CN105283069A

CN105283069A - 用于提高谷物产量的育种方法及相关材料与方法

Info

Publication number: CN105283069A
Application number: CN201480018617.4A
Authority: CN
Inventors: 石丸努; 伊内兹·霍滕斯·萨尔梅-勒丁; 藤田大辅; 库尔尼亚万·鲁迪·特里亚特米科; 小出阳平; 佐佐木和浩; 尼古劳斯·K·察基尔帕洛格卢; 福田善道; 小林伸哉
Original assignee: Japan International Research Center for Agricultural Sciences JIRCAS; International Rice Research Institute
Current assignee: Japan International Research Center for Agricultural Sciences JIRCAS; International Rice Research Institute
Priority date: 2013-02-01
Filing date: 2014-02-03
Publication date: 2016-01-27
Also published as: WO2014118636A2; WO2014118636A3; US20150376638A1; PH12015501686A1; BR112015018370A2; JP2016506731A

Abstract

本文中描述了用于提高谷物产量的育种方法。所公开的是一种新型基因SPIKE，其在本文中显示出提高现代籼稻品种的谷物产量并且可以用于辅助开发改善的谷物。本文中还描述了用于提高现代籼稻品种的谷物产量的材料和方法。

Description

用于提高谷物产量的育种方法及相关材料与方法

发明人：石丸努(TsutomoIshimaru)，伊内兹·霍滕斯·萨尔梅-勒丁(InezSalmet-Loedin)，藤田大辅(DaisukeFujita)，库尔尼亚万·鲁迪·特里亚特米科(KumiawanTrijatmiko)，小出阳平(YoheiKoide)，佐佐木和浩(KazuhiroSasaki)，尼古劳斯·K·察基尔帕洛格卢(NikolaosTsakipaloglou)，福田善道(YoshimichiFukuta)，小林伸哉(NobuyaKobayashi)

相关申请引用

本申请要求2013年2月1日提交的美国临时申请号61/759,408的优先权，其全部公开内容在此通过引用明确并入本文以用于所有目的。

序列表

本申请含有已经通过EFS-网提交的序列表并且其在此通过引用以其整体并入。在2014年2月3日制作的ASCII副本命名为53-55557-IRRI-13-002_SL且大小为103,543字节。

背景技术

预计世界人口在2050年将超过90亿。其中大部分增长将发生在亚洲和非洲的发展中国家。到2035年，增加26％的水稻产量对于养活不断增加的人口将是至关重要的。尽管在1960年代的绿色革命导致了增加的粮食生产，但是从那以后在增产水稻潜力上并没有取得什么大的进展。

水稻(OryzasativaL.)为超过30亿人的主食，主要在亚洲。籼稻(Indica)品种种植于中国南方、东南亚和南亚，占世界水稻主产区的约70％，而粳稻(japonica)品种主要种植在东亚。由于城市化和工业化，在东南亚和南亚迫切需要增加籼稻品种的产量。此外，对于局部地区所采用的新品种，谷物品质好(影响市场价值)和产量高是至关重要的。

水稻谷物产量(谷粒产量、粮食产量，grainyield)由每穗小穗数、单株穗数、粒重和小穗育性确定。尽管已经确定了产量构成因素的许多数量性状基因座(QTL)，但是迄今很少被分离。到目前为止，已经从天然变异中分离出了至少九个水稻产量相关性状的基因或基因座：对于谷粒数量的Gn1a和APO1；对于谷粒大小的GS3、GW2和qSW5；对于穗(panicle)结构的DEP1和WFP；对于壮秆(strongculm)的SCM2；和对于晚抽穗(heading)和谷粒数的Ghd7。在田间试验中，APO1、SCM2和DEP1增加了粳稻遗传背景中的谷物产量。但是，还未报道为提高籼稻品种的谷物产量的新克隆基因。

为了产生更高产量的品种以有助于满足日益增长的水稻生产需求，识别能够提高籼稻品种谷物产量的基因是必要的。

发明内容

本发明提供了用于生产具有提高的谷物产量的子代水稻植物的方法，包含：提供包含基因SPIKE的第一水稻植物；使该第一水稻植物与第二水稻植物杂交，以生产子代水稻植物；分析所述第二水稻植物的基因SPIKE；识别并选择包含基因SPIKE并且相对于所述第二水稻植物具有提高的谷物产量的子代水稻植物。

