CN112094937B - 花生a06染色体上与荚果和种子大小相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

花生a06染色体上与荚果和种子大小相关的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及花生A06染色体上与荚果和种子大小相关的SNP分子标记及其应用。本发明提供的与花生荚果和种子大小相关的SNP分子标记为A06‑107901527，其含有如SEQ ID NO.1所示序列第12位的多态性为G/T的核苷酸序列。当SNP分子标记A06‑107901527中，具有所述多态性的位点的基因型为GG，对应于花生荚果和种子大小性状数值高，基因型为TT，对应于花生荚果和种子大小性状数值低。利用这个SNP分子标记进行花生荚果和种子大小性状表型的鉴定，可大大节约生产成本和提高选择效率。

Description

花生A06染色体上与荚果和种子大小相关的SNP分子标记及其 应用
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及花生A06染色体上与荚果和种子大小相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
花生(Arachis hypogea L.)是重要的油料与经济作物。提高花生产量具有重要意义。虽然经过不断的育种更新，其产量已有了显著提高，但仍有进一步提高的空间。
荚果和种子大小是重要的产量构成因子。荚果大小由荚果长、荚果宽、百果重等因素构成，种子大小由种子长、种子宽、百仁重等因素构成。一般认为，荚果和种子大小为数量性状(quantitative trait locus,QTL)，受多基因控制。花生这些产量性状相对稳定，且性状之间存在显著正相关(Luo et al.,2018)。目前，基因定位主要有两种方法，连锁分析(Linkage mapping)和关联分析(Association mapping)。连锁分析由于分离群体只涉及到两个亲本，群体中发生的重组次数有限，QTL作图的精度一般在10-30cM之间(Salvi andTuberosa，2005)，随后进行QTL精细定位的工作也相当耗时耗力。随着植物基因组信息不断丰富、生物信息学和统计学方法的发展完善，关联分析已经成为植物数量性状基因定位重要手段。关联分析利用具有广泛多样性的自然群体，其中累积了大量历史重组事件，具有远高于连锁分析的分辨率，能高效、准确地定位多个性状相关的位点/基因(Flint-Garcia等，2003)。
基于分子标记辅助选择技术的分子标记辅助育种是作物分子育种的重要方面，其能快速高效获得含有目的基因的个体，现已在育种中得到广泛的应用并在某些性状上取得成功。随着测序技术的持续进步，使得基于基因组序列信息的分子标记开发成为可能。SNP是存在于大部分生物基因组中以及同一物种的不同品种中最普遍和稳定的遗传多样性类型(Cho等，1999)。SNP标记不仅位点丰富，而且具有遗传稳定、特异性高、适合高通量检测等优点，可以有效克服传统遗传标记的研究瓶颈，已成为基因定位最理想的标记，已经越来越多的应用于遗传育种。
因此，有必要提供一种与花生荚果和种子大小相关的主效SNP分子标记，以快速高效获得高产花生。
发明内容
本发明通过多环境关联分析，旨在鉴定获得与产量性状相关位点及有效分子标记，用于花生产量性状的标记辅助选择。
具体地，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种与花生荚果和种子大小相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为A06-107901527，其含有如SEQ ID NO.1所示序列第12位的多态性为G/T的核苷酸序列。
本发明的SNP分子标记A06-107901527中，具有所述多态性的位点的基因型为GG，对应于花生荚果和种子大小性状数值高，基因型为TT，对应于花生荚果和种子大小性状数值低。
本发明的花生数量性状相关(荚果和种子大小相关)的SNP位点A06-107901527位于花生A06染色体107901527bp处(以二倍体A.duranensis(AA)和A.ipaensis(BB)为参考基因组，PeanutBase:http://peanutbase.org)，其碱基为G，对应的氨基酸为A时，花生荚果和种子大小性状为高数值，碱基为T，对应的氨基酸为S时，花生荚果和种子大小性状为低数值。
本发明与花生荚果和种子大小相关位点是通过以下方法获得的：
(1)两年两点考察250份花生资源荚果长、荚果宽、种子长、种子宽、百果重、百仁重性状，获得多环境下表型数据；
(2)采用CTAB法提取250份花生资源DNA，并对DNA样品进行检测。利用TruSeqLibrary Construction Kit构建GBS文库，并进行文库库检。文库库检合格后通过IlluminaHiSeq 2500PE150进行测序；
