CN117448474B - 一种花生荚果大小相关的InDel分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种用于鉴定或辅助鉴定花生荚果大小相关的InDel分子标记，所述InDel分子标记为具有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子。同时本发明还公布了InDel分子标记在鉴定或辅助鉴定花生荚果大小表型上的应用，以及利用所述的InDel分子标记鉴定或辅助鉴定花生荚果花生种子大小表型的方法，解决了花生籽粒大小性状相关标记缺乏的技术问题，对选择育种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种花生籽粒大小性状相关的InDel分子标记及其应用。
背景技术
花生(Arachis hypogaeaL.)起源于南美洲，是世界范围内重要的经济作物和油料作物，在世界上100多个国家和地区都有种植。花生因其营养丰富，富含油脂和蛋白质，是我国及其它一些国家居民重要的植物油脂和植物蛋白来源。花生总产量前五的国家：中国(40％)、印度(17％)、尼日利亚(7％)、美国(6％)和苏丹(4％)，2019年我国花生的产量已经达到1751.96万吨。花生在我国种植广泛，除青海外，其它省区均有种植，主要分布在中部和南部沿海地区，主要集中在河南、山东、河北、四川、湖北、安徽、广东和辽宁等几个省份。
近年来，研究人员在泛素途径、G蛋白信号途径(GPA1、RGB1、GS3、DEP1)、泛素化途径(DA1、DA2、GW2)激酶(MAPK)信号途径(MKK4)、转录因子途径(GS2、GL2、GLW2、PT2、OsGRF4、ANT,AP2、TTG2、WRKY)、激素相关途径(GS5、GSE5、GW5、qSW5、OsARF4、ARF18)和其它途径(CYP78A5、CYP78A9、EOD3、CYP78A6)等方面取得一定的研究进展，这些不同途径是通过影响胚、胚乳和珠被的发育进而调控种子大小的分子机制。种子的大小是由一个复杂的网络控制的，这个网络整合了多种发育和环境信号。尽管最新研究发现了一些调控因子和几种分子途径，但我们对整个调控网络的了解仍然有限。
大部分的QTL区间在A05、A07、A09、B05和B06等染色体上的产量是一个复杂的数量性状，直接或间接影响多个农艺性状，如花生荚果大小和种子大小，直接影响花生的最终产量。数量性状位点(QTLs)定位是一种定位基因组区域和紧密连接的性状分子标记的传统方法。
近年来，科研人员以不同的野生种和野生种、人工创制野生种和栽培种、栽培种和栽培种之间杂交，利用SSR、SNP、Indel、SLAF和AhTE等标记，在RIL、NAW等不同的后代群中对荚果长、荚果宽、果壳厚度、荚果面积、籽仁大小、百果重、百仁重、出仁率、单株仁重等性状进行定位，已发现了250多个与花生荚果相关的QTLs，大部分的QTL区间在A05、A07、A09、B05和B06等染色体上。然而，由于花生基因组结构的复杂性和缺乏多态分子标记。迄今为止，对控制花生荚果大小相关基因的克隆和分子标记的开发仍鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以鉴别花生籽粒大小性状的InDel分子标记并将其应用到育种工作中，以解决花生籽粒大小性状相关标记缺乏的技术问题，对选择育种具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于鉴定或辅助鉴定花生荚果大小相关的InDel分子标记，所述InDel分子标记为具有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
所述的InDel分子标记在鉴定或辅助鉴定花生荚果大小表型上的应用。
利用所述的InDel分子标记鉴定或辅助鉴定花生荚果花生种子大小表型的方法，包括以下步骤：
1)提取待鉴定花生的DNA，并将DNA浓度稀释至50ng/μL；
2)以DNA为模板，Ah07_I15F和Ah07_I15R组成的引物对进行PCR扩增，Ah07_I15F:5’-GAGAGGTTTCTTAAGCTTCTAGACA-3’
Ah07_I15R:5’-ACCCACTACTTGGCATGTTTA-3’；
3)分析PCR扩增产物中所述的InDel分子标记的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生荚果大小性状表型。
进一步优选地，步骤2)中，PCR扩增时：10μl反应液体系中，Tap酶5μl，ddH2O 3μl，Ah07_I15F 0.5μl，Ah07_I15R 0.5μl，DNA 1μl。
进一步优选地，步骤2)中，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。
进一步优选地，步骤3)中，分析InDel分子标记的基因型的具体操作为：先将扩增产物滴加在7％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，再染色、显影即可得到高低带的表型。
进一步优选地，高低带的表型中，高带，对应于花生荚果和种子大小性状数值高；低带，对应于花生荚果和种子大小性状数值低。
