CN113322345A

CN113322345A - 与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记及应用

Info

Publication number: CN113322345A
Application number: CN202110755018.2A
Authority: CN
Inventors: 杨路明; 王登科; 杨森; 豆峻岭; 朱华玉; 刘东明
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113322345B

Abstract

本发明公开了一对与西瓜深绿色带状果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记及应用，属于生物技术领域。本发明的分子标记可以直接用于西瓜果皮覆纹材料的分子标记辅助育种，提高育种的选择效率，加快育种进程，另外，利用该分子标记能够在出芽期或苗期即可准确快速的鉴定出西瓜植株的果皮覆纹性状，具有检测方便、扩增产物稳定的优点。

Description

与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子育种技术领域，具体涉及与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记及应用。

背景技术

近年来，随着人民生活水平的日益提高，对于具有营养丰富、口感独特、外观多样的优质的园艺产品的需求也越来越高。而西瓜作为一种重要的园艺作物，其在世界园艺作物中具有非常重要的地位。中国作为世界上最大的西瓜生产国和消费国，其在乡村振兴和农业产业结构优化中具有重要作用。西瓜果实外观是果实外观品质的一个重要性状，在一定程度上直接影响了消费者的购买欲望。因此在育种过程中，果实外观性状作为一种重要的经济性状，一直是西瓜品质遗传改良的一个重要方向。但是关于西瓜果皮覆纹这一性状的研究非常薄弱。通过对西瓜果皮覆纹这一性状开展精细定位，开发出与西瓜果皮覆纹性状紧密连锁的分子标记，可以大大缩短相关育种进程。

相较于大田作物，园艺作物的果实外观具有丰富的多态性。目前对这些种质资源的利用已取得了很大成就。育种家相继培育出一大批独特外观品质的优质新品种，极大地满足了消费者多样化、个性化的需求。而果皮覆纹基因的挖掘和鉴定对优质园艺种质资源的利用具有极大的推动作用，也是近年来农业科学领域的重要研究内容之一。近年来，科研人员相继在苹果、梨、番茄等主要园艺作物中发现和鉴定了多个控制果皮覆纹形成的基因。

葫芦科作物作为重要的园艺作物，其果实表皮外观性状有较大的多样性。自上世纪以来，在不同物种中，多种不同覆纹类型的材料相继被发现，研究人员通过配置不同的杂交组合及一系列的等位性检测去阐释不同类型间的遗传关系。在南瓜中，Paris通过一系列的等位性检测，发现了存在多个等位基因控制南瓜的果皮覆纹性状，且其显隐性关系为：L-I(深绿色的纯色表型)>l-I^Bst(宽覆纹表型)>l-I^St(中等宽度覆纹表型)>l-I^iSt(间歇性覆纹表型)>l-I(浅绿色的纯色表型)。此外，据报道在甜瓜中也有多种基因参与了不同模式的甜瓜果皮覆纹的形成，如：st(果皮有条纹)，sp(果皮有斑点条纹)，Rn(果皮呈网纹状)等。黄瓜的果皮覆纹类型相对较少，主要有三种。即，H(成熟黄瓜果皮网纹)，U(未成熟黄瓜果皮呈斑驳)和ist(果皮出现不规则条纹)。然而，控制这些性状形成的分子基础及相关的调控网络尚不清楚。

目前已报到存在多个基因控制不同类型的西瓜果皮覆纹的形成，例如，G(果皮呈均一深绿色)，g^W(果皮呈较宽的覆纹)，g^M(果皮呈中度宽度覆纹)，g^N(果皮呈较窄的覆纹)，g(果皮呈均一浅绿色)，sp(果皮呈斑点状)，yb(深绿色果皮呈黄斑)，ins(果皮呈不连续的条纹)等。在西瓜中，大量的自然材料完成了重测序工作，在此基础上通过采用全基因组关联分析，在6号染色体的末端检测到了一个与西瓜果皮覆纹相关的信号。此外还有多项研究认为6号染色体的末端存在控制西瓜果皮覆纹形成相关的位点。然而，目前尚未有研究报道相关基因控制西瓜果皮覆纹的形成，其调控网络也尚属空白。随着分子生物学实验手段的丰富、测序技术的普及及大量重测序数据的公布，从分子层面揭开西瓜果皮覆纹形成的机理成为可能。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记。

