施方案中，本公开的油可具有约0.9％至约1.5％的DHA含量和/或约12.5％至约15.0％EPA的EPA含量。在一些实施方案中，本公开的油可具有至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％或至少约23％的EPA、DPA和DHA含量。在一些实施方案中，本公开的油可具有在约19％至约24％(例如，约20％至约24％、约20％至约23％、或约21％至约23％)的范围内的EPA、DPA和DHA含量。
在一些实施方案中，植物(诸如子代)可以是杂交体或近交体。术语“杂交体”涉及基于在不同亲本品系之间或之中的受控异花授粉的栽培品种或植物育种的子代，使得所得的种子从那些亲本品系遗传其遗传组成。当从相同的稳定雌性亲本基因型和雄性亲本基因型重复进行受控异花授粉时，可重复且可预测地产生特定杂交体的种子。而“近交体”是指由双单倍体法、连续几代的受控自花授粉、连续几代的与轮回亲本的受控回交或其他产生纯合体的方法所得的相对稳定的植物基因型。回交是指育种人员将杂交子代反复与亲本中的一个亲本杂交的过程；例如，第一代杂交体F1与F1杂交体的亲本基因型中的一个亲本基因型杂交。杂交植物的生产是技术人员熟知的/可用的。
本发明将在以下实施例中进一步描述，下文实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1：用于鉴定增加EPA、DPA和/或DHA的数量性状基因座(QTL)的基因组作图
材料与方法
植物繁殖
芸苔属植物在生长箱(Conviron GR192)中的Berger B7土壤中生长，从莲座期到开花结束，每次浇灌100ppm肥料(Jack’s 20-20-20)。生长箱条件为白天16小时，白天温度为22℃，夜间温度为19℃，或白天温度为28℃，夜间温度为15℃。在完全成熟时收获种子。
异花授粉
纯合PUFA供体LBFLFK(LBFLFK在两个不同的基因座处带有VC-LTM593-1qcz质粒的两个插入；LBFLFK和VC-LTM593-1qcz rc的遗传因子以及每种遗传因子的功能在PCT/EP2015/076632(以WO/2016/075327公布)中提供)在与许多独特的芸苔属种质的杂交中用作花粉供体来制备F1种子。通过气相色谱法确定F1种子脂肪酸谱。
Figure BDA0003206304680000281
基因型分析
在开花之前从每个种质材料中获取叶片样品。使用DNeasy微量提取器(Qiagen)从每个叶片样品中提取DNA，并且通过Illumina Infinium 60k Brassica array和KASP(竞争性等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)，LGC)分析单核苷酸多态性(SNP)。
表型分析
使用约30粒种子和紧接破碎后的标准脂肪酸甲酯制备(摘自AOCS方法Ce 1-62)通过气相色谱法来测量种子的脂肪酸谱。GLC-566(NuChek Prep)用作标准品并且由ChemStation软件(安捷伦(Agilent))将脂肪酸谱确定为总脂肪酸的百分比。
通过美国油脂化学家协会(AOCS)方案Ce 1-62的修改版来确定种子的脂肪酸组成。在该程序中，将以酰基甘油形式存在的脂肪酸转化为脂肪酸甲酯，通过气液色谱法(GLC或GC)来分析该脂肪酸甲酯。对于待分析的每个样品而言，将20-30粒种子连同两个钢珠轴承一起放在15ml离心管中。盖上该管并且摇晃30秒或直到种子明显破碎。将大约0.6mL 2NKOH的甲醇溶液添加到该管中，并且再次摇晃该管大约一分钟。将该管及其内容物置于70土5℃的水浴中2min。在从水浴中取出该管之后，添加4mL被氯化钠饱和的水和2.0mL含100ppmBHT的异辛烷，摇晃该管并且在台式离心机中离心1min。将异辛烷上清液的一部分转移到气相色谱(GC)样品瓶并盖上该样品瓶。将样品瓶储存在0-4℃下直到分析，但不得超过五天。
在配备有20m×0.18mm×0.2μm DB-225(50％氰丙基苯基)柱的仪器(来自AgilentTechnologies)上对脂肪酸甲酯进行GC分析。使用250℃的进样口温度，并且使用0.8ml/min的氢柱流速(恒流模式)以50∶1的分流注射1μl。初始温度为190℃/0min-＞15℃/min-＞220℃-＞220℃/9min，并且采用火焰离子化检测器。使用脂肪酸甲酯标准品(诸如NuChek Prep目录号GLC 566)来校准该仪器。
使用被归一化到这些脂肪酸的总峰面积的所报告的每种类型的脂肪酸的积分峰面积来确定具有14个碳原子(C14脂肪酸)至24个碳原子(C24脂肪酸)的脂肪酸的含量。
特定酸的含量在本文中以百分比提供。除非另外明确指出，否则此类百分比是基于种子油中的总脂肪酸的重量百分比，如通过实验计算。因此，例如，如果提供了特定种类的脂肪酸(例如，油酸)的百分比，则这是基于在种子油中检测到的总脂肪酸的重量百分比。
基因作图
QTL(数量性状基因座)作图
在此次研究中，使用包含52,157个标记的高密度单核苷酸多态性(SNP)IlluminaInfinium array(Clarke等人，2016年)对总共288个芸苔属种质进行基因分型。如制造商规程(Illumina Inc.，San Diego，CA)中所述，将DNA分离、定量并且杂交至阵列。使用Illumina HiScan或BeadArray Reader扫描该阵列，并且使用GenomeStudio软件包的基因分型模块分析SNP数据。对总共47,304个SNP进行了质量分析，并且将这些SNP用于在R环境(R开发核心团队，2015年)中执行GWAS(全基因组关联研究)分析。使用GAPIT包、基因组关联和预测整合工具(版本2；Lipka等人，2012年)以及rrBLUP软件包(Endelman，2011年)中的GWAS功能两者来鉴定赋予PUFA表型(包含EPA、DPA和DHA含量)的基因嵌段。还在R环境中进行了油的性状分布和相关性分析。
QTL验证
基于关联作图结果，由PUFA供体品系Kumily LBFLFK和携带EPA和DHA的有利等位基因的两个芸苔属种质杂交产生了两个回交(BC1)群体。对选择结果进行基因分型以确认PUFA事件的拷贝数。LBFLFK包含两个PUFA基因座(例如，具有PUFA途径的构建体的两个插入)。选择两个基因座都是纯合的或两个基因座都是杂合的品系作图。从两个群体中总共选择658个BC1品系(表1)。
Figure BDA0003206304680000301
表1.选自每个BC1群体并且用于QTL作图的纯合和杂合品系的数目。
品系 #选择结果
2 127个双基因座纯合子，130个双基因座杂合子
4 174个双基因座纯合子，227个双基因座杂合子
来自这658个BC1品系的DNA使用来自GWAS分析鉴定出的位于QTL区域内的1434个全基因组Ion AmpliSeq测序(Life Technologies)SNP标记连同85个KASP(LGC，UK)SNP标记进行基因分型。对于每个品系而言，SNP的子集都是多态的。
脂肪酸组成和单个SNP标记之间的相关性在Microsoft Excel(2010)中计算。使用Join Map3.0(Kyazma)的Kosambi函数构建实验群体的连锁图。在R统计软件包(Broman等人，2003年；Broman和Sen，2009年)的R/qtl程序中完成数量性状基因座(QTL)作图。
结果
全基因组关联研究作图
图2示出了来自对于每个LBFLFK插入为杂合的279个芸苔属种质中的EPA、DPA和DHA的分布(箭头示出来自PUFA供体品系，Kumily LBFLFK的平均含量)。全基因组关联研究分析鉴定出A01染色体上的两个显著关联(图3、图4和图5)和A06染色体上的一个显著关联(图6)。在表3、表4和表5中指定了QTL的特定SNP标记。单倍型分析鉴定了与PUFA性状相关联的单倍型，这些单倍型包括分别对应于A01上的两个QTL的两个有利单倍型，其增加了EPA、DPA和DHA的含量。例如，携带对应于QTL1的有利单倍型的种质具有平均增加了55％的EPA(6.70％对比于4.32％)、平均增加了101％的DPA(4.16％对比于2.07％)和平均增加了121％的DHA(1.17％对比于0.53％)。携带对应于A05上的QTL的有利单倍型的品系具有平均增加了71％的EPA(7.28％对比于4.26％)、平均增加了54％的DPA(3.10％对比于2.01％)和平均增加了163％的DHA(1.34％对比于0.51％)。并且最后，携带对应于A06上的QTL的有利单倍型的品系具有平均增加了53％的EPA(6.79％对比于4.43％)、平均增加了79％的DPA(3.70％对比于2.07％)和平均增加了162％的DHA(1.44％对比于0.55％)。
QTL验证
BC1群体的QTL扫描确认了在GWAS研究中鉴定出的基因座的存在(QTL1、QTL2和QTL3；表6)。此处可以看出，在指定的基因座中的每个基因座处杂合的个体包含与对于PUFA供体品系(Kumily LBFLFK)为纯合的个体相比更高的PUFA含量。
表2.携带A01上的QTL的多种组合的甘蓝型油菜品系的FPA+DHA值的汇总。“+”指示 存在有利(PUFA增加的)基因型，并且“-”指示另选的等位基因。
Figure BDA0003206304680000321
表3.N01上的第一基因嵌段(QTL1)的SNP位置
Figure BDA0003206304680000322
表４.N01上的第二基因嵌段(QTL2)的SNP位置
Figure BDA0003206304680000323
Figure BDA0003206304680000331
表5.N06上的第三基因嵌段(QTL3)的SNP位置
Figure BDA0003206304680000332
表6.每个基因座处的替代基因型的标记和平均PUFA值。
Figure BDA0003206304680000333
Figure BDA0003206304680000334
Figure BDA0003206304680000341
进行后续的精细作图分析以验证QTL1、QTL2和QTL3的QTL区域并且将其缩小为表7中鉴定出的基因组区域。通过如下方式进行精细作图：使亲本1非PUFA/亲本2 PUFA F1与优良雌性亲本杂交，回交两次得到包含LBFLFK的优良雌性亲本，自交并且使用BC2S2和BC2S3自交群体进行作图。在这些世代的每一代中，如QTL作图中所述，使用SNP基因型与VLC-PUFA的相关性进行选择。