还提供这样的方法，其中所述基因SPIKE包含选自于由SEQIDNO:1；SEQIDNO:2；SEQIDNO:94；SEQIDNO:95；SEQIDNO:96；SEQIDNO:97；SEQIDNO:98；SEQIDNO:99；SEQIDNO:100；SEQIDNO:101；和SEQIDNO:102构成的组的多核苷酸序列。

还提供这样的方法，其中所述基因SPIKE包含一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一于选自于由SEQIDNO:1；SEQIDNO:2；SEQIDNO:94；SEQIDNO:95；SEQIDNO:96；SEQIDNO:97；SEQIDNO:98；SEQIDNO:99；SEQIDNO:100；SEQIDNO:101；和SEQIDNO:102构成的组的序列。

还提供这样的方法，其中所述基因SPIKE包含一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一于SEQIDNO:2。

还提供这样的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测如下来识别的：第一上游分子标记，其选自于由RM5503；RM3423；和Ind4构成的组；以及第二下游分子标记，其选自于由RM6909；AGT3；RM17487；RM17486；和Ind12构成的组。

还提供这样的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测选自于由RM3423和Ind4构成的组的第一上游分子标记以及选自于由AGT3、RM17487、RM17486和Ind12构成的组的第二下游分子标记来识别的，其中所述第一上游和第二下游分子标记是使用表1中所列的相应正向和反向引物来检测的。

还提供这样的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测约105个碱基对的第一分子标记Ind2(正向引物：ACAAGAAGCCGGGAAACCTA(SEQIDNO:27)；反向引物：CTCCTCCGGTCCTCCTTAAC(SEQIDNO:28))以及约252个碱基对的第二分子标记RM17487(正向引物：CGGAGCATGTGGAGAGGAACTCG(SEQIDNO:55)；反向引物：GGAGAGGGCAAGGGCTTCTTCG(SEQIDNO:56))来识别的。

本发明还提供了生产具有提高的谷物产量(grainyield)的近交水稻植物(inbredriceplant)的方法，其包含：根据本文提供的方法生产具有提高的谷物产量的水稻植物；将产生的所述水稻植物与其自身或另一种水稻植物杂交(cross)，以产生子代水稻种子；种植所述子代水稻种子以产生具有提高的谷物产量的额外水稻植物；和重复所述杂交和种植步骤0～7次以产生具有提高的谷物产量的近交水稻植物。

还提供这样的方法，其中分析所述第二水稻植物的基因SPIKE的步骤进一步包含步骤：识别并选择表现出提高的谷物产量的水稻植物。

还提供这样的方法，其中所述方法进一步包含步骤：选择纯合子近交水稻植物。

本发明还提供了用于生产具有提高的谷物产量的水稻植物的方法，所述方法包含：提供包含基因SPIKE的第一水稻植物；将编码基因SPIKE的核酸从所述第一水稻植物转移至第二水稻植物中；分析所述第二水稻植物的基因SPIKE；识别并且选择包含基因SPIKE并且当与所述转移之前的第二水稻植物相比时表现出提高的谷物产量的第二水稻植物。

还提供这样的方法，其中所述核酸从第一水稻植物向第二水稻植物的转移是通过使第一水稻植物与第二水稻植物杂交以生产包含基因SPIKE的后代植物来实施的，并且其中对一个或多个后代植物进行步骤：分析第二水稻植物的基因SPIKE，以及识别并选择包含基因SPIKE并且当与所述转移之前的第二水稻植物相比时表现出提高的谷物产量的第二水稻植物。

还提供这样的方法，其中所述核酸从第一水稻植物向第二水稻植物的转移是通过转基因方法、通过杂交、通过回交、通过原生质体融合(protoplastfusion)、通过双单倍体技术(doubledhaploidtechnique)或通过胚拯救(embryorescue)来实施的。

还提供这样的方法，其中回交引起基因SPIKE的基因渗入(渐渗，introgression)，以及第二水稻植物基因组的至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、或至少98％的恢复(recovery)。

还提供这样的方法，其中第二水稻植物基因组的恢复为92％～97％。

还提供这样的方法，其中识别并选择包含基因SPIKE并且当与转移之前的第二水稻植物相比时表现出提高的谷物产量的第二水稻植物的步骤进一步包含：使第二水稻植物经受生物测定以测量谷物产量。

本发明还提供了通过本文的方法产生的具有提高的谷物产量的水稻植物或其部分，其中所述水稻植物或其部分包含基因SPIKE，并且其中所述基因SPIKE不处于其天然遗传背景中。