本发明目的之二在于提供一种上述分子标记在西瓜分子育种的应用。

本发明的另一目的在于提供一种西瓜果皮覆纹品种的判定方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记，其中该分子标记可以采用Indel标记，扩增所述分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明还公开了与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记在西瓜分子育种的应用，该分子标记与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离，在分子水平上可以辅助鉴定西瓜果皮覆纹性状，即，利用该分子标记通过进一步的PCR扩增产物片段大小在出芽期或苗期即可判定西瓜果皮覆纹类型，从而加快育种进程。本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来判定西瓜果皮覆纹品种。具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对，所述检测还可以通过测序方法进行。

本发明还公开了一种西瓜果皮覆纹品种的判定方法，所述判定方法包括如下步骤：

(4)提取待测西瓜基因组DNA；

(5)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板，利用权利要求1所述分子标记的引物对进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序；

(6)根据步骤(2)的电泳条带和/或测序结果进行判定，具体标准为：

如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ.ID.NO.3所示的长度为93bp的特征条带，则该待测品种为西瓜果皮网状覆纹性状的品种；如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ.ID.NO.4所示的长度为90bp的特征条带，则待测品种为纯合西瓜果皮深绿色带状覆纹性状品种；如果PCR扩增产物中既有一条如SEQ.ID.NO.3所示的长度为93bp的特征条带，又有一条如SEQ.ID.NO.4所示的长度为90bp的特征条带，则该待测品种为杂合西瓜果皮深绿色带状覆纹性状品种。

另外，包含上述引物对的试剂盒，可以用来鉴定西瓜材料果皮覆纹性状，具体应用时，可以选择含有上述分子标记引物对的试剂做成试剂盒。

再者，用于检测Indel标记是否存在的试剂在西瓜果皮覆纹基因ClGS定位中的应用，利用本发明的分子标记，可以对西瓜果皮覆纹基因ClGS进行定位，上述这些应用均可以按照常规的方法进行。

需要说明的是，本申请中，西瓜果皮深绿色带状覆纹基因ClGS与西瓜果皮网状覆纹基因Clgs为等位基因，其中西瓜果皮深绿色带状覆纹基因ClGS为显性控制(即含有该基因的西瓜果皮覆纹呈深绿色带状，也即对应基因对为ClGS/ClGS或ClGS/Clgs)，而西瓜果皮网状覆纹基因Clgs为隐性控制(即，只有纯合基因对Clgs/Clgs时，该西瓜品种的果皮才表现为网状覆纹表型)。

本发明还保护含有上述分子标记的载体。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还保护含有所述重组载体的重组细胞。

本发明的优点：

本发明的分子标记可为最终实现对ClGS基因的克隆，进而为西瓜果皮覆纹形成的分子机制研究奠定基础。另一方面，由于该标记与西瓜果皮深绿色带状覆纹基因ClGS共分离，因此可直接用于西瓜果皮覆纹材料的分子标记辅助育种，而由于分子标记在辅助育种体系中具有简便、快速、高通量的优势，因而本发明所提供的分子标记在西瓜果皮覆纹新品种培育中具有较好的应用价值。