同时，在如本文所述的作图和精细作图中鉴定出的QTL标记用于将QTL渗入优良亲本品系中(包括表8中所示的优良雌性亲本)。对于基因渗入，将LBFLFK纯合的优良亲本品系(表8中的“对照”)与含有LBFLFK和QTL1以及QTL2两者的亲本2杂交，并且与含有LBFLFK和QTL3两者的亲本3杂交。选择所得的子代用于相应的QTL并且与优良亲本品系回交两次。然后将来自每次杂交的所得的子代彼此杂交以将LBFLFK、QTL1、QTL2和QTL3在单个植株中组合。让子代自交，选择LBFLFK、QTL1、QTL2和QTL3纯合的植物，使其自交并且在生长箱(白天温度为28℃和夜间温度为15℃)中生长，评估从该植物收获的种子中的脂肪酸谱。如表8中所示，具有QTL3的植物具有平均增加了15％的总PUFA含量(18.07％对比于15.67％)、平均增加了12％的EPA(12.66％对比于11.32％)、平均增加了19％的DPA(4.26％对比于3.57％)和平均增加了46％的DHA(1.15％对比于0.79％)。具有QTL1和QTL2两者的植物具有平均增加了10％的总PUFA含量(17.3％对比于15.67％)、平均增加了12％的EPA(12.73％对比于11.32％)、平均增加了2％的DPA(3.64％对比于3.57％)和平均增加了19％的DHA(0.94％对比于0.79％)。具有QTL1、QTL2和QTL3的植物具有平均增加了28％的总PUFA含量(20.04％对比于15.67％)、平均增加了27％的EPA(14.32％对比于11.32％)、平均增加了24％的DPA(4.41％对比于3.57％)和平均增加了65％的DHA(1.30％对比于0.79％)。
也对LBFLFK、QTL1、QTL2和QTL3纯合的植物进行田间栽培。测试土地块包含对包含三个QTL的雌性亲本的三次选择，已描述了这三个QTL赋予植物在EPA、DPA和DHA方面的增加。测试土地块还包括两个对照土地块，它们具有相同的亲本背景但不携带三个QTL中的任一个QTL。田间结果证实了来自生长箱(如上所述)的结果，其中添加三个所述的基因组区域赋予植物在田间中在EPA、DPA和DHA方面的增加。对照土地块的平均EPA+DPA+DHA为9.44％，而具有三个所述的QTL的土地块的平均EPA+DPA+DHA为16.17％，并且具有最高值的土地块包含17.74％的EPA+DPA+DHA。这三个QTL已经证明相对于对照组，其EPA+DPA+DHA增加至多87.9％，EPA平均增加58％(7.03％相比于11.08％)、DPA平均增加83％(1.90％相比于3.47％)以及DHA平均增加65％(0.34％相比于0.90％)。使用从完整土地块样品中二次取样的大约30粒种子，如所述通过GC进行所有脂肪酸的分析。
表7.鉴定QTL1、QTL2和QTL3的精细的基因组区域的标记。
Figure BDA0003206304680000351
表8.具有指示的QTL的芸苔属植物的平均PUFA值
Figure BDA0003206304680000361
对对应于每个QTL的区域进行测序。在具有用于增加PUFA的有利等位基因的亲本品系和PUFA供体品系(Kumily LBFLFK)之间比较每个QTL的基因组序列。表9提供了染色体N1中分布在QTL1区间内的SNP，表10提供了染色体N1中QTL1内的候选基因中的SNP。表11提供了染色体N1中分布在QTL2区间内的SNP，表12提供了染色体N1中QTL2内的候选基因中的SNP。表13提供了染色体N6中分布在QTL3区间内的SNP，表14提供了染色体N6中QTL3内的候选基因中的SNP。在这些表的每一个表中，“refnt”是指PUFA供体品系中的参考核苷酸；“altnt”是指品系中具有增加PUFA的有利等位基因的替代核苷酸；“AA变化”是指氨基酸变化；“类型”是指多态性类型；“TS”是指转换；“TV”是指颠换；并且“subst”是指置换。
表9：染色体N1中分布在QTL1区间内的SNP
Figure BDA0003206304680000371
Figure BDA0003206304680000381
Figure BDA0003206304680000391
Figure BDA0003206304680000401
Figure BDA0003206304680000411
Figure BDA0003206304680000421
Figure BDA0003206304680000431
Figure BDA0003206304680000441
Figure BDA0003206304680000451
Figure BDA0003206304680000461
Figure BDA0003206304680000471
Figure BDA0003206304680000481
表10：染色体N1中的QTL1内的候选基因中的SNP
Figure BDA0003206304680000482
Figure BDA0003206304680000491
Figure BDA0003206304680000501
Figure BDA0003206304680000511
表11：染色体N1中分布在QTL2区间内的SNP
Figure BDA0003206304680000512
Figure BDA0003206304680000521
Figure BDA0003206304680000531
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Figure BDA0003206304680000581
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Figure BDA0003206304680000601
Figure BDA0003206304680000611
Figure BDA0003206304680000621
Figure BDA0003206304680000631
Figure BDA0003206304680000641
表12：染色体N1中的QTL2内的候选基因中的SNP
Figure BDA0003206304680000642
Figure BDA0003206304680000651
Figure BDA0003206304680000661
Figure BDA0003206304680000671
Figure BDA0003206304680000681
Figure BDA0003206304680000691
Figure BDA0003206304680000701
Figure BDA0003206304680000711
Figure BDA0003206304680000721
Figure BDA0003206304680000731
表13：染色体N6中分布在QTL3区间内的SNP
Figure BDA0003206304680000732
Figure BDA0003206304680000741
Figure BDA0003206304680000751
Figure BDA0003206304680000761
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Figure BDA0003206304680000781
Figure BDA0003206304680000791
Figure BDA0003206304680000801
Figure BDA0003206304680000811
Figure BDA0003206304680000821
表14：染色体N6中的QTL3区间内的候选基因中的SNP
Figure BDA0003206304680000831
Figure BDA0003206304680000841
Figure BDA0003206304680000851
Figure BDA0003206304680000861
Figure BDA0003206304680000871
Figure BDA0003206304680000881
Figure BDA0003206304680000891
Figure BDA0003206304680000901
Figure BDA0003206304680000911
Figure BDA0003206304680000921
Figure BDA0003206304680000931
Figure BDA0003206304680000941
Figure BDA0003206304680000951
可假定这些基因中的一些基因是在脂质生物合成或亲本中的增加PUFA的相关途径中具有或预测具有功能的基因中包含SNP，其可因为这些基因中的一些功能差异促进PUFA的增加。例如，去饱和酶可优选不同的底物，具体取决于其底物结合口袋中的微小变化，这可影响产生出的PUFA的量。
实施例2：杂交/杂交体
如本文所示，添加某些遗传因子(QTL)可增加极长链PUFA的量。然而，在杂交体生产体系中，包含极长链PUFA的雄性亲本和雌性亲本两者的组合可产出中等亲本的量的EPA+DPA+DHA，并且在一些情况下甚至比任一亲本低的EPA+DPA+DHA。
令人惊讶的是，当使用对如前文所述的三个QTL为杂合的雌性(以及对本文所述的全部三个QTL为纯合的、杂合的或缺乏本文所述的全部三个QTL的雄性，但所有植物包含如本文所述的一个或多个tDNA)生产杂交体时，F1杂交种子表现出杂种优势，即其产出比任一亲本高的EPA+DPA+DHA。在这种情况下，雌性单独产生18.7％的EPA+DPA+DHA，雄性产生13.6％至14.8％的EPA+DPA+DHA(在这种情况下雄性不具有如本文所述的三个QTL)，并且由该杂交获得的F1杂交体产生20.2％至24.8％的EPA+DPA+DHA。当雌性对于三个QTL为杂合并且雄性对于三个QTL为纯合时，观察到相同的效果。在这种情况下，雌性单独产生18.7％的EPA+DPA+DHA，雄性产生13.8％至14.5％的EPA+DPA+DHA，并且由该杂交获得的F1杂交体产生18.8％至21.8％的EPA+DPA+DHA。
参考文献
Clarke et al.A high-density SNP genotyping array for Brassica napusand its ancestral diploid species based on optimised selection of single-locus markers in the allotetraploid genome.Theor Appl Genet(2016)129：1887-1899.
