CN114182032B

CN114182032B - 用于检测甜瓜种皮颜色snp分子标记及其应用

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Publication number: CN114182032B
Application number: CN202111184070.3A
Authority: CN
Inventors: 付秋实; 王怀松; 胡志程; 张爱爱
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-10-11
Filing date: 2021-10-11
Publication date: 2024-01-02
Anticipated expiration: 2041-10-11
Also published as: CN114182032A

Abstract

本发明公开了一种鉴定甜瓜种皮颜色的SNP分子标记及其应用，通过大量研究发现了一种所述甜瓜种皮颜色共分离的SNP位点，位于甜瓜基因组6号染色体11,967,142bp处，其碱基由G突变为A；设计SNP位点的dCAPs分子标记；设计一种甜瓜种皮颜色基因型的鉴定方法，将甜瓜dCAPs分子标记在甜瓜种皮颜色分子标记辅助筛选和育种中应用。可为鉴定甜瓜种皮颜色提供新手段。

Description

用于检测甜瓜种皮颜色SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定甜瓜种皮颜色的SNP分子标记及其应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis melon L.)是葫芦科甜瓜属(2n＝2x＝24)一年生的蔓性草本植物，在世界范围内被广泛种植。甜瓜种皮颜色丰富，是甜瓜重要的农艺性状之一，对种子吸水量、休眠和萌发有一定的影响。种皮由珠被发育而来，对胚和胚乳具有保护作用，在种子的发育过程中有至关重要的作用。研究表明，类黄酮类物质影响种皮颜色，类黄酮生物合成途径中的基因和转录因子调控种皮颜色的形成，而且其中一些基因还参与调控种子储藏物质的积累过程。

甜瓜种皮颜色丰富，但相关研究较少，张可鑫等(2018)1496-1503发现甜瓜种皮颜色(白色vs黄色)为质量性状，已将控制种皮颜色(白色vs黄色)的基因初步定位在第5连锁群。梁长志(2019)6-10的研究认为甜瓜种皮颜色(黄色vs红色)为一对基因控制的质量性状，且黄色对红色为显性。目前还未见控制甜瓜种皮颜色候选基因的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种甜瓜种皮颜色相关的SNP分子标记和应用，确定甜瓜种皮颜色的基因型。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种甜瓜种皮颜色相关的SNP位点的dCAPs分子标记在鉴定甜瓜种皮颜色中的应用，所述位点位于甜瓜基因组6号染色体11,967,142bp处，其碱基由G突变为A。

同时，本发明还提供一种甜瓜种皮颜色相关的SNP位点的dCAPs分子标记的检测引物在鉴定甜瓜种皮颜色中的应用，所述引物的上游引物核苷酸序列为TAACAACTAGCTCATTGGTCG(SEQ ID NO.5)，其下游引物核苷酸序列为TCCTTTCTAAGGGTCATTGTTTTC(SEQ ID NO.6)。

所述的应用，以待测甜瓜样本基因组为模板，用所述引物进行扩增，对扩增产物用限制性内切酶TaqI进行酶切，再通过电泳进行检测。

本发明还提供一种甜瓜种皮颜色基因型的鉴定方法，该方法包括以下步骤：

a.待测甜瓜样品的DNA提取，优选地利用改良CTAB法提取甜瓜植株总DNA；

b.PCR扩增：以所述提取的DNA为模板，用引物进行扩增，所述引物如下：

上游引物核苷酸序列为TAACAACTAGCTCATTGGTCG，其下游引物核苷酸序列为TCCTTTCTAAGGGTCATTGTTTTC。

优选地，反应体系为：甜瓜植株总DNA 1μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、2×Taq Master Mix 5μL、ddH₂O 4μL；

反应程序为：94℃4min，36个循环的94℃15s、54℃16s、72℃30s、72℃4min；

c.酶切反应，用TaqI限制性内切酶对扩增产物进行酶切，优选的，其反应体系为：PCR产物5μl，TaqI限制性内切酶0.2μl，10×buffer 1μl，ddH₂O 3.8μl；反应程序为：65℃恒温处理2小时；

d.电泳图谱分析：对所述酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，如果仅存在164bp的条带，待甜瓜为甜瓜黄色种皮基因型，若仅存在185bp的条带，待甜瓜为甜瓜褐色种皮基因型，如果存在这两种条带，待甜瓜为黄色种皮基因型。