另外，利用该分子标记能够在出芽期或苗期即可准确快速的鉴定出西瓜植株果皮覆纹性状，具有检测方便、扩增产物稳定的优点。

附图说明

图1为西瓜深绿色带状覆纹材料WT2和网状覆纹材料WM204；

图2为西瓜果品深绿色覆纹带状基因ClGS精细定位图；

图3A为Indel位点在基因组中的位置；图3B为部分自然材料Indel位点序列差异；图3C为Indel1在自然群体中PCR产物的电泳图，其中M代表marker；其余条带为从本实验室保存的种质材料中随机选取的25份自然群体材料(由于材料较多，但结果一致，因此对于条带对应种质材料不再详细说明)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1与西瓜植株深绿色带状覆纹基因紧密连锁的分子标记的获得

生物材料：

西瓜材料WM204，其果皮呈浅绿色，上覆有网状覆纹；

西瓜材料WT2是由发明人选育的高代自交系，果实为浅绿色果皮，果面上覆有深绿色带状覆纹，该材料可以通过商业的途径获取或者由河南农业大学瓜类作物遗传育种课题组提供(需要解释的是，采用该材料作为研究基础，仅是实验材料获得的便捷性原因，不应理解为本申请相关技术方案的实现必须依赖于该实验材料)；

上述西瓜材料WT2，与公开号为CN110938706A的中国发明专利“与西瓜植株无卷须基因Clnt紧密连锁的分子标记及应用”中采用的正常普通有卷须西瓜材料WT2是一致的。

以上生物材料在申请人单位的实验室均有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验或者公众也可以通过购买的方式获取。

实验过程中，两个亲本及构建的群体均种植于河南农业大学毛庄科教园区日光温室内，种植过程为：催芽后进行穴盘育苗，采用正常的西瓜栽培管理方式，在授粉后第10天开始对单株果实表皮覆纹类型进行统计。

实验试剂和设备：

实验过程中，PCR扩增用PCR Taq-Mix购于南京诺唯赞基因科技有限公司；其它电泳与银染相关试剂如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、AgNO₃、NaOH和甲醛等试剂购自北京索莱宝科技有限公司；

实验过程中的PCR扩增用引物(人工合成)及基因测序，由擎科基因组研究中心有限公司提供完成。

PCR仪为珠海黑马医学仪器有限公司Hema9600型基因扩增仪；

电泳仪为JY300HC通用型电泳仪，由北京君意东方电泳设备有限公司生产；

电泳槽为HT-SCZ04A高通量垂直电泳槽，由北京鸿涛基业科技发展有限责任公司生产。

实施例1 ClGS基因的定位

(一)遗传分离群体的构建

以西瓜深绿色带状覆纹材料WT2作为母本，以西瓜网状覆纹材料WM204作为父本(需要解释的是，实验期间，从材料易得性及操作方便考虑，发明人以WM204作为父本)，利用这两个亲本配置了杂交组合，结果表明，获得的F₁代植株果实全部表现为深绿色带状条纹类型。(亲本材料表型如图1所示。)

从F₁代植株中选择10个单株，自交获得F₂代种子，用于遗传分析与基因定位。

对这些F₂代个体的果皮覆纹表型进行鉴定，并用卡方测验进行验证。结果表明：对2020年春季种植的137株F₂群体的株高表型调查分析显示：深绿色带状覆纹的植株有99株，网状覆纹的植株有38株，经过卡方检验符合3∶1的分离比。

对2020年秋季种植的1069株F₂群体表型调查显示，深绿色带状覆纹植株有797株，短蔓植株有272株，经过卡方分析，同样符合3：1的分离比。

综合上述结果分析可知，西瓜果皮深绿色带状覆纹性状是由1个显性单基因控制的，将该基因命名为ClGS，深绿色带状果皮覆纹(ClGS)对网状覆纹(Clgs)为完全显性。

(二)采用BSA法对ClGS基因进行初步定位

(1)首先，制备基因池，具体为：

在上述步骤(一)的F₂群体中随机选取20个深绿色带状覆纹单株与20个网状覆纹单株，采集未展开的幼嫩叶片，采用CTAB法提取其基因组DNA，并分别混合制成深绿色带状覆纹基因池和网状覆纹基因池(深绿色带状覆纹与深绿色带状覆纹混合，网状覆纹与网状覆纹混合)。