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本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请以引用方式并入。如果以引用方式并入的术语的定义与本文所定义的术语冲突，则以本说明书为准。
序列表
<110> 理查德·弗莱彻
K·P·蒙瑟-格雷
嘉吉公司
<120> 产生提高的水平的多不饱和脂肪酸的芸苔属植物
<130> 4361.166WO1
<150> US 62/805,743
<151> 2019-02-14
<150> US 62/896,343
<151> 2019-09-05
<160> 177
<170> Windows 4.0 版的FastSEQ
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n= T 或 C
<400> 1
atttgagagt gggaaaagac tttgtaggta gtagatacag agtccaagaa nctatccagg 60
gtcttggtgt agctgtcaac attcatgacg cagatgacat t 101
<210> 2
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<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
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<400> 2
ctgatacatt taatagatta ccgtaaaaca agtttgctgt acaccagctt nggaggtgct 60
gagagcactt ctgcttctgc agaaacggga agataaacaa c 101
<210> 3
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<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
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<221> 尚未归类的特征
<222> 51
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tttgtcgtca acgtcgcctt cttccacatc ccccatataa accttaaaca ncaacaagag 60
atttttaatg gaaactgatg aagactgatc taatagtcat a 101
<210> 4
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 4
tcattgctaa tgcttttgtt ttgaacacca tttgcctcat ctaagctcgg ntgaacttca 60
gtgaccgtgg tcaagaaatc taaaccaagg acggcgcata g 101
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<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
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<221> 尚未归类的特征
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<223> n = G 或 A
<400> 5
agttggacct gagcttagtt tccttaaaga cgtgggacgg gctgagtact ncagggttac 60
cgatgaagaa gccttagaag gtgctctact acttacttgg c 101
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<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
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<221> 尚未归类的特征
<222> 51
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<400> 6
acatatctta ttggttatac atgatcctcg tttctgtcat cttcatactc ngaaacaaaa 60
aaattaaaaa tcaccatatt aattgcaaag ttgtatcaat t 101
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<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
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<221> 尚未归类的特征
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ccgttgagaa tcgtcctgag cgaattcatc cgaggaagat caaaagaccg ntctttcatc 60
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<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
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ctcccatctg tcactgcagt acttgaacag ctcccaaagt gctaaacttg ntaacaaccc 60
caccaatgca agtggcatct gatacctaca aagaaacacc a 101
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<211> 101
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<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
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<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
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accaaactct ggatacgaag cttctggtcc aagatccaga gaagatcaag ntccaccagt 60
gccacaacca tgacttgaaa acagtcaaca aataagcgtt t 101
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<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
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<221> 尚未归类的特征
<222> 51
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atttcgatag agtcgctgga gagagcgact ccaaagccat taagaaaccg nttgaatcaa 60
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<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
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<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
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<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
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<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
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gagctcgagt tcctcaacca cgaactaaac agtagcgggg aagacaaagc ngaagaacgt 60
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<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
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<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
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<400> 18
tcacaaccta agtcatattc atattaccaa ttgcagttac tgtgaatgag nttgaagctc 60
tttacgaaat gttcaagagc atcagcaaag acggccttat c 101
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<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 19
gactatgctg ctttcgagag taagagcttc actgtacaat gctgagtcag ntggtgtctc 60
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<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 20
tcaccaaact cacatgtctg tttcttgacg tctcttgcac acactttgta naagattgca 60
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<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 21
ttccatcagg aggttctgat gattttatgg tgcaaaatga ggggagtata ngttctaagc 60
aactcatcga ggaggatggg ggtggtagca ttcaagaatc t 101
<210> 22
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n - G 或 C
<400> 22
ttatctctag caagttacaa tgagatattg gatggaagtg ttgatactaa ntgtcttatt 60
ggtatataat tttgaactgc ttctcttaga ttatttttat c 101
<210> 23
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 23
ctctcctcgc ttggtgaaac cggagagacc attggtttgc ctcattgtcg ncatctttcc 60
tcttctaccg gtaagaatct tgtgaggata agactgatga c 101
<210> 24
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 24
cctgtctcta acatctgctg cagagttacc cgcttccacc atatctccac ngagcctgta 60
cgcgattagg cgaagaggac tatctcttgg ttctttcttg a 101
<210> 25
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 C
<400> 25
tccgaaacct tgaccaaatt ctaccccctc gcgggaagaa tcaacggagt nactgtcgac 60
tgtaacgacg aaggagctgt tttcgtcgac gctcgtgtcg a 101
<210> 26
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 26
ggcttggtct ggtaggcata atgaaagccg cttgacatgt gtgattaaac naacaaagtt 60
ctgtatgtca aggtatgtcg aatcgacttc catctcctcc a 101
<210> 27
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 27
aagagcgatg ggcttggtga cttttcttcc tttccggaga cgagtgattc ngagtctagc 60
gataagcccc tcatggcaca ctatggcaat gtagaagagc c 101
<210> 28
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 G
<400> 28
gatctgtcga gcttagtcgc tatccacgga taatactcat aatgactttc ntttcctaat 60
tgagatgaag ctctatgcac ccgtacggcc ttaagtacac c 101
<210> 29
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 29
gtgtatatcg ttaaccccac gaccattgta gctgtgagaa ccgcagcctc nagaacaatc 60
ttccctgttt tttttattca caagagttag attgtaacat c 101
<210> 30
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 30
aagcactcga cttataacca tgtttgatat gtttcgacga tctaccagtc ngcttctgtg 60
aagtctgctc agcaacgtgg tcagcccttt catgaccact c 101
<210> 31
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 31
caccatcacc agctatgggc tttccatctc caccatcacc agaaaaagcc ncagggacca 60
ttctgctcgg taaatacgaa ctcggtcgcc gattaggcag t 101
<210> 32
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 32
tagttgagaa acgttttgtg agtcctcctc tttccaacga cccaactctg nagtctacat 60
ggactcaccg cttatgggtt gcagctggtt gcaccacctt g 101
<210> 33
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 33
tattgataag tatggattcg agtaccaatt caatggtaaa aaagatgtca ngtcttacct 60
gctttagatt atttaagaaa cttcttgtta gatatgcctg a 101
<210> 34
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 G
<400> 34
tttaaacagg ttgcttgaac ggtggtgggc agattaagcc aaaaacggga nagactccga 60
aagaactgat caactcactt gaagctactt atatgaatga t 101
<210> 35
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 35
aggaggatga gaattcgtgt taccggaaga gtagcatagc taagggccaa nttgattaca 60
gcggctgcga taagcgatac aatgatattg aaaccaagca t 101
<210> 36
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 A
<400> 36
tatattaatc caggacattg gcattgtaag aaaaatcatt ttcaaaaggg naatggagaa 60
agatctgaat cagaactctc cacgaatcag aaagctaagg g 101
<210> 37
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 37
agcaaataca tattatattt atatattaaa atacctgatc ttgtaagtga naaaggtccg 60
ttttccacca aaggagacca cataagaaag acacgacaaa a 101
<210> 38
<211> 102
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 G
<221> 尚未归类的特征
<222> 52
<223> n = G 或 A
<400> 38
ggatatgatt gagacaggga ttaatgatca atgctcaagc gttgaagcta nnagcttcac 60
acagctcctt aggaacctct ccagctcccc tggctactgc tt 102
<210> 39
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 T
<400> 39
aaagcaatcg actcagcatt ttccctgacg cggacaaggt tgtaacgaaa ntcagcctct 60
ttcttctctt gcataaagtt gagattcact agtccctgag a 101
<210> 40
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<400> 40
caccatttct agatctatag aatcagaatt cgaattggat cttcggtgaa nctaatctcc 60
aatatcatct cctctgatct ctaaagcttg aggaggataa c 101
<210> 41
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 41
atagagtaac gattatcatc aaccttagtg aaccctgaga gatacttctc nacttcgtcc 60
cattcaccgg cgagagcttt ctcttcaaag tactttatat t 101
<210> 42
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 42
atgtttattc atttttcata agtttttttt agttttcatt tacattttat ntatgatttt 60
atcaaactac ataaataaaa aatctacaaa ctttaatcaa a 101