本发明还提供甜瓜种皮颜色相关的SNP位点的dCAPs分子标记在甜瓜种皮颜色辅助筛选或育种中的应用，所述位点位于甜瓜基因组6号染色体11,967,142bp处，其碱基由G突变为A。

本发明还提供一种甜瓜种皮颜色基因型的鉴定方法在甜瓜种皮颜色辅助筛选或育种中的应用；所述的应用包括如下步骤：

(1)黄色种皮品种(例如TG1506)和褐色种皮(例如TG1526)进行杂交，获得杂交种子F₁；

(2)种植F₁杂交种子获得F₂，对F₂群体单株利用所述的鉴定方法进行基因型鉴定；

(3)利用上述(2)中鉴定的基因型结果，根据分子标记的基因型对不同单株进行分类，并利用种皮颜色表型数据进行鉴定和验证。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：根据甜瓜种皮颜色的SNP位点开发的dCAPS标记CmSC与甜瓜种皮颜色基因共分离，对200株F₂群体单株和180份甜瓜材料进行了基因型分析，发现基因型分析结果与田间调查结果完全一致。因此，本发明设计的甜瓜种皮颜色基因共分离的分子标记，可应用于进行分子标记辅助选择育种，能以更快速、准确的进行甜瓜种皮颜色的定向遗传改良。本发明在甜瓜种皮颜色育种中进行了应用，可为鉴定甜瓜种皮颜色提供新手段，提高育种的准确性和选择效率。

附图说明

图1利用种皮颜色标记CmSC的引物在表2中部分甜瓜材料基因组(前33个)的扩增结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：甜瓜种皮颜色连锁分子标记的开发

1.利用“TG1506”和“TG1526”构建F₂分离群体，利用亲本重测序和BSA混池测序，在6号染色体上得到一个与甜瓜种皮颜色性状关联的候选区域，根据甜瓜基因组注释信息，发现6号染色体11,967,142bp处存在一个与甜瓜褐色种皮颜色紧密连锁的一个非同义SNP突变，其碱基由G突变为A，与甜瓜褐色种皮连锁的片段其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，与甜瓜黄色种皮连锁的片段其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.其他地方在两个亲本之间不存在序列差异。只有这一处突变位点，所以设计了一个dCAPs标记，所以根据上述SNP位点开发一个dCAPs分子标记，上游引物命名为CmSC-F，其下游引物命名为CmSC-R，该引物对的核苷酸序列为：

CmSC-F：TAACAACTAGCTCATTGGTCG(SEQ ID NO.5)；

CmSC-R：TCCTTTCTAAGGGTCATTGTTTTC(SEQ ID NO.6)。

采用的限制性内切酶为TaqI。

实施例二：甜瓜F₂群体分子标记分析

1.利用CTAB法提取西瓜F₂群体叶片总DNA(MURRAY and THOMPSON,1980)，具体操作步骤如下：

(1)取约0.2g样品，放在有1颗钢珠的2ml离心管中，使用组织破碎仪打碎至干粉状；

(2)立即加入800μl 65℃预热的2％CTAB缓冲液(β-巯基乙醇提前半小时加入CTAB缓冲液中，摇匀)，混匀后立即于65℃水浴1h，每隔15min摇匀样品一次；

(3)加入等体积三氯甲烷/异戊醇混合液(24:1)，立即放置在摇床上摇匀后，于离心机上12000rpm离心10min；

(4)吸取450μl上清液至干净的离心管中，重复(3)的操作；

(5)吸取450μl上清液于干净的离心管中，加入等体积预冷的无水乙醇，轻柔混匀后，-20℃静置至少30min；

(6)于离心机上12000rpm离心10min后，小心倒掉上清液，保留沉淀物，加入500uL75％酒精清洗2遍；

(7)超净工作台吹干DNA，加100μl ddH₂O溶解，待DNA完全溶解后，加入1μL(10ng/L)的RNAse，37℃水浴30min，除去RNA，置于-20℃保存。

使用NanoDrop 2000测定每个单株的DNA浓度，并用ddH₂O稀释至合适浓度，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测每个单株的DNA质量。