(2)多态性筛选分析，具体为：

利用发明人前期从西瓜全基因组开发的1256对SSR引物(具体引物序列参考《Genome wide characterization of simple sequence repeats in watermelon genomeand their application in comparative mapping and genetic diversity analysis》，Zhu et al.，BMC Genomics，2016，17：557-573.)，筛选在亲本间具有多态性的标记。其中共有242个标记在亲本间表现出多态性。接着通过在亲本间有多态性的242个标记对步骤(1)中所制备的两个基因池进行第二次多态性筛选，获得了12个在两个基因池间具有多态性的标记。根据SSR标记的信息，12个在双亲及混池间都具有多态性的标记均位于第6号染色体的末端。

进一步，将筛选出的12对多态性SSR标记对137株F₂群体进行基因型分析，将所获得的与网状覆纹亲本相同带型的记作2，获得与深绿色带状覆纹亲本相同带型的记作1，获得杂合带型的记作3。最后使用joinmap 4.0对分型结果进行连锁分析，发现ClGS与这些多态性标记紧密连锁。为了获取更加精确的定位结果，我们通过染色体步移的方式鉴定、开发了新的35个SSR标记，并且使用了更大的F₂群体以实现对ClGS的精细定位。

多态性筛选分析过程中，PCR扩增时，10μL扩增体系设计如下：

基因池样品(基因组DNA，30ng/μL)，1μL(约30ng)；

F、R引物，各0.5μL(引物浓度均为5μmol/L)

PCR Taq-Mix，5.0μL；

dd H₂O，3.0μL；

PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃、5min。

需要解释的是，上述PCR扩增体系中的F、R引物(1256对SSR引物)分别代表一对引物中的前引物和后引物，由于这些引物与本申请欲保护主题并不直接关联，文本简明起见，不再详细说明。

对PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳检测时，聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为1×TBE，200V恒压电泳1～1.5h。电泳结束后进行银染，以便观察和检测，银染方法为：

A、用超纯水洗1～3min；

B、利用脱色摇床将冲洗后的胶片放入染色液中摇动2min，染色液为0.2％硝酸银水溶液；

C、将染色后的胶板放入超纯水中漂30s，放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动直至条带清晰呈现，显影液是在1L蒸馏水中加入15g NaOH和15mL甲醛混匀得到的；

D、最后放入ddH₂O反复漂洗几次；

E、室温下干燥，然后拍照，用保鲜膜包裹、保存。

(3)基因精细定位，具体为：

结合(2)中的结果，通过开发更多的SSR标记、提高F₂群体单株的数量，我们将西瓜深绿色带状覆纹基因ClGS定位在6号染色体ClSSR18078与ClSSR18104之间。此外，利用Illumina Hi-seq2000高通量测序平台对两亲本材料进行重测序，控制测序深度>30倍；结合亲本重测序的结果，以西瓜全基因组序列在SSR标记ClSSR18078和ClSSR18104之间的区段作为参考序列，对ClSSR18078和ClSSR18104之间的202kb的序列进行比对，最终针对两亲本序列之间的SNPs和Indels差异，开发设计了9对dCAPS标记和6对Indel标记，最终将候选基因锁定在dCAPS3和dCAPS8之间107kb的区域内(见图2)。

实施例2 Indel1标记的开发

在实施例1的基础上，发明人进一步对西瓜深绿色带状基因ClGS候选区段进行了生物信息学分析，并开发了与之共分离的Indel1标记。具体过程如下。

(1)亲本重测序序列分析

在实例1精细定位基础上，发明人进一步对西瓜深绿色带状覆纹基因ClGS候选区段进行了生物信息学分析。我们以dCAPS3和dCAPS8之间的基因组序列作为参考序列，根据参考基因组的注释，在候选区间中共有11个基因。接着，我们将原始读长映射在参考序列之上，通过hisat2及samtools等软件进行分析，我们共发现了64个SNP和3个Indel位点存在于CDS中。