<210> 43
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 43
cattatcctg aagcaatgag tttctaacct gtaaatatac ttataacctg ngtgtcctct 60
cccccaaaac tgcaactgag ccatcatatg cttgagatca a 101
<210> 44
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 44
tcctcccaca taggtcaaat caataagaat ggtgatggtg tgaagcaagt ngaacctaag 60
agggaaggca tgtttgtaaa gatcaacatg gacagtgttc c 101
<210> 45
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 G
<400> 45
ctatatttta taacaacaac tttcgcaata tcatattttt atggattaat natgtggtaa 60
taaaaattct agttctccca aattaaggta caaaattaat g 101
<210> 46
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 46
cagcaagcca gcctccagtc gcagatgagc cgaatgatga acctcctgct ntggattttg 60
cgttcgtcca tgtaagtagt gatcttcact cgctagttgc t 101
<210> 47
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n - A 或 G
<400> 47
ctcacagagc tatacataaa caaaccatcc acaacaagaa gaaacgccat naacgaaaca 60
atacgaacgt gcgcgagctt agagacgtta ggagtcgtct c 101
<210> 48
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 48
tgataaggtt actgcaaaga aagttgtcag gaggagaaag agcagtacta nttcttgagg 60
agacaaaggt tataatcacc agttcttgct ccagttatta t 101
<210> 49
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 49
agataatgtg actgattggc atgaactaat cacagaatct ggacttcttg ntaagagtca 60
ttttactgat agagctgcag aaaccggaga ggcatcaata t 101
<210> 50
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 50
ctggagcatg tactcctcta cgcccgtgaa gaacagaact cctaccgcta ncaaacacgg 60
tatccaatgg actctcacca cgtggacagg attgcacatc c 101
<210> 51
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<400> 51
gactcagtga gagcccaagt ccgaaaagcc ctagaagagt acggatgttt ngaggccacg 60
ttcgatggag tttcagcgga gctaaggaag gctattttca a 101
<210> 52
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 52
tgatcaggct tctctatgtc atcaatcttc tctttaccac catcattaag nttctctttg 60
taatcaggca ttactttatg agcatgcttt ttttcaggat c 101
<210> 53
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 53
aaagaagagc ttagtcaacg cattgaagaa agatagtccg gtgggccaga ntcttgttct 60
ttgtttgaat ttggcattac cgggaaaggc atgtgagtgt g 101
<210> 54
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 54
acagaactgg tattaatagt agttgtaata acaatagtgt ccagtgttgt ncgatgggag 60
ggagtttaca gagaactcag acgttaccta gttacatagg a 101
<210> 55
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 55
cggggaggac gggaggcttt ttgacctcga ggtagggagt aggtgaggtg nggttttggg 60
atggaggaga gatgaggaga ggggagaaat gtggtggttt g 101
<210> 56
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 56
tgtggctttg ggaaatcata aacgttgttg aatacttctt tgatttgctc nggatccatt 60
atggtgatgg ttggtatagg tccaaaccat gtatagtaag t 101
<210> 57
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 A
<400> 57
tgacgagagc acagtcacgg aacagataat caacttgctt tgaatagatt nggacaacac 60
caagtaaaag atgaccagac aatctcaatg ccaaggtgcc t 101
<210> 58
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 A
<400> 58
gggatgctag gaatgttttt cgagccacga tattcacttg gaagaattca naccgttaaa 60
cttacaatgg tcctcactgt tgtggatgat acatgtgatg c 101
<210> 59
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 A
<400> 59
tcaatggcgg cggatcggag caaaggcgtt gtgagagacg agttcgtgac ntatgcttac 60
attcttctct acatcgctct ctctagcggt caaatcttct t 101
<210> 60
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 60
cggaacggtc gacttcatct tcggaaacgc cgctgtcgtt ctccaaaact ncgacatcca 60
cgctcgccga ccaaactccg gccagaaaaa cattgtcacg g 101
<210> 61
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<400> 61
atagagtccg gtggtcaagc tgagaagtct gctaagagaa agagaaagaa ncagtacagg 60
gggattaggc agcgaccttg gggaaaatgg gctgctgaga t 101
<210> 62
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 62
acgacgacca gatccgctct cactccgact cacccgatcc gtcttcttct ncgccgccgc 60
cgtcgggaaa agtcacggta acggtggctt tcccaggtcc g 101
<210> 63
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 63
gagaatcttg aaagcttcta gaagcttctg gaaaaaaagt tctttcccca nctccaactc 60
tctccccaat cccttgaaaa tatctacaat taatcataat t 101
<210> 64
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 64
cacagaacgc taacgcgcca gcgtaagtga acttatcgag cttcaaattg naatctctag 60
cttctaggaa cagcttcatg gagtgttcgt gaaacccaac t 101
<210> 65
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<400> 65
ggcagagact aaagagacaa gaaaccctag aagaaacaga gcagaagctg ntgccatagc 60
cacattcttc attactgttg aaagcaaaat atcttgcttt a 101
<210> 66
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 66
tagtagtgaa tgcgagcatt tgatctccgc tgcttatgag tttctgttgt ntaatggttt 60
cattaacttt ggggtgtctc cgttgtttaa tggatatgtt c 101
<210> 67
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 67
cgatgaaatt tgatcttcaa ggaattggaa acgaaagaga cttcattgat ncatctataa 60
agcaagtaag tatacttgac caagtagaga tcactcaagt a 101
<210> 68
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 T
<400> 68
ggaggaggga agattgattc aggtagccaa gggagagata ccatcaagaa ngggagtgaa 60
gagcgcatag attcggactt gagaagtagc gattttgtgt t 101
<210> 69
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 C
<400> 69
gctacgttgc gccgtatctc atggacagtt ttgttcagta cctgaacggt naaaggcaat 60
acaaatacca aggatacgtt ttggtaacga ttttcttcgt t 101
<210> 70
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 G
<400> 70
ctcaatgatg aagaagatga gaatgatgat gctgttaagg agatgcaaga ncgtgtccac 60
acaattaagt cgttcatatt cctacacaag cctcagatcc c 101
<210> 71
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 A
<400> 71
atcatatggg gaggcactgg tagccgtggg aggttgaagc tgaaagtagg ngagtctcca 60
gagagctgga ctactggagt tgatctggga aggttactta c 101
<210> 72
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 72
aaagctgctt cgatctgcca atcactggct ttaagagcct gaagagcact nttctcactg 60
ctcccccagc acattattaa acaaatcaca cacacaaaaa a 101
<210> 73
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 73
gtaaataaag agtaacaatc attacattgg cgacaaagat tgttcgagac ntagcatctt 60
ccaaagggcg gctagtagat aatgtcccta caaataccag t 101
<210> 74
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 G
<400> 74
cttgaaaacg tagaagaaag cgttgcgttt tatgagaagc agttctctgt nccaacagat 60
cttgaagagg tcagatttgg ggacagagtg tttgttgaat a 101
<210> 75
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 75
gttgaatacg agagaagctg gatgtgattt gaatctgtcg taagggacgg ntagttcgtt 60
ttcaagattg gcaccgacat ggaaggtttt ggactgtttg g 101
<210> 76
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 T
<400> 76
aatggggaaa actagacctg ttgtgactct tttcttttga ccacctgaaa ntcctcgtgt 60
catttcgtct ccgaccatcg tatctttgca taagtcaagc c 101
<210> 77
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 77
acctgaaatt cctcgtgtca tttcgtctcc gaccatcgta tctttgcata ngtcaagccc 60
taatatctaa aatagaaaat gatcaatagt tgcccaaatt t 101
<210> 78
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> N = T 或 C
<400> 78
gttagagata ttaaatctag gttaaaagtg agatcattac tttgagagtg nagtctgtga 60
tgagactgct cttgacattc ccagctgcga tggacttcat g 101
<210> 79
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 79
gagttaatta ccttgagggt ttcatgatac cagaagcttc tctaagaata ntgagtttag 60
tggtttttgc aaagtttaaa ccaaataaac gaaggcctct c 101
<210> 80
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 G
<400> 80
gagtgcaagt ggaactgcta cgccaccagt aaaccaagtc ccaaggactc ntgcaacaaa 60
ctcagctgat ggtttcgcca caattccaac tctagctcct t 101
<210> 81
<211> 102
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<221> 尚未归类的特征
<222> 52
<223> n = C 或 A
<400> 81
ggataggtta gaagtagaaa tagcaacaaa aattcaaaca gatcaccata nntacatttt 60
tagtatcttc cttgtggaac aacttagaga tggtaaaggc ag 102
<210> 82
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 T
<400> 82
ccacaaacca cctctccttt attcgacacg gcaatgagtc cagcgaaccc ntcgtcgagc 60
cgatgcttga tgacgtaatc aaccgcttct tgtagcccaa c 101
<210> 83
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 A
<400> 83
gcttctttgg ccagcttgag catccccacg ttgtcttccg tgacgaagta ntcgttgtcc 60
acagtttcaa ctccctaata aaaaccaaat cgatttcggt t 101
<210> 84
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<400> 84
cagcaagtga ccaggaaggt catgttccag tgactcactt gagtaaaagt nccagtactt 60
atcagcaata cggttaactt tctcaatgca ttccaagctt g 101
<210> 85
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 85
ttgtagatcg atcgttgcgt agagctgtgt ttctcctttg ccgaaaccaa ntgcctcttc 60
aacatttgct ctaatctgga atttaaaaca gaggttaaag a 101
<210> 86
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 86
tggtgctttc ctttaggcct cacaacataa gtccttccaa actcatatcc ncttgtactt 60
ctactaccta caaatatttt gccagaaaca tattcaagca g 101
<210> 87
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 G
<400> 87
ggaagtcgag agatgatgag tgctcaacgg ttcctgagaa tgagtctgtg nttggttcag 60
aatgtcagtt tgaatattct gatgatgatg atactgcaca t 101
<210> 88
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 88
gatgatgagt gctcaacggt tcctgagaat gagtctgtgt ttggttcaga ntgtcagttt 60
gaatattctg atgatgatga tactgcacat ggaagtgtgc a 101
<210> 89
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 89
caaggaaagc aaaagatgaa ggtaaaggtg tgagggcagg agaagatggt nttgtgaata 60
catcagcaaa ctctaaagaa gattctagag gtgttacaca t 101
<210> 90
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 90