2.PCR反应体系和程序

反应体系为：DNA反应液1μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、2×Taq PCR MasterMix 5μl、ddH₂O 4μl。

PCR反应程序为：94℃4min，36个循环的94℃15s、54℃16s、72℃30s、72℃4min。

3.酶切反应体系和程序

反应体系为：PCR产物5μl，TaqI限制性内切酶0.2μl，10×buffer 1μl，ddH₂O 3.8μl；

反应程序为：65℃恒温处理2小时。

4.聚丙烯酰胺凝胶电泳程序：

(1)用两个夹子固定玻璃板两端(长板、短板各一片)，短板在上，平放备用；

(2)根据8％聚丙烯酰胺凝胶配制体系配制胶溶液，配完胶溶液后立即灌胶(Temed少量多次加入，防止聚丙烯酰胺凝胶凝固过快)，若有气泡及时赶出，小心插好梳子，平放静置至胶凝固；

(3)胶凝固后，拔出梳子，用夹子将玻璃板垂直固定在电泳槽中，加入适量0.5×TBE电泳液；

(4)点样：每个孔点PCR产物1.5μl，每片胶点1.5μl DNA Marker(750bp)；

(5)根据PCR产物大小设置电泳程序，150-175V，2-2.5h。

银染程序：

(1)固定：将电泳结束后的胶轻轻转入固定液中(每片胶的固定液配制体系为：无水乙醇10ml、冰乙酸0.5ml、蒸馏水90ml)，摇床适当速度摇匀3min，需要固定两次，并且第二次的固定液保留备用；

(2)银染：将固定后的胶转入银染液中(每片胶的银染液配制体系：硝酸银0.2g、蒸馏水100ml)，摇床适当揺速摇匀12min；

(3)清洗：先用蒸馏水清洗(每片胶用100ml蒸馏水)30s，再用硫代硫酸钠溶液(每片胶需蒸馏水100ml、10％硫代硫酸钠溶液24μl)清洗30s；

(4)显色：将凝胶转入显色液中(每片胶的显色液配置体系：氢氧化钠固体1.5g、甲醛溶液0.3ml、蒸馏水100ml)，摇床适当揺速摇匀至条带清洗为止；

(5)固定：将胶转入(1)中保留的固定液中，于摇床摇匀3min；

(6)清洗：将胶转入蒸馏水中清洗，于摇床摇5min；

(7)把胶平放在胶片观察灯上进行观察，并拍照保存，对条带进行统计。

实施例三：F₂群体基因型分析

经实施例二进行CmSC分子标记在由“TG1506”和“TG1526”构建F₂群体中的基因型鉴定后，发现在F₂群体200单株中CmSC的基因型与甜瓜种皮颜色形状共分离。结果如表1所示，其中a代表母本带型，b代表父本带型，h代表杂合基因型(F₁)。

分子标记CmSC的基因型在黄色种皮材料中91株为a(164bp)如SEQ ID NO.4(与甜瓜黄色种皮连锁的片段经TaqI酶切后的片段)，52份为h。而在57株褐色种皮材料中全部为b(185bp)，如SEQ ID NO.3(与甜瓜褐色种皮连锁的片段经TaqI酶切后的片段)。

分子标记CmSC的基因型为a(164bp)的91个株全部是黄色种皮，基因型为b(185bp)的57个株系都是褐色种皮。其基因型鉴定的准确率为100％。

表1 CmSC在F₂群体中的鉴定和验证

实施例四：180份甜瓜材料基因型分析

步骤同实施例二、三，对180份不同的甜瓜材料(不同于F₂群体的其他甜瓜材料)(实施例三中的F₂群体是2018年春季种植，2018年秋季种植180份材料是不同于F₂群体的其他甜瓜材料用于验证标记。180份不同的甜瓜育种材料，其中53份属于Cucumis meloL.var.chinensis Pangalo，13份属于Cucumis melo L.var.conomon Thunberg，25份属于Cucumis melo L.var.cantalupensis Naudin，20份属于Cucumis melo L.var.chandalakPangalo，35份属于Cucumis melo L.var.cassaba Pangalo，20份属于Cucumis meloL.var.ameri Pangalo，14份属于Cucumis melo L.var.inodorus Pangalo)进行基因型分析，发现在180份甜瓜材料中CmSC的基因型与甜瓜种皮颜色形状共分离。结果如表2所示，其中a代表母本带型，b代表父本带型，h代表杂合基因型。