(2)电子BSA

在步骤(1)的基础上，为了进一步锁定候选基因，我们采用了电子BSA的分析策略。2019年公布了414份自然材料的重测序数据。接着我们选择了41份网状覆纹材料和33份深绿色带状覆纹材料，其重测序数据用于进行in silico bulked segregant annlysis。所有74份材料的原始序列由NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载，其登录号为SRP188834。同样以dCAPS3和dCAPS8之间的基因组序列作为参考序列，将74份材料的原始读长比对至参考序列之上。结合亲本材料在参考序列之间的序列差异，我们发现1个3bp的插入仅存在于网状覆纹材料中，换言之这个3bp的插入不存在于深绿色带状覆纹材料之中。这也暗示了可能是这个3bp的插入导致了西瓜果实覆纹形态的改变。故因此开发了Indel1。(见图3)

(3)以Indel1区分深绿色带状覆纹性状和网纹覆纹性状的原理

前期的结果表明，一个3bp的插入在亲本间两个不同覆纹类型的自然群体之间具有明显的差异，故基于此开发了分子标记Indel1，其扩增序列在两亲本内存在一个3bp的差异，网状覆纹亲本WM204序列有一个AGG碱基的插入；故该标记可用于识别深绿色带状覆纹性状和网状覆纹性状。换言之，利用所述Indel1分子标记进行PCR扩增区别时，引物序列设计为：

Indel1-F：5’-TATGCTTATACTCTCACTGGAATT-3’(SEQ.ID.NO.1)，

Indel1-R：5’-TTAACATTGCAGCCAAAAATAG-3’(SEQ.ID.NO.2)。

具体验证时：

利用分子标记Indel1检测西瓜深绿色带状覆纹基因ClGS时，可通过PCR扩增获得90bp的特征条带，所述90bp的特征条带的具体碱基序列如下所示：

AAGAGAAAGGCAGATGTTTTGATAGAAGGACAGGTGAAAGGGCTTAGGATAAGTTATTCTGCATTTTTTGATGACAATATGTGGGGTGGG(SEQ.ID.NO.4)：

利用分子标记Indel1检测西瓜网状覆纹基因Clgs时，可通过PCR扩增获得93bp的特征条带，所述93bp的特征条带的具体碱基序列如下所示：

AAGAGAAAGGCAGATGTTTTGATAGAAGGAGGACAGGTGAAAGGGCTTAGGATAAGTTATTCTGCATTTTTTGATGACAATATGTGGGGTGGG(SEQ.ID.NO.3)。

序列比对表明，在25bp处有一个AGG的插入，换言之，通过PCR，深绿色带状覆纹亲本(ClGS/ClGS)中扩增后的产物为90bp的片段；而网状覆纹亲本(Clgs/Clgs)因存在一个AGG的插入，故扩增后的产物长度为93bp。

综上，根据PCR产物的条带大小，可有效区分ClGS/ClGS、ClGS/Clgs、Clgs/Clgs三种基因型。

实施例3 Indel1分子标记功能验证

在上述实施例基础上，发明人以所收集的来自世界各地的西瓜种质材料为基础，随机选择25份材料为例(而所述西瓜种质材料均为发明人工作过程中搜集所得，相关种质材料在国内及国外部分专业种质库中亦有保藏，加上下述工作仅为实验验证，相关种质材料与本申请保护主题并不具有直接关联性，因而不再提供这些种质材料的信息)，对Indel1分子标记功能进行了进一步验证，具体过程简要介绍如下。