cgatcctcgc tacggaactc tccacttcca aagctagtgg aaggccgcaa ntatccccac 60
gcacctgagg catctccctc attatcttct tcctcgtcaa a 101
<210> 91
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 A
<400> 91
agataaaaac cgaacctttt ggaaggttct caagctagac agaacagagc naacagagct 60
caactttcac caagactcaa ctccttacac agaatccgaa t 101
<210> 92
<211> 103
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或不存在
<221> 尚未归类的特征
<222> 52
<223> n - T 或不存在
<221> 尚未归类的特征
<222> 53
<223> n = T 或不存在
<400> 92
cacattaaac cggaagctaa tcgccggtgt cgacgacgag agctccgaag nnncttcttc 60
ttctactact catggtgctt ctttgaggat tgatcgtgtt tcg 103
<210> 93
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 93
attatctatt gatacctgag tcttaagccg ctgatgacta gtagaatgag nctcatcgaa 60
gcagaaaata aaacggtact gctaataacc aatccaagat a 101
<210> 94
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 94
tgatacctga gtcttaagcc gctgatgact agtagaatga ggctcatcga ngcagaaaat 60
aaaacggtac tgctaataac caatccaaga tatatagaga c 101
<210> 95
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 T
<400> 95
aagccgctga tgactagtag aatgaggctc atcgaagcag aaaataaaac ngtactgcta 60
ataaccaatc caagatatat agagaccacg cttggaactc t 101
<210> 96
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 96
cctctgtatt tgacatctct tacatctata aatgtccctt atttttactt nactgtaagt 60
ttggacccaa atcttgtctt gttgaaaatt ctgccattga a 101
<210> 97
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<400> 97
ggtttcggcc tttcaaaaaa aactgttaac caaatttcga aatgaacgaa ncgaattaat 60
caaaattttg aactgaaatt accatagttt aattgaattt t 101
<210> 98
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 98
cgcaaacgcc aagtcaggag cattaatcgc tgaaactcca cttgttgttg ngttggcttt 60
tgcagcagaa ggtggcttag cagtagcggc agtagcagca g 101
<210> 99
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 99
gaggtttcta cacttatgat gcctttatca ccgccgctaa atatttccct ngcttctgca 60
acaatggaga cactgccgca aggaagaaag agctctctgc c 101
<210> 100
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 100
aatcgcaaat gtttcctgtc acagggacaa gcttgtctaa catgaaagac ntgaaagatg 60
ctccatgagt ctctcttaga tttttaaaaa gctctgcatc t 101
<210> 101
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 101
cgcaaatgtt tcctgtcaca gggacaagct tgtctaacat gaaagacatg naagatgctc 60
catgagtctc tcttagattt ttaaaaagct ctgcatctaa c 101
<210> 102
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 102
tatcttatta aaatagaaat acatttaaag aatatttgga aacataaata ncagtaaaaa 60
aatataatat tatttgaaaa catagatatc aatatattaa a 101
<210> 103
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 103
cttagacaaa gactcagcgg actctttgtg cacaatagta acggcatcac ngtcttcagg 60
cacaggaaga gacgaaatgg tttcagattc cctgggagga c 101
<210> 104
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 T
<400> 104
ttcaagtccc taacctctct caaagccata aaagctctta actagagaat naattcaaag 60
accaatagta tgttcttcat tcccactatt tatagcctat c 101
<210> 105
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 105
gatcatgttc cgttttggat acttatgagg aaatacacca agttgaggcg nctagacgag 60
gcgtatttag cttacaaaaa atggctaatg acgaggagca g 101
<210> 106
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 C
<400> 106
gcgttgaaaa acttcggcga caccaccacc gccggtaccg ccgctccgtc ntcctcctcc 60
tcgccgtcgt taacgaccgt gatcattgga gccttgaagc t 101
<210> 107
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 107
ttaagctcaa gaaagccaaa gtcagacctg ttctgttctc gtgtccgacg ntccggtggg 60
gaaaccggca gccacggtcg agaaaagaag ctgaatcagc g 101
<210> 108
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 108
tatatatagg tggatctctg agtgctgtgg aaacattagc ttctacttct ntttgcggaa 60
tcatccacgc catctttggt ggacagccat tgttgatact t 101
<210> 109
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<400> 109
tgttttaata ggacgagcta tgggaagcct gtttaacaat gatgggcctg nctgcaaacc 60
ctgaaacgtc tccccagaat ttagcattgt acaaacttta a 101
<210> 110
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 110
tccgaaatac ccaaaaatac ctaatctaaa caaaatattt cgcatacttt nggtacccga 60
tcgggtctcc ggtaagatcc agacccaaac cgagatcgta t 101
<210> 111
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 111
tacatgctaa cagtgatgtg atattgttca ctcgagggag ttgaaacggg ntctacggct 60
gcacccaggg cgaatctagt tgttgtttgg acaaaaccgg a 101
<210> 112
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 112
gatgcttcca ccgacggcgt tggcttactc agctcccccc gtgacggcgg nggtggcgtt 60
gatagtcttg attacgaggt tatcgagaat tacgcttaca g 101
<210> 113
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 113
ccgtgtggtg gtagaatcat cgacgaggtt tgcgtcaagg aggagtacga nactcgtccc 60
gggaagcgct tcttcagctg cataaactac gaggtaaccc a 101
<210> 114
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 114
tataaagcca gcggtagcgc ttacggttta tggcgataaa tcagcgttct ncaactgcgg 60
tttcttgggg ttacaagata cgttgtggga tgttcaaggc a 101
<210> 115
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 115
aggtcttctg ccaaacccaa gcctgtggat caacgttgct ccttggtaca naccaagtga 60
gtgatgggct ttcaccatct cctttactgc ttcgataagt t 101
<210> 116
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 116
caataatgtg aactctcttt tcttcaagaa gtctagccca aacctgatca nagcctggtt 60
aagtagcaca ccatctcctt taaggaaaaa gcctcttcct c 101
<210> 117
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 117
cgtcgatagt tcacagagac aacaacgaaa ccgcacagac caacaagcct ncggcaaaga 60
gtgtcataga tagcactgtt tgcagaagag tgcacaaagc t 101
<210> 118
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 118
gttacagata cgagatggag ccgtttggtg tacggttaaa ggccttttgc ntactctctt 60
ccgtggagaa gaaggtgttc aacgagctga taccttcgct c 101
<210> 119
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 T
<400> 119
taatccctta gattcaagca gcaacgcctg taggctccct gagattcatt ncccattatg 60
tgtcttagcc atcaatctaa ttgcataaac tagtaagaac a 101
<210> 120
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 120
gccggtctag cacataagat ctcaaacaaa acaactccaa aagagtacac ntctgacttc 60
tcggttaact gctgtctcct aaagtactct ggatctaagt a 101
<210> 121
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 121
tggttggact gtgcaatccg aggctttgac tctttcatca ggatggggac ngcatcgttt 60
ttctcaatca tgtggtgtgg tgtcttctca gcgttttcca t 101
<210> 122
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 122
cttggataag agtttatagg aaaaccaaaa ttcgcttgca atgagtatca ntattaaacc 60
gatcatgagg agatcataac aactagaatt taaatgatgt t 101
<210> 123
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 123
ttgtgtagat ggtcgcatat tgcaacacat ctaccaggaa gaacagacaa ngaaattaaa 60
aactattgga attcacatct cagccgcaaa atctatgcct t 101
<210> 124
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 124
acagggtata cctgtggctg agacattcta taataaggct ccttcaagtc nagtttgcac 60
gatgatgttt ggaggattcc accttgattg gcaccgggcc c 101
<210> 125
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 A
<400> 125
ctccctactg atttctccag gtttaagacg atgcacatgt acgatatcgt ngtcaagaac 60
cgcaacatgt tccaagtaag ggatatgtag ccatattttg g 101
<210> 126
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 A
<400> 126
aaacgagatg attttccttt aaacgtttaa aaaaaatcaa tctaggcatt naaaaaatcg 60
gtctgccaat actattagct attttctgaa ctttggttgc t 101
<210> 127
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 127
gcagcggttc gctccttctt gtgggcgttc tggtggcctc ctaaggcttg ngaactctgg 60
aactttctag aacaaaagag gcaagagaat actcttgatg a 101
<210> 128
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 128
tttaggaaga ttagacagaa cataccactg tcagtagctt tgacgatggc nttactgata 60
agaggcactt tagaacacat ggcagcaact acctgcatgc t 101
<210> 129
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 129
tccctctgtc aaaactgtga ctggttaggc cacaacggag ctactaattc ncatcataag 60
aagcaaacca ttaactgcta ctctggttgc ccctcgagtg a 101
<210> 130
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 130
ctgtgataaa cgatctttga ccatcattac aactatttca ttagggacca nttgtccttt 60
ctccatgtgt tcttttgcca gtcttccatt ctcactccca g 101
<210> 131
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 131
ggaactattt tctaagtgga tcaactcaaa cgacgccgtt tcgcttctat ntaagtcaaa 60
agtcctctct tttatgtttt gtatccaaag tatacagctt t 101
<210> 132
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 132
gagttttgca gcagcagatt acttcccggt aattggtaaa ttaatcgata ngatcacagg 60
gttacatagc aaatgtgaga aggtttttaa agcaatggat g 101
<210> 133
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n - G 或 A
<400> 133
tgagaaggtt tttaaagcaa tggatgcatt tttcgatcaa tctataaagc ntcatcttga 60
agacgagagc cttgaagatg atatcatagc cttgctctta a 101
<210> 134
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 134
ttgatcttga agaatcatat ggactcgtat gtcctaagaa agttccactt nagcttatcc 60
cgattcttac tcaatggact tgacttcgat ttatattttc g 101
<210> 135
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 135
actgaaactt cctataattg gcaacttgca ccaattaggc tcgcagcctc ntcgttcatt 60
aacaaaatta tctgaaaagt atggacctct aatgtcccta a 101
<210> 136
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 136
gttgtatgaa agtcttgcag cgtacgtcaa gtaaggtcgt gaacaacaat naacgtcgaa 60
cgttttcaag acatctttca ctgtctctgg agttgacgcc a 101
<210> 137
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n= A 或 C
<400> 137