(3)对下机得到的Raw data进行质控得到Clean data，将Clean data通过BWA软件比对到参考基因组上(以二倍体A.duranensis(AA)和A.ipaensis(BB)为参考基因组，PeanutBase:http://peanutbase.org)，根据比对结果，采用GATK软件进行群体SNP检测。对检测到的SNPs进行过滤和推断，获得高质量SNP标记，获得基因型数据；
(4)利用获得的高质量SNP标记，运用STRUCTURE软件进行群体结构分析，利用TASSEL软件进行LD分析；
(5)把基因型数据和四个环境的性状考察数据，利用GEMMA软件，采用混合线性模型进行关联分析，在多个环境下检测到一个同时控制荚果和种子大小的主效显著关联位点A06-108577126；
(6)在该关联位点两侧1.3Mb区域内鉴定候选基因，并调查序列变异与表型变异的相关性，发现位于候选基因Aradu.K0L5G上的非同义SNP(A06－107901527bp)在多个环境下与荚果和种子大小相关。
利用上述技术措施，最终获得了上述与花生数量性状相关的位点。
第二方面，本发明提供用于扩增上述SNP分子标记的引物。
本发明的引物包括如SEQ ID NO.2-3所示的序列。
第三方面，本发明提供上述SNP分子标记或引物的以下任一应用：
(1)在鉴定花生荚果和种子大小性状表型、定位花生荚果和种子大小性状基因中的应用；
(2)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
(3)在花生荚果和种子大小性状早期预测中的应用；
(4)在筛选或创制花生荚果和种子大小性状不同的花生中的应用。
本发明包括利用本发明提供的位点、SNP标记和引物应用于花生的产量育种，用于花生产量性状基因的图位克隆或是用于分子标记辅助选择。
本发明的分子标记可在花生荚果和种子大小性状基因定位中、花生荚果和种子大小筛选中、选育花生不同荚果和种子大小相关资源和在创制花生不同荚果和种子大小相关材料中、花生荚果和种子大小性状选择和育种中应用。
第四方面，本发明提供鉴定花生荚果和种子大小表型的方法，其包括：
(1)提取待鉴定花生的DNA；
(2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO.2(上游引物)、SEQ ID NO.3(下游引物)所示引物进行PCR扩增；测序引物与SEQ ID NO.2相同；
(3)分析PCR扩增产物中上述SNP分子标记的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生荚果和种子大小性状表型。
本发明中，步骤(3)中所述判断待鉴定花生荚果和种子大小性状表型的方法如下：
若SNP分子标记A06-107901527具有所述多态性的位点的基因型为GG，则待鉴定花生的荚果和种子大小性状数值高，若基因型为TT，则待鉴定花生的荚果和种子大小性状数值低。
本发明检测SNP标记时，设计SSR引物，使扩增的片段包含该碱基变化位点，然后测序。针对该位点设计的上游引物为：GAGATAAATTTCTTTCATATTTTACG(SEQ ID NO.2)，下游引物为：TTGTCCCCTGATCCAGCATA(SEQ ID NO.3)，进行PCR扩增，扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行测序检测变异位点。根据测序结果判定待测花生材料花生荚果和种子大小性状值的高低。利用该位点以及基于该位点的分子标记对花生材料进行检测，可准确快速筛选大粒单株，加快花生育种进程。
具体判断时，若该位点为碱基G，则判定待测花生材料的荚果和种子大小性状具有较高数值，为大粒材料。若该位点为碱基T，则判定待测花生材料的荚果和种子大小性状具有较低数值，为小粒材料。
本发明的有益效果在于：
在不同环境和地点鉴定到的稳定QTL对育种有重要意义。产量相关性状属数量性状，它们和环境之间具有复杂的相互作用，在不同环境下会造成产量变化。育种家需要选择在不同环境下均能稳产，具有较高田间适应性的株系。然而，在不同田间环境下对大量株系进行评价非常困难。鉴定出的多环境下稳定QTL不仅可以减轻育种家的工作量，而且可以提高鉴定的准确性，在分子标记辅助育种中加以利用，有利于加速育种进程。在常规育种方法中，荚果和种子大小性状的鉴定要等到成熟期拷种，费时费力且选择效率低下。本发明中与花生荚果和种子大小性状相关位点位置明确，以此形成的分子标记为工具，检测方法简单，不受环境影响，可在苗期鉴定和筛选出大粒花生材料，大大节约生产成本和提高选择效率。
附图说明
图1为各性状在四个环境下调察均值的频率分布图；其中，纵坐标代表频率，横坐标中PL代表荚果长、PW代表荚果宽、SL代表种子长、SW代表种子宽、HPW代表百果重、HSW代表百仁重；
图2为2015WH环境下百仁重关联分析的曼哈顿图和QQ图；其中，左图为曼哈顿图，横坐标A01-B10分别表示花生的20条染色体，纵坐标表示标记与性状关联的P值。右图为QQ图，横坐标表示P值的期望值，纵坐标表示P值的观测值；
图3为包含A06-107901527变异位点的扩增片段测序峰图；其中，High value ofallele表示性状值高的等位位点，Low value of allele表示性状值低的等位位点；