进一步优选地，电泳采用的缓冲液为TBE电泳缓冲液，促凝剂为10％APS溶液350μL和四甲基乙二胺30μL的混合液；电泳设定电压为220V，电流650mA，功率80W，时间1h。
进一步优选地，染色、显影的具体操作为：将电泳过的含有扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶放入已配好的染色液中，摇动2～3min进行染色；用蒸馏水水洗后，在显影液中摇动2～3min进行显影，直至DNA条带清晰可见后，倒掉显影液，用水清洗后，将聚丙烯酰胺凝胶用保鲜膜密封并拍照即可。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明首次公开、并确认了一种新的花生籽粒大小性状相关的InDel分子标记，命名为Arahy.07:588574，该InDel分子标记位于花生7号染色体上，扩增片段大小相差12bp长度，可以在7％的聚丙烯酰胺凝胶中显示出来高低带差异。高带，对应于花生荚果和种子大小性状数值高；低带，对应于花生荚果和种子大小性状数值低。
2.本发明开发了一个与花生籽粒大小性状相关的InDel分子标记，利用这个InDel分子标记进行花生荚果和种子大小性状表型的鉴定，可大大节约生产成本，提高选择效率，为加快花生育种的应用实践打下基础。
附图说明
图1是ND_S和ND_L的表型；
图2是ND_S和ND_L的表型性状分析；
图3是ND_S和ND_L的InDel序列比对；
图4是RIL群体籽粒大小极端材料电泳；
图5是自然群体电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。下面详细描述本发明的技术方案，参考附图中描述的实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。引物合成及测序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司(下称“生工”)完成。本发明实施例中，使用到的染色液采用1.2g硝酸银溶于1L蒸馏水中，搅拌溶解得到，现用现配，避光保存。使用到的显影液采用15g氢氧化钠，15ml甲醛溶液，定容至1L蒸馏水中，充分搅拌溶解得到，现用现配。
实施例1：花生籽粒大小性状相关标记的开发
正向遗传学结合重测序和BSA分析的方法将找到一个花生籽粒大小相关的QTL，在区间内开发一个与籽粒大小关联性高的InDel分子标记，具体如下：
(1)选取两个籽粒大小差异明显的花生品种ND_L和ND_S(图1，2)，之后以小果花生ND_S为母本和大果花生ND_S进行杂交构建群体，之后经检测共得到71个真杂种，经海南加代后，得到个701个F2种子，在F2:3选取种子大小极端的个体各20个，构建极端混池，之后结合两个亲本池进行重测序，进行BSA分析，以花生Tifrunner.gnm1.KYV3数据库为参考基因组，根据测序的SNP信息计算SNP_index、ΔSNP_index和ED，最后将结合两种计算结果，将候选区间定位到7号染色体上一个1M左右的区间内，之后在区间内根据亲本重测序信息，开发具有9对具有多态性的InDel分子标记，利用F5:6和F5:7家系对将候选区间缩小到307kb的区间内，其中，我们发现一个籽粒大小关联紧密的InDel分子标记，将该标记命名为Arahy.07:588574。
(2)为清晰上述InDel分子标记在父母本材料ND_L和ND_S中的具体序列差异，将该序列在ND_L和ND_S中分别进行克隆。具体步骤如下：
1.1DNA的提取
利用SLS法分别提取ND_L和ND_S籽粒的DNA。
1.2Arahy.07:588574标记的克隆及序列分析
设计PCR引物，Ah07_I15F和Ah07_I15R分别如下：
Ah07_I15F:5’-GAGAGGTTTCTTAAGCTTCTAGACA-3’
Ah07_I15R:5’-ACCCACTACTTGGCATGTTTA-3’
以ND_L和ND_S的DNA为模板，用Ah07_I15F和Ah07_I15R组成的引物对进行PCR扩增，PCR反应液(50μl体系)：2x Phanta Max Buffer(25μl)，ddH2O(19μl)，dNTP(1μl)，Ah07_I15F(2μl)，Ah07_I15R(2μl)，DNA(2μl)，PhantaMax Super-Fidelity DNAPolymerase(1μl)。扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR反应完成后，将反应产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳20min。在紫外光下将目的条带切下来，按照琼脂糖胶回收试剂盒(惠凌，上海，中国)说明书回收，回收后连接到5min TA/Blunt-Zero Cloning Kit载体(诺唯赞，南京，中国)，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(唯地，上海，中国)，之后涂板，挑单克隆菌检，将正确的单克隆菌液送生工进行测序；
测序结果表明，以ND_L和ND_S的DNA为模板进行PCR扩增得到的DNA片段为InDel标记的核酸序列，如序列比对结果如图3所示，其长度分别为414bp和402bp，相差TAATAATAATAA共12个碱基。