ttcaagacat ctttcactgt ctctggagtt gacgccacaa cggtagacac ntttccaagc 60
ttgagggaca ttagagctcc atatttttca gataatttga a 101
<210> 138
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 T
<400> 138
catggaacga tgaggtttgg atcccagttg gtgcaagtta ccaattataa naagccttgg 60
tggtccagga ggtaggtttt tctttgtctt tctcgtgttc t 101
<210> 139
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 139
ctacatatgc atagtttcca tacagagaga tagatagcag taggtataag ntaagctaag 60
ctaacctaca gatataatga aacaattaca agatgtaaaa a 101
<210> 140
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 C
<400> 140
tttagctgtg ttcctcacct cattcgccaa ttctatcacg aactcttcct natgctctgt 60
tttgacaaca ttcatcaaac aaatcaacgc caaaaatctt a 101
<210> 141
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<400> 141
ttgaaaaggt actcccggtt gttcccacaa ggttcagaag ctgtggcgat ntgcatggcc 60
atctcctcca aaagtagtat ttgttcgaca ctttgtctgg t 101
<210> 142
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<400> 142
tcgacaaggg ttttagagtc gtattcacac tctcttcgtt ccaagtactc natggctagc 60
ttctccttct caggtcctcc atgaacacaa taagcagcac c 101
<210> 143
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 143
caacattgat ctatttcttt gttgataatt caagaacaag tgtgttgtaa ncataccgag 60
atcaaagacg cgtttgtagt ctttaatatt gccaatgagt t 101
<210> 144
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 A
<400> 144
gtgtgttgta aacataccga gatcaaagac gcgtttgtag tctttaatat ngccaatgag 60
tttttcgtca aaatcgaaac ctgggttcca tattatagat c 101
<210> 145
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 T
<400> 145
ccgagatcaa agacgcgttt gtagtcttta atattgccaa tgagtttttc ntcaaaatcg 60
aaacctgggt tccatattat agatccatat ccgaattccc a 101
<210> 146
<211> 102
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<221> 尚未归类的特征
<222> 52
<223> n = T 或 A
<400> 146
ttttcgtcaa aatcgaaacc tgggttccat attatagatc catatccgaa nncccacaat 60
accatcttga acgttaaagt ctcttttagg aagaagaaat ag 102
<210> 147
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 T
<400> 147
cctaaatcaa gcaagcttct cgattcgatt cgactcgatc atcatcatgc nctcgaatca 60
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<210> 148
<211> 102
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 148
acttaattca ctttttaaaa ctgttactat tatcacacac taccatttaa nattgccttc 60
ttctttgagt tataggcaag ttggaaaagc cttctttttg ta 102
<210> 149
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 149
aagggtaacg attctccggc gcacgtcgat agttcacaga gacaacaacg naaccgcaca 60
gaccaacaag cctgcggcaa agagtgtcat agatagcact g 101
<210> 150
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 A
<400> 150
gattctagca ttttactcac agtgagaaca tcggcaagcg tagtcttttc ntcatcggag 60
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<210> 151
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 151
ttctgcctct tgagagaaaa tcatgccaac gggtaggttc gagacgatgc ntgaatgggt 60
tcacgacgcc atctctgctc aacgcaatga gctcctctct c 101
<210> 152
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 152
tatagtctct ccaggagctg atatgaccat atactttcct tattctgaca nggaaagaag 60
actaactgcc cttcatgagt ctattgaaga acttctgttt a 101
<210> 153
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 153
atgataattt ttttctggtt ttgcaggcca attcaatccc actggcaact natgagcatt 60
gagcaagcta tggttggatt ctaatacttg ctgcactccc t 101
<210> 154
<211> 103
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<221> 尚未归类的特征
<222> 53
<223> n = C 或 T
<400> 154
tacaaatttg gctcaagtct gggcacaaac aacagctagt tttccatagc ngnatcagga 60
aggggagaat catgagccag tgactgcaga agagagatac aac 103
<210> 155
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 C
<400> 155
atgaaattta ggtcctgtga agcaaatgac cttgtacagt cctttgtaat naagagtgcc 60
aagatctgct gaaatagatc catcatccaa tctatcaacc a 101
<210> 156
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 C
<400> 156
tgaatggtgt tgaaaagttt accatacctg acagctttat ttgataacat nttcgtaccg 60
tgcatggctc tctgcacata cccaaatcta tcagccttga c 101
<210> 157
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<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 157
taccggagaa gaataagcgg tgaacctcag cttcttcgcc atatctccac ncataagcat 60
tctgtcgaac acctgatggg cgcatagatt catttttcac t 101
<210> 158
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 G
<400> 158
cggagaagaa taagcggtga acctcagctt cttcgccata tctccacaca naagcattct 60
gtcgaacacc tgatgggcgc atagattcat ttttcacttt t 101
<210> 159
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 159
aatgttgtgg caggcgttgt ctataagtag gtcactggcc atggctaaag nttctgcaca 60
acaagggcaa accagttgta aagagcttaa ggatatgata a 101
<210> 160
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<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 G
<400> 160
ggcaggcgtt gtctataagt aggtcactgg ccatggctaa agattctgca naacaagggc 60
aaaccagttg taaagagctt aaggatatga taatttcaga g 101
<210> 161
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 161
ggtcactggc catggctaaa gattctgcac aacaagggca aaccagttgt naagagctta 60
aggatatgat aatttcagag attgttggag ctgcaggaag a 101
<210> 162
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 G
<400> 162
gtgtgtacaa catgcagatt gttgatcaag aaactcttga aggagtagaa nagatagaga 60
gtggagtagt gatttgtgtt gctgcctggt ttggaacggt t 101
<210> 163
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<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<221> 尚未归类的特征
<222> 53
<223> n = A 或 T
<400> 163
ctgcctggtt tggaacggtt aggctcatag acaacattga gatcaatgtc ncngtctaat 60
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<210> 164
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 G
<400> 164
aaaatccgag ctcttgttct ggttagactg ggtctggttt gaaggaggag naacaaactt 60
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<210> 165
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 165
ctggttagac tgggtctggt ttgaaggagg agcaacaaac ttggttttgg ntgggacagt 60
ggcggagtca atatcaccga cgtagtactc atcaagcatg g 101
<210> 166
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 G
<400> 166
cgtcgatgac gatccaacag tcctggttgc tagtgtgctg agaaacctcc nccaaggtga 60
acactttgcc gtctccgccc atctcccgat gatcctcaat t 101
<210> 167
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 C
<400> 167
agcgttcgga ttctttacga acatcaaaag cttatactcc ggacaagttc nagtcaaaat 60
ctcacgtaga ataatctcaa cggtttcact aaatcttcta g 101
<210> 168
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = T 或 G
<400> 168
ggaacgcggt ttcctgcgtt tccgcctctg gttttcaatt ttaccgcgga ngatcaaccg 60
ttgattttgc agacttcgag acttgctacg gaagtaaaga t 101
<210> 169
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 169
ctctggtttt caattttacc gcggatgatc aaccgttgat tttgcagact ncgagacttg 60
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<210> 170
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 T
<400> 170
gagacttgct acggaagtaa agatgattaa gtacggagaa gcggttgaaa nggtttttca 60
agggacgagt ttaggtggtg gtggaatcga ccaccccatg c 101
<210> 171
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 171
actatgatct cagaagtttt ggacccatat ttgaagccat ccaagatgtg nttgcatcga 60
cgagctgggc aagatctttg gacgtgtatg cacgaagaat c 101
<210> 172
<211> 103
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<221> 尚未归类的特征
<222> 53
<223> n = C 或 T
<400> 172
tttggaccca tatttgaagc catccaagat gtggttgcat cgacgagctg ngnaagatct 60
ttggacgtgt atgcacgaag aatcttcgag tccattccaa gcg 103
<210> 173
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 A
<400> 173
aagccatcca agatgtggtt gcatcgacga gctgggcaag atctttggac ntgtatgcac 60
gaagaatctt cgagtccatt ccaagcgtac ctccaacctc t 101
<210> 174
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 C
<400> 174
catccaagat gtggttgcat cgacgagctg ggcaagatct ttggacgtgt ntgcacgaag 60
aatcttcgag tccattccaa gcgtacctcc aacctcttta g 101
<210> 175
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = G 或 C
<400> 175
actccatcca atacagctaa gctactgcga aagaaaatca atcacctcga nttctgacca 60
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<210> 176
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = A 或 G
<400> 176
gactcttcgt gagacgcgct ctttgtcgaa tctgatcacc gagaatggag nccggcgagt 60
ggaagagaag ttagagagtc tccggcgggg agagaaagac g 101
<210> 177
<211> 101
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> 51
<223> n = C 或 A
<400> 177
tctaggttgc agcccaaatc cggtagcctc ggatcttttc ataatcctca ncctcctgca 60
tgactctatg aacattctgc aaaatcaaaa tacccaaccc a 101

Claims (67)

1.一种芸苔属(Brassica)植物或其部分，包含能够遗传地整合进其基因组中的一个或多个T-DNA，所述T-DNA包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒具有编码一个或多个d12DES、一个或多个d6Elo、一个或多个d6Des、一个或多个d5Des、一个或多个d5Elo、一个或多个d4Des和/或一个或多个o3Des的核苷酸序列；其中所述植物是第二亲本芸苔属植物与包含所述一个或多个T-DNA的第一亲本芸苔属植物杂交的结果；并且其中与所述第一亲本芸苔属植物和/或所述第二亲本芸苔属植物相比，所述芸苔属植物在其种子中产生更大量的选自EPA、DPA和DHA的一种或多种多不饱和脂肪酸。
2.一种芸苔属植物或其部分，包含：
(i)能够遗传地整合进其基因组中的一个或多个T-DNA，所述T-DNA包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒具有编码一个或多个d12DES、一个或多个d6Elo、一个或多个d6Des、一个或多个d5Des、一个或多个d5Elo、一个或多个d4Des和/或一个或多个o3Des的核苷酸序列；和
(ii)赋予更高的多不饱和脂肪酸含量的甘蓝型油菜(B.napus)亲本基因组的至少一个基因组序列的全部或部分，其中所述基因组序列选自：
a)染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的所述基因组序列；
b)染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的所述基因组序列；和
c)染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的所述基因组序列；