(1)提取西瓜基因组DNA

以育苗后未展开的幼嫩叶片(分别采集亲本深绿色带状覆纹亲本WT2、网状覆纹亲本WM204和25份自然群体材料)为样品，CTAB法提取其基因组DNA；

(2)PCR扩增

利用Indel1分子标记，即如下引物对：

Indel1-F：5’-TATGCTTATACTCTCACTGGAATT-3’(SEQ.ID.NO.1)，

Indel1-R：5’-TTAACATTGCAGCCAAAAATAG-3’(SEQ.ID.NO.2)。

以步骤(1)中的基因组DNA为模板进行PCR扩增，

PCR扩增时，10μL扩增体系设计如下：

基因组DNA(30ng/μL)，1μL(约30ng)；

Indel1-F，0.5μL(引物浓度均为10μmol/L)；

Indel1-R，0.5μL(引物浓度均为10μmol/L)；

PCR Taq-Mix，5.0μL；

ddH₂O，3.0μL；

对扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

电泳结果如图3C所示，其中M代表mareker。通过电泳结果可以判断，如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ.ID.NO.3所示的长度为93bp的特征条带，则该待测品种为西瓜果皮网状覆纹性状的品种；如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ.ID.NO.4所示的长度为90bp的特征条带，则待测品种为纯合西瓜果皮深绿色带状性状品种；如果PCR扩增产物中既有一条如SEQ.ID.NO.3所示的长度为93bp的特征条带，又有一条如SEQ.ID.NO.4所示的长度为90bp的特征条带，则该待测品种为杂合西瓜果皮深绿色带状性状品种。通过对扩增的特征条带进行分析，就可以判断出西瓜果皮的覆纹性状。

进一步地，发明人结合表型数据，发现25份自然材料的表型与基因型是一致的。基于此结果，表明Indel1分子标记能够有效地区分深绿色带状覆纹材料以及网状覆纹材料。

综上所述，结合电子BSA分析及在自然群体中的验证，本发明所述分子标记Indel1能够在西瓜生长的早期准确的进行分子标记辅助选择，大大地提高了选择和育种的进程。为西瓜优质覆纹新品种的培育提供了理论支持和技术支持。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记及应用

<130> 2021

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

tatgcttata ctctcactgg aatt 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 2

ttaacattgc agccaaaaat ag 22

<210> 3

<211> 93

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 3

aagagaaagg cagatgtttt gatagaagga ggacaggtga aagggcttag gataagttat 60

tctgcatttt ttgatgacaa tatgtggggt ggg 93

<210> 4

<211> 90

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 4

aagagaaagg cagatgtttt gatagaagga caggtgaaag ggcttaggat aagttattct 60

gcattttttg atgacaatat gtggggtggg 90

Claims

1.与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记，其特征在于，扩增所述分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Indel标记。

3.权利要求1所述与西瓜果皮覆纹基因ClGS共分离的分子标记在西瓜分子育种中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述分子标记用于鉴定或辅助鉴定西瓜果皮覆纹性状。

5.一种西瓜果皮覆纹品种的判定方法，其特征在于，所述判定方法包括如下步骤：

(1)提取待测西瓜基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板，利用权利要求1所述分子标记的引物对进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序；

(3)根据步骤(2)的电泳条带和/或测序结果进行判定，具体标准为：

如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ.ID.NO.3所示的长度为93bp的特征条带，则该待测品种为西瓜果皮网状覆纹性状的品种；如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ.ID.NO.4所示的长度为90bp的特征条带，则待测品种为纯合西瓜果皮深绿色带状性状品种；如果PCR扩增产物中既有一条如SEQ.ID.NO.3所示的长度为93bp的特征条带，又有一条如SEQ.ID.NO.4所示的长度为90bp的特征条带，则该待测品种为杂合西瓜果皮深绿色带状性状品种。

6.一种用于鉴定西瓜覆纹性状的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的引物对。

7.用于检测Indel标记是否存在的试剂在西瓜果皮覆纹基因ClGS定位中的应用，其特征在于，扩增所述标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.2所示。