实施例2：群体验证
为验证的粒长的差异是否与Arahy.07:588574InDel标记关联，将该InDel标记在RIL群体和自然群体中分别进行验证。具体步骤如下：
2.1DNA的提取
利用SLS法分别提取RIL群体和自然群体籽粒的DNA，并将DNA浓度稀释至50ng/μL。
2.2分子标记基因型检测
1)以RIL群体和自然群体的DNA为模板，用Ah07_I15F和Ah07_I15R组成的引物对进行PCR扩增，PCR反应液(10μl体系)：Tap酶(5μl)，ddH2O(3μl)，Ah07_I15F(0.5μl)，Ah07_I15R(0.5μl)，DNA(1μl)，扩增程序按照1.2。
2)制备7％的聚丙烯酰胺凝胶：将两块玻璃板水平放置在实验台上，两侧用夹子夹紧。取一个小烧杯，吸取7％的聚丙烯酰胺凝胶溶液40mL，再加入促凝剂(10％APS溶液350μL和四甲基乙二胺30μL)，快速混匀后迅速倒入两块玻璃板中间并插入梳子，15min左右凝固。
3)电泳：向下胶槽加入适量的0.5x TBE电泳缓冲液，固定玻璃板在电泳仪上，向上胶槽加入适量的电泳缓冲液，拔起梳子后，用移液枪吸取1μL扩增产物按顺序点入。在最左端留一个孔点maker做标记。连接美国伯乐Bio-Rad垂直电泳仪电极，打开电源，设定电压为220V，电流650mA，功率80W，时间1h。
4)染色、显影：关闭电源后回收电泳缓冲液，将胶与玻璃板分离，倒掉蒸馏水，将胶放入已配好的染色液中，摇动2～3min进行染色。用蒸馏水水洗后，在显影液中摇动2～3min进行显影，直到DNA条带清晰可见后，倒掉显影液，用水清洗后，将胶用保鲜膜密封并拍照。
结果表明，在RIL群体中分别挑选20个极端小粒材料和20个极端大粒材料，用Arahy.07:588574InDel标记能将籽粒大小极端的材料分开，其中小籽粒全为低带，大籽粒全为高带(图4)。进一步对96个自然群体进行检验，其中在13个小果材料中有11个为低带，在83个中大果材料中有62个为高带(如图5所示)。
综上，本发明的花生籽粒大小性状相关的InDel标记，在花生育种早期对籽粒大小的性状进行筛选，利用这个InDel分子标记进行花生荚果和种子大小性状表型的鉴定，可大大节约生产成本和提高选择效率，对育种方面有着重要的应用价值。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于鉴定或辅助鉴定花生荚果大小相关的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
2.一种如权利要求1所述的InDel分子标记在鉴定或辅助鉴定花生荚果大小表型上的应用。
3.利用权利要求1所述的InDel分子标记鉴定或辅助鉴定花生荚果花生种子大小表型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待鉴定花生的DNA，并将DNA浓度稀释至50 ng/μL；
2）以DNA为模板，Ah07_I15F和Ah07_I15R组成的引物对进行PCR扩增，
Ah07_I15F:5’-GAGAGGTTTCTTAAGCTTCTAGACA-3’
Ah07_I15R:5’-ACCCACTACTTGGCATGTTTA-3’；
3）分析PCR扩增产物中权利要求1所述的InDel分子标记的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生荚果大小性状表型；
步骤3）中，分析InDel分子标记的基因型的具体操作为：先将扩增产物滴加在7%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，再染色、显影即可得到高低带的表型；高低带的表型中，高带，对应于花生荚果和种子大小性状数值高；低带，对应于花生荚果和种子大小性状数值低。
4.如权利要求3所述的表型的方法，其特征在于，其特征在于，步骤2）中，PCR扩增时：10μl反应液体系中，Tap酶5μl，ddH2O 3μl，Ah07_I15F0.5μl，Ah07_I15R 0.5μl，DNA1μl。
5.如权利要求3所述的表型的方法，其特征在于，步骤2）中，PCR扩增反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸 30 s，30个循环；72℃延伸 10 min。
6.如权利要求3所述的表型的方法，其特征在于，电泳采用的缓冲液为TBE电泳缓冲液，促凝剂为10% APS溶液350μL和四甲基乙二胺 30μL的混合液；电泳设定电压为220 V，电流650 mA，功率80 W，时间1 h。
7.如权利要求3所述的表型的方法，其特征在于，染色、显影的具体操作为：将电泳过的含有扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶放入已配好的染色液中，摇动2 ~ 3 min进行染色；用蒸馏水水洗后，在显影液中摇动2 ~ 3 min进行显影，直至DNA条带清晰可见后，倒掉显影液，用水清洗后，将聚丙烯酰胺凝胶用保鲜膜密封并拍照即可。
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