其中与缺乏(i)和/或(ii)的对照芸苔属植物的种子相比，所述芸苔属植物的种子具有更大量的选自EPA、DPA和DHA的一种或多种多不饱和脂肪酸。
3.根据权利要求2所述的芸苔属植物或其部分，其中染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的所述基因组序列包含在选自以下位置的一个位置处的一个单核苷酸多态性(SNP)：8,952,616、9,040,901、9,046,609、9,048,617、9,136,686、9,143,608、9,248,592、9,347,120、9,352,326、9,454,361、9,549,523、9,641,936、9,652,028、9,794,198、9,847,417、9,921,975、9,952,792、10,052,015、10,402,684、10,425,211、10,558,464、10,613,015、10,659,284、10,706,805、10,748,492、10,852,010、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,343,118、11,455,979、11,565,970、11,659,776、11,726,807和11,850,103。
4.根据权利要求3所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的5个不同位置处的至少5个SNP：8,952,616、9,040,901、9,046,609、9,048,617、9,136,686、9,143,608、9,248,592、9,347,120、9,352,326、9,454,361、9,549,523、9,641,936、9,652,028、9,794,198、9,847,417、9,921,975、9,952,792、10,052,015、10,402,684、10,425,211、10,558,464、10,613,015、10,659,284、10,706,805、10,748,492、10,852,010、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,343,118、11,455,979、11,565,970、11,659,776、11,726,807和11,850,103。
5.根据权利要求3所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的10个不同位置处的至少10个SNP：8,952,616、9,040,901、9,046,609、9,048,617、9,136,686、9,143,608、9,248,592、9,347,120、9,352,326、9,454,361、9,549,523、9,641,936、9,652,028、9,794,198、9,847,417、9,921,975、9,952,792、10,052,015、10,402,684、10,425,211、10,558,464、10,613,015、10,659,284、10,706,805、10,748,492、10,852,010、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,343,118、11,455,979、11,565,970、11,659,776、11,726,807和11,850,103。
6.根据权利要求3所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的20个不同位置处的至少20个SNP：8,952,616、9,040,901、9,046,609、9,048,617、9,136,686、9,143,608、9,248,592、9,347,120、9,352,326、9,454,361、9,549,523、9,641,936、9,652,028、9,794,198、9,847,417、9,921,975、9,952,792、10,052,015、10,402,684、10,425,211、10,558,464、10,613,015、10,659,284、10,706,805、10,748,492、10,852,010、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,343,118、11,455,979、11,565,970、11,659,776、11,726,807和11,850,103。
7.根据权利要求3所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的30个不同位置处的至少30个SNP：8,952,616、9,040,901、9,046,609、9,048,617、9,136,686、9,143,608、9,248,592、9,347,120、9,352,326、9,454,361、9,549,523、9,641,936、9,652,028、9,794,198、9,847,417、9,921,975、9,952,792、10,052,015、10,402,684、10,425,211、10,558,464、10,613,015、10,659,284、10,706,805、10,748,492、10,852,010、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,343,118、11,455,979、11,565,970、11,659,776、11,726,807和11,850,103。
8.根据权利要求3所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的40个不同位置处的至少40个SNP：8,952,616、9,040,901、9,046,609、9,048,617、9,136,686、9,143,608、9,248,592、9,347,120、9,352,326、9,454,361、9,549,523、9,641,936、9,652,028、9,794,198、9,847,417、9,921,975、9,952,792、10,052,015、10,402,684、10,425,211、10,558,464、10,613,015、10,659,284、10,706,805、10,748,492、10,852,010、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,343,118、11,455,979、11,565,970、11,659,776、11,726,807和11,850,103。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的所述基因组序列包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：9,136,686、9,641,936、10,613,015、9,040,901、9,048,617、9,352,326、9,921,975和10,706,805。
10.根据权利要求9所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的2个不同位置处的至少2个SNP：9,136,686、9,641,936、10,613,015、9,040,901、9,048,617、9,352,326、9,921,975和10,706,805。
11.根据权利要求9所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的4个不同位置处的至少4个SNP：9,136,686、9,641,936、10,613,015、9,040,901、9,048,617、9,352,326、9,921,975和10,706,805。
12.根据权利要求9所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的6个不同位置处的至少6个SNP：9,136,686、9,641,936、10,613,015、9,040,901、9,048,617、9,352,326、9,921,975和10,706,805。
13.根据权利要求9所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的8个不同位置处的至少8个SNP：9,136,686、9,641,936、10,613,015、9,040,901、9,048,617、9,352,326、9,921,975和10,706,805。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的所述基因组序列包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：22,823,086、22,880,595、22,902,670、22,949,738、23,011,207、23,044,228、23,099,592、23,176,771、23,201,595、23,257,618、23,302,268、23,367,822、23,380,089、23,457,696、23,520,607、23,552,773、23,598,941、23,670,623、23,682,848、23,745,365、23,792,572、23,855,829、23,910,029、23,947,522和24,021,883。
15.根据权利要求14所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的5个不同位置处的至少5个SNP：22,823,086、22,880,595、22,902,670、22,949,738、23,011,207、23,044,228、23,099,592、23,176,771、23,201,595、23,257,618、23,302,268、23,367,822、23,380,089、23,457,696、23,520,607、23,552,773、23,598,941、23,670,623、23,682,848、23,745,365、23,792,572、23,855,829、23,910,029、23,947,522和24,021,883。
16.根据权利要求14所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的10个不同位置处的至少10个SNP：22,823,086、22,880,595、22,902,670、22,949,738、23,011,207、23,044,228、23,099,592、23,176,771、23,201,595、23,257,618、23,302,268、23,367,822、23,380,089、23,457,696、23,520,607、23,552,773、23,598,941、23,670,623、23,682,848、23,745,365、23,792,572、23,855,829、23,910,029、23,947,522和24,021,883。
17.根据权利要求14所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的20个不同位置处的至少20个SNP：22,823,086、22,880,595、22,902,670、22,949,738、23,011,207、23,044,228、23,099,592、23,176,771、23,201,595、23,257,618、23,302,268、23,367,822、23,380,089、23,457,696、23,520,607、23,552,773、23,598,941、23,670,623、23,682,848、23,745,365、23,792,572、23,855,829、23,910,029、23,947,522和24,021,883。
18.根据权利要求14所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的30个不同位置处的至少30个SNP：22,823,086、22,880,595、22,902,670、22,949,738、23,011,207、23,044,228、23,099,592、23,176,771、23,201,595、23,257,618、23,302,268、23,367,822、23,380,089、23,457,696、23,520,607、23,552,773、23,598,941、23,670,623、23,682,848、23,745,365、23,792,572、23,855,829、23,910,029、23,947,522和24,021,883。
19.根据权利要求2至18中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的所述基因组序列包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：23,089,542、23,089,635、23,090,743、23,090,785、23,091,367、23,092,042、23,150,402、23,150,595、23,155,220、23,155,766、23,314,197、23,318,357、23,343,089、23,679,276、23,679,287、23,679,396、23,886,929、23,925,895、23,963,309、24,029,270、24,029,279和24,029,294。
20.根据权利要求19所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的5个不同位置处的至少5个SNP：23,089,542、23,089,635、23,090,743、23,090,785、23,091,367、23,092,042、23,150,402、23,150,595、23,155,220、23,155,766、23,314,197、23,318,357、23,343,089、23,679,276、23,679,287、23,679,396、23,886,929、23,925,895、23,963,309、24,029,270、24,029,279和24,029,294。
21.根据权利要求19所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的10个不同位置处的至少10个SNP：23,089,542、23,089,635、23,090,743、23,090,785、23,091,367、23,092,042、23,150,402、23,150,595、23,155,220、23,155,766、23,314,197、23,318,357、23,343,089、23,679,276、23,679,287、23,679,396、23,886,929、23,925,895、23,963,309、24,029,270、24,029,279和24,029,294。
22.根据权利要求19所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的20个不同位置处的至少20个SNP：23,089,542、23,089,635、23,090,743、23,090,785、23,091,367、23,092,042、23,150,402、23,150,595、23,155,220、23,155,766、23,314,197、23,318,357、23,343,089、23,679,276、23,679,287、23,679,396、23,886,929、23,925,895、23,963,309、24,029,270、24,029,279和24,029,294。
23.根据权利要求19所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的25个不同位置处的至少25个SNP：23,089,542、23,089,635、23,090,743、23,090,785、23,091,367、23,092,042、23,150,402、23,150,595、23,155,220、23,155,766、23,314,197、23,318,357、23,343,089、23,679,276、23,679,287、23,679,396、23,886,929、23,925,895、23,963,309、24,029,270、24,029,279和24,029,294。
24.根据权利要求2至23中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的所述基因组序列包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：19,156,645、19,199,109、19,325,186、19,402,086、19,513,420、19,583,431、19,601,021、19,706,563、19,800,643、19,906,666、20,000,119、20,095,002、20,205,211、20,300,571、20,406,148、20,407,023、20,505,840、20,601,198、20,631,917和20,702,631。
25.根据权利要求24所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的5个不同位置处的至少5个SNP：19,156,645、19,199,109、19,325,186、19,402,086、19,513,420、19,583,431、19,601,021、19,706,563、19,800,643、19,906,666、20,000,119、20,095,002、20,205,211、20,300,571、20,406,148、20,407,023、20,505,840、20,601,198、20,631,917和20,702,631。
26.根据权利要求24所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的10个不同位置处的至少10个SNP：19,156,645、19,199,109、19,325,186、19,402,086、19,513,420、19,583,431、19,601,021、19,706,563、19,800,643、19,906,666、20,000,119、20,095,002、20,205,211、20,300,571、20,406,148、20,407,023、20,505,840、20,601,198、20,631,917和20,702,631。
27.根据权利要求24所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的15个不同位置处的至少15个SNP：19，156,645、19,199,109、19,325,186、19,402,086、19,513,420、19,583,431、19,601,021、19,706,563、19,800,643、19,906,666、20,000,119、20,095,002、20,205,211、20,300,571、20,406,148、20,407,023、20,505,840、20,601,198、20,631,917和20,702,631。
28.根据权利要求24所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的20个不同位置处的至少20个SNP：19,156,645、19,199,109、19,325,186、19,402,086、19,513,420、19,583,431、19,601,021、19,706,563、19,800,643、19,906,666、20,000,119、20,095,002、20,205,211、20,300,571、20,406,148、20,407,023、20,505,840、20,601,198、20,631,917和20,702,631。