分子标记CmSC的基因型在180株黄色种皮材料中67株为a(164bp)，如SEQ IDNO.4，82份为h。而在31株褐色种皮材料中全部为b(185bp)，如SEQ ID NO.3。

分子标记CmSC的基因型为a的67个株全部是黄色种皮，而在基因型为b的31个株系都是褐色种皮。其基因型鉴定的准确率为100％。

表2 CmSC在180份不同甜瓜材料中的鉴定和验证

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 用于检测甜瓜种皮颜色SNP分子标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 185

<212> DNA

<400> 1

taacaactag ctcattggta ggaatatgac taatgattta ctctcaatca agcatacaat 60

acaatcaata aagcatggaa ctttaacttt aaaacatagc aataaagctt tatgaataaa 120

tcatgttttt tcataacgta aatgtgcaac atctgataca tgaaaacaat gacccttaga 180

aagga 185

<210> 2

<211> 185

<212> DNA

<400> 2

taacaactag ctcattggta gaaatatgac taatgattta ctctcaatca agcatacaat 60

acaatcaata aagcatggaa ctttaacttt aaaacatagc aataaagctt tatgaataaa 120

tcatgttttt tcataacgta aatgtgcaac atctgataca tgaaaacaat gacccttaga 180

aagga 185

<210> 3

<211> 185

<212> DNA

<400> 3

taacaactag ctcattggta ggaatatgac taatgattta ctctcaatca agcatacaat 60

acaatcaata aagcatggaa ctttaacttt aaaacatagc aataaagctt tatgaataaa 120

tcatgttttt tcataacgta aatgtgcaac atctgataca tgaaaacaat gacccttaga 180

aagga 185

<210> 4

<211> 164

<212> DNA

<400> 4

aaatatgact aatgatttac tctcaatcaa gcatacaata caatcaataa agcatggaac 60

tttaacttta aaacatagca ataaagcttt atgaataaat catgtttttt cataacgtaa 120

atgtgcaaca tctgatacat gaaaacaatg acccttagaa agga 164

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<400> 6

Claims

1.一种甜瓜种皮颜色基因型的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 待测甜瓜样品的DNA提取；

b. PCR扩增：以所述提取的DNA为模板，用引物进行扩增，所述引物如下：

上游引物核苷酸序列为TAACAACTAGCTCATTGGTCG，其下游引物核苷酸序列为TCCTTTCTAAGGGTCATTGTTTTC；

反应体系为：甜瓜植株总DNA 1μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、2×TaqMaster Mix 5 μL、ddH₂O 4 μL；

反应程序为：94℃ 4 min，36个循环的94℃ 15 s、54℃ 16 s、72℃ 30 s、72℃ 4 min；

c. 酶切反应，用TaqI限制性内切酶对扩增产物进行酶切；

d. 电泳图谱分析：对所述酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，如果仅存在164bp的条带，待甜瓜为甜瓜黄色种皮基因型，若仅存在185bp的条带，待甜瓜为甜瓜褐色种皮基因型，如果存在这两种条带，待甜瓜为黄色种皮基因型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在a步骤中，利用改良CTAB法提取甜瓜植株总DNA。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在c步骤中，所述酶切反应的反应体系为：PCR产物5 μl，TaqI限制性内切酶0 .2μl，10×buffer 1μl，ddH₂O 3.8 μl；反应程序为：65℃恒温处理2小时。

4.如权利要求1至3任一项所述的甜瓜种皮颜色基因型的鉴定方法在甜瓜种皮颜色辅助筛选或甜瓜育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）黄色种皮品种和褐色种皮品种进行杂交，获得杂交种子F₁；

（2）种植F₁杂交种子获得F₂代，对F₂群体单株利用权利要求1所述的鉴定方法进行基因型鉴定；

（3）利用上述（2）中鉴定的基因型结果，根据分子标记的基因型对不同单株进行分类。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，

（4）进一步利用种皮颜色表型数据进行鉴定和验证。