图4为在A06-107901527位点为GG的株系和TT的株系荚果和种子大小的表型数值比较图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法和实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:aLaboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1自然群体(250份花生材料)的性状考察
本实施例中，250份花生材料2015年和2016年连续两年种植在四川南充和湖北武汉的实验基地。在成熟收获晒干后根据《花生种质资源描述规范和数据标准》(姜慧芳等，2006)考察荚果长、荚果宽、种子长、种子宽、百果重、百仁重性状(表1)。在四个环境下(四个环境分别为：2015年武汉基地(2015WH)、2015年南充基地(2015NC)、2016年武汉基地(2016WH)、2016年南充基地(2016NC))的均值频率均呈连续分布(参见图1)，表明这些性状的数量遗传特征。
表1四个环境下荚果和种子大小性状考察
Figure BDA0002705052620000061
实施例2文库构建及测序
用CTAB法提取250份材料的叶片DNA。利用琼脂糖凝胶电泳分析DNA的纯度和完整性，Nanodrop检测DNA的纯度(OD260/280比值)，Qubit对DNA浓度进行精确定量。检验合格的DNA样品,采用TruSeq Library Construction Kit，利用MseI、HaeIII和NlaIII限制性内切酶进行GBS建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，插入片段符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nM)，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina Hiseq PE150测序。
实施例3 SNP标记的开发
对下机得到的Raw data进行质控得到Clean data。将Clean data比对到参考基因组上，有效的高质量测序数据通过BWA软件比对到参考基因组(以二倍体A.duranensis(AA)和A.ipaensis(BB)为参考基因组，PeanutBase:http://peanutbase.org)。采用GATK软件进行群体SNP的检测。利用贝叶斯模型检测群体中的多态性位点，对检测到的3,070,141个SNPs通过保留双等位基因、miss≤0.83、maf>0.05条件进行过滤，再经beagle推断后，再经GP值>0.6以及miss<0.2的过滤后，获得高质量的105,814个SNPs。
实施例4群体结构和连锁不平衡(LD)分析
利用高质量的105,814个SNPs，通过STRUCTURE软件进行群体结构分析，该群体分为G1、G2群以及一个混合群(Mixed)。通过群体结构分析，在后期的关联分析中可降低假阳性。通过TASSEL软件计算R2，分析本群体LD衰减距离为1.3Mb。
实施例5关联分析
把所有样本的基因型数据和两年两点的性状考察数据(表1)，利用GEMMA软件，采用混合线性模型进行关联分析。阈值设置为-log10(0.05/105814)＝6.33，P<4.73×10-7的SNP为显著关联SNP。以2015WH环境下百仁重关联分析为例，其结果参见图2。在多个环境下检测到一个同时控制荚果和种子大小的主效显著关联位点A06-108577126(具体P值见表2)。其在2015WH和2016NC环境下对荚果长表型变异解释率依次为16.96％和24.27％；在2015WH、2016NC、2016WH环境下对荚果宽表型变异解释率依次为19.33％、15.90％、20.12％；在2015WH、2016WH环境下对种子长表型变异解释率为36.27％、23.12％；在2016NC、2016WH环境下对种子宽表型变异解释率为16.79％、20.28％；在2015WH、2016NC环境下对百果重表型变异解释率为19.40％、17.69％；在2015WH、2016NC环境下对百仁重表型变异解释率为25.96％、21.19％。参见表2。2015WH代表实施例1中2015年武汉基地，2016WH代表实施例1中2016年武汉基地，2015NC代表实施例1中2015年南充基地，2016NC代表实施例1中2016年南充基地。PVE代表表型变异解释率。
表2主效位点A06-108577126在多环境下与荚果和种子大小性状的关联性
Figure BDA0002705052620000071
根据本群体LD衰减距离,在显著关联位点A06-108577126上下游1.3Mb基因组区间用来鉴定与候选基因。在该区间参与这些产量性状代谢途径或者在荚果中具有组织特异性表达的基因鉴定为候选基因。在该区域内鉴定到的候选基因Aradu.K0L5G中具有非同义SNPA06-107901527，其碱基由G变为T，氨基酸由A变为S。根据基因型数据分析发现在不同环境下A06-107901527GG基因型比TT基因型株系的PL,PW,SL,SW,HPW,HSW表型值显著高，表明该变异与荚果和种子大小相关。