29.根据权利要求24所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的30个不同位置处的至少30个SNP：19,156,645、19,199,109、19,325,186、19,402,086、19,513,420、19,583,431、19,601,021、19,706,563、19,800,643、19,906,666、20,000,119、20,095,002、20,205,211、20,300,571、20,406,148、20,407,023、20,505,840、20,601,198、20,631,917和20,702,631。
30.根据权利要求2至29中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的所述基因组序列包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：19,336,744、19,336,819、19，337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,476,836、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、20,191,826、20,300,548、20,375,643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570和20,827,573。
31.根据权利要求30所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的5个不同位置处的至少5个SNP：19,336,744、19,336,819、19,337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,476,836、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、20,191,826、20,300,548、20,375,643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570和20,827,573。
32.根据权利要求30所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的10个不同位置处的至少10个SNP：19,336,744、19,336,819、19,337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,476,836、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、20,191,826、20,300,548、20,375,643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570和20,827,573。
33.根据权利要求30所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的20个不同位置处的至少20个SNP：19,336,744、19,336,819、19,337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,476,836、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、20,191,826、20,300,548、20,375,643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570和20,827,573。
34.根据权利要求30所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的30个不同位置处的至少30个SNP：19,336,744、19,336,819、19,337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,476,836、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、20,191,826、20,300,548、20,375,643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570和20,827,573。
35.根据权利要求30所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含在选自以下位置的40个不同位置处的至少40个SNP：19,336,744、19,336,819、19,337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,476,836、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、20,191,826、20,300,548、20,375,643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570和20,827,573。
36.根据权利要求2至35中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的所述基因组序列的全部或部分，和染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的所述基因组序列的全部或部分。
37.根据权利要求2至35中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的所述基因组序列的全部或部分，和染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的所述基因组序列的全部或部分。
38.根据权利要求2至35中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的所述基因组序列的全部或部分，和染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的所述基因组序列的全部或部分。
39.根据权利要求2至38中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述基因组序列包含所述甘蓝型油菜亲本基因组的所述基因组序列的25至50、25至100、50至200、100至500、250至1,000、500至5,000、2,000至10,000、5,000至20,000、10,000至100,000、50,000至400,000、25,000至1,000,000、100,000至1,000,000、200,000至1,000,000或500至1,000,000个连续核苷酸。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述表达盒包含编码以下的核苷酸序列：
a)一个或多个d12DES和/或一个或多个d6Elo；
b)一个或多个d6Elo和/或一个或多个d6Des；
c)一个或多个d6Des和/或一个或多个d5Des；
d)一个或多个d5Des和/或一个或多个d5Elo；
e)一个或多个d5Elo和/或一个或多个d4Des；
f)一个或多个d4Des和/或一个或多个o3Des；
g)一个或多个d12DES和/或一个或多个d6Des；
h)一个或多个d12DES和/或一个或多个d5Des；
i)一个或多个d12DES和/或一个或多个d5Elo；
j)一个或多个d12DES和/或一个或多个d4Des；
k)一个或多个d12DES和/或一个或多个o3Des；
l)一个或多个d6Elo和/或一个或多个d5Des；
m)一个或多个d6Elo和/或一个或多个d5Elo；
n)一个或多个d6Elo和/或一个或多个d4Des；和/或
o)一个或多个d6Elo和/或一个或多个o3Des。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述一个或多个表达盒包含编码d6Des的至少两个核苷酸序列、编码d6Elo的至少两个核苷酸序列和/或编码o3Des的至少两个核苷酸序列。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述一个或多个表达盒包含编码CoA依赖性d4Des和/或至少一个或至少两个磷脂依赖性d4Des的至少一个或至少两个核苷酸序列。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述一个或多个表达盒包含编码至少一个或至少两个d12Des的核苷酸序列。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述种子还包含更大量的一种或多种多不饱和脂肪酸，所述一种或多种多不饱和脂肪酸选自二十碳二烯酸、二高-γ亚麻酸和花生四烯酸。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述种子具有约11.5％至约15％的EPA含量。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述种子具有约0.9％至约1.5％的DHA含量。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述种子具有约3.5％至约5％的DPA含量。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中EPA和DHA的量的总和大于所述表达盒已渗入其中的甘蓝型油菜栽培品种Kumily植物的种子中所产生的DHA和EPA的量的总和。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述植物选自甘蓝型油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、印度芥菜(Brassica juncea)、黑芥(Brassica nigra)、芜菁(Brassica rapa)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)。
50.根据权利要求49所述的芸苔属植物或其部分，其中所述植物选自甘蓝型油菜、芜菁和印度芥菜。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述植物对除草剂耐受。
52.根据权利要求51所述的芸苔属植物或其部分，其中所述除草剂选自咪唑啉酮、麦草畏、环己二酮、磺酰脲、草甘膦、草铵膦、苯氧基丙酸、L-草丁膦、三嗪和苯甲腈。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的芸苔属植物或其部分，其中所述植物还包含编码苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素的基因，并且其中所述内毒素在所述芸苔属植物或其所述部分中产生。
54.一种生产芸苔属植物或其部分的方法，所述方法包括：将第二芸苔属亲本植物与在其种子中产生DPA、DHA和/或EPA中的一者或多者的第一芸苔属亲本植物杂交以生产子代植物，其中所述第一芸苔属亲本植物和所述第二芸苔属亲本植物中的一者或两者包含赋予更高的多不饱和脂肪酸含量的甘蓝型油菜亲本基因组的至少一个基因组序列的全部或部分，
其中所述基因组序列选自：
a)染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的所述基因组序列；
b)染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的所述基因组序列；和
c)染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的所述基因组序列；并且
其中与所述第一亲本芸苔属植物和/或所述第二亲本芸苔属植物的种子相比，所述芸苔属植物的种子具有更大量的选自EPA、DPA和DHA的一种或多种多不饱和脂肪酸。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述第一芸苔属植物包含能够遗传地整合进其基因组中的一个或多个T-DNA，所述T-DNA包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒具有编码一个或多个d12DES、一个或多个d6Elo、一个或多个d6Des、一个或多个d5Des、一个或多个d5Elo、一个或多个d4Des和/或一个或多个o3Des的核苷酸序列，其中所述一个或多个基因能够遗传地整合进所述植物基因组中。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的方法，其中所述方法还包括选择包含所述基因组序列的子代。
57.根据权利要求56所述的方法，其中选择子代包括选择具有染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的所述基因组序列的全部或部分的子代，所述基因组序列包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：8,952,616、9,040,901、9,046,609、9,048,617、9,136,686、9,143,608、9,248,592、9,347,120、9,352,326、9,454,361、9,549,523、9,641,936、9,652,028、9,794,198、9,847,417、9,921,975、9,952,792、10,052,015、10,402,684、10,425,211、10,558,464、10,613,015、10,659,284、10,706,805、10,748,492、10,852,010、11,007,740、11,047,958、11,150,929、11,269,217、11,343,118、11,455,979、11,565,970、11,659,776、11,726,807和11,850,103。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的方法，其中选择子代包括选择具有染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的所述基因组序列的全部或部分的子代，所述基因组序列包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：22,823,086、22,880,595、22,902,670、22,949,738、23,011,207、23,044,228、23,099,592、23,176,771、23,201,595、23,257,618、23,302,268、23,367,822、23,380,089、23,457,696、23,520,607、23,552,773、23,598,941、23,670,623、23,682,848、23,745,365、23,792,572、23,855,829、23.910,029、23,947,522和24,021,883。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的方法，其中选择子代包括选择具有染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的所述基因组序列的全部或部分的子代，所述基因组序列包含在选自以下位置的一个位置处的一个SNP：19,336,744、19,336,819、19,337,615、19,350,156、19,353,584、19,353,648、19,353,749、19,476,836、19,783,834、19,784,007、19,784,367、19,784,633、19,784,672、19,784,688、19,784,733、19,800,525、20,191,826、20,300,548、20,375,643、20,766,637、20,769,461、20,770,769、20,823,998、20,825,959、20,826,301、20,827,570和20,827,573。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的方法，其中选择与所述第一芸苔属亲本植物和/或所述第二芸苔属亲本植物相比在它们的种子中产生更大量的DPA、DHA和/或EPA的子代，并且所述子代包含所述基因组序列的全部或部分。
61.一种由根据权利要求54至60中任一项所述的方法生产的芸苔属植物或其部分。
62.一种生产芸苔属植物或其部分的方法，所述方法包括将第一芸苔属植物与第二芸苔属植物杂交以产生子代植物，所述第一芸苔属植物在其种子中产生DPA、DHA和/或EPA中的一者或多者并且包含：
(i)能够遗传地整合进其基因组中的一个或多个T-DNA，所述T-DNA包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒具有编码一个或多个d12DES、一个或多个d6Elo、一个或多个d6Des、一个或多个d5Des、一个或多个d5Elo、一个或多个d4Des和/或一个或多个o3Des的核苷酸序列；和
(ii)赋予更高的多不饱和脂肪酸含量的甘蓝型油菜亲本基因组的至少一个基因组序列的全部或部分，其中所述基因组序列选自：
a)染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的所述基因组序列；
b)染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的所述基因组序列；和
c)染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的所述基因组序列；
所述第二芸苔属植物在其种子中产生DPA、DHA和/或EPA中的一者或多者并且包含：
(i)能够遗传地整合进其基因组中的一个或多个T-DNA，所述T-DNA包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒具有编码一个或多个d12DES、一个或多个d6Elo、一个或多个d6Des、一个或多个d5Des、一个或多个d5Elo、一个或多个d4Des和/或一个或多个o3Des的核苷酸序列
其中与所述第一芸苔属植物和/或所述第二芸苔属植物的种子相比，所述芸苔属子代植物的种子具有更大量的选自EPA、DPA和DHA的一种或多种多不饱和脂肪酸。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述第一芸苔属植物对于赋予更高的多不饱和脂肪酸含量的甘蓝型油菜亲本基因组的至少一个所述基因组序列的全部或部分是杂合的，其中所述基因组序列选自：
a)染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的所述基因组序列；
b)染色体N1上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的所述基因组序列；和
c)染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的所述基因组序列。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述第二芸苔属植物是纯合的、杂合的或不包含赋予更高的多不饱和脂肪酸含量的甘蓝型油菜亲本基因组的至少一个基因组序列的全部或部分，其中所述基因组序列选自：
a)染色体N1上的核苷酸位置8,879,780和11,922,690之间的所述基因组序列；
b)染色体Nl上的核苷酸位置22,823,086和24,045,492之间的所述基因组序列；和
c)染色体N6上的核苷酸位置19,156,645和20,846,412之间的所述基因组序列。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述方法还包括选择与所述第一芸苔属植物和/或所述第二芸苔属植物的种子相比包含更大量的EPA、DPA和/或DHA的子代。
66.根据权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述方法还包括选择与所述第一芸苔属植物和/或所述第二芸苔属植物的种子相比包含更大量的EPA、DPA和DHA的子代。
67.根据权利要求65或66所述的所选择的子代。
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