实施例6 SNP标记在花生高产育种中的应用。
供试材料：25个荚果和种子大小表型值高的株系和25个荚果和种子大小表型值低的株系(表3)。提取各材料的DNA。
基因型鉴定：以A06-107901527为靶标，检测该SNP标记。利用合成的SSR引物，扩增各材料。SNP分子标记A06-107901527能够准确区分栽培花生中大粒及小粒材料，对大粒材料进行片段扩增，测序后在A06-107901527处碱基为G，对小粒材料进行片段扩增，测序后在该处碱基为T。包含A06-107901527变异位点的扩增片段测序峰图见图3。在A06-107901527位点为GG等位基因的株系和TT等位基因的株系荚果和种子大小的表型数值比较图见图4。
表3供试材料荚果和种子大小表型值数据
Figure BDA0002705052620000081
Figure BDA0002705052620000091
PCR反应体系为10μL，包括Trans 2×EcoTaq PCR SuperMix(+dye)5μl、基因组DNA模板10～20ng，0.4μM上游引物(SEQ ID NO.2),0.4μM下游引物(SEQ ID NO.3)。
PCR反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s、53℃复性15s、68℃延伸1min，共40个循环；最后68℃延伸5min，4℃保温。
上述PCR扩增产物，采用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 花生A06染色体上与荚果和种子大小相关的SNP分子标记及其应用
<130> KHP201113208.8
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcattccat agctggagac atttttgctc tactctcagc agtatgttgt ggcttataca 60
cag 63
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagataaatt tctttcatat tttacg 26
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgtcccctg atccagcata 20

Claims (7)

1.与花生荚果和种子大小相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为A06-107901527，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示序列的第12位，其多态性形式为G/T；当所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为GG时，对应于花生荚果和种子大小性状数值高，当所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为TT时，对应于花生荚果和种子大小性状数值低。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，SNP分子标记A06-107901527位于花生A06染色体107901527bp处。
3.用于扩增权利要求1或2所述的SNP分子标记的引物。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物。
5.权利要求3或4所述的引物的以下任一应用：
（1）在鉴定花生荚果和种子大小性状表型、定位花生荚果和种子大小性状基因中的应用；
（2）在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
（3）在花生荚果和种子大小性状早期预测中的应用；
（4）在筛选或创制花生荚果和种子大小性状不同的花生中的应用。
6.鉴定花生荚果和种子大小表型的方法，其特征在于，包括：
（1）提取待鉴定花生的DNA；
（2）以DNA为模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物进行PCR扩增；
（3） 分析PCR扩增产物中权利要求1或2所述的SNP分子标记的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生荚果和种子大小性状表型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述判断待鉴定花生荚果和种子大小性状表型的方法如下：
当所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为GG时，则待鉴定花生的荚果和种子大小性状数值高，当所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为TT时，则待鉴定花生的荚果和种子大小性状数值低。
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