还提供这样的方法，其中所述第一水稻植物选自于来源于新株型(NPT,NewPlantType)品种YP9的水稻植物的等基因系(isogenicline)。

还提供这样的方法，其中所述第一水稻植物选自于水稻(Oryzasativa)亚种热带粳稻(tropicaljaponica)。

还提供这样的方法，其中所述第一水稻植物为Daringan。

还提供这样的方法，其中所述第二水稻植物选自于水稻(Oryzasativa)亚种籼稻(indica)。

还提供这样的方法，其中所述第二水稻植物选自于由PSBRc18、Ciherang、TDK1、BR11、和Swarna组成的组。

本发明还提供了转基因植物细胞，其包含：至少一种植物启动子；和至少一种编码至少70％同一于蛋白质SPIKE的多肽序列(SEQIDNO:3)的多肽序列的多核苷酸；其中所述启动子和多核苷酸被可操作地连接并并入到所述植物细胞的染色体DNA中。

还提供这样的方法，其中所述细胞的类型选自于由水稻、小麦、高粱和玉米所构成的组。

还提供这样的方法，其中所述植物细胞对于基因SPIKE是纯合的。

本发明还提供了包含本文植物的多个细胞的转基因植物。

本发明还提供了转基因植物，其包含：至少一种植物启动子；和至少一种至少70％同一于SPIKE的多核苷酸序列的多核苷酸序列；其中所述启动子和多核苷酸可操作地连接并并入到所述植物的染色体DNA中。

本发明还提供了植物，其中所述植物选自于由水稻、小麦、高粱和玉米构成的组。

还提供这样的植物，其中所述植物为水稻植物。

还提供这样的植物，其中所述多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一于SPIKE的多核苷酸序列。

还提供这样的植物，其中所述植物对于基因SPIKE是纯合的。

本发明还提供了本文的植物的种子。

本发明还提供了本文的植物的植物部分。

本发明还提供了本文的植物，其中所述植物表现出选自于由如下构成的组的表型：相对于相应非转基因植物的增加的谷物产量/m²；相对于相应非转基因植物的增加的总小穗数/穗；和相对于相应非转基因植物的增加的旗叶(flagleaf)宽度。

本发明还提供了用于选择转基因植物的方法，包含：筛选群体中提高的谷物产量，其中所述群体中的植物包含至少一种转基因植物细胞，该细胞具有并入到其染色体DNA中的重组DNA，其中所述重组DNA包含启动子，该启动子在在植物细胞中是功能性的并且功能性地连接至至少70％同一于SPIKE的多核苷酸序列的多核苷酸序列的开放阅读框，其中所述群体中的包含至少一种转基因植物细胞的个体植物与不包含至少一种转基因植物细胞的对照植物的谷物产量相比表现出相同或更高的谷物产量；以及从所述群体中选择一种或多种植物，所述植物表现出比不包含至少一种转基因植物细胞的对照植物的谷物产量更高的谷物产量。

还提供这样的方法，其进一步包含步骤：从所述一种或多种植物收集种子，所述植物是在从所述群体中选择表现出比不包含至少一种转基因植物细胞的对照植物的谷物产量更高的谷物产量的一种或多种植物的步骤中选择的。

还提供这样的方法，其进一步包含：验证所述重组DNA被稳定地整合到所选择的植物中；和分析所选择的植物的组织以确定至少70％同一于SPIKE的多核苷酸序列的多核苷酸序列的表达。

本发明还提供了提高谷物草(禾谷植物，cerealgrass)的谷物产量的方法，包含：使第一种类(品种，variety)谷物草的植物与第二种类(品种，variety)的谷物草杂交，其中所述第一种类包含包括相应于基因SPIKE的多核苷酸序列的染色体DNA，其中所述第二种类不包含包括相应于基因SPIKE的多核苷序列的染色体DNA；选择一个或多个子代植物，该植物具有包括相应于基因SPIKE的多核苷酸序列的染色体DNA；回交所选择的子代植物以生产回交子代植物；选择一个或多个回交子代植物，该植物具有包括相应于基因SPIKE的多核苷酸序列的杂色体DNA；重复步骤‘回交所选择的子代植物以生产回交子代植物’和步骤‘选择具有包括相应于基因SPIKE的多核苷酸序列的染色体DNA的一个或多个回交子代植物’一次或多次，以生产第三或更高代回交子代植物，该植物具有包括相应于基因SPIKE的多核苷酸序列的染色体DNA、以及在与所述第一种类谷物草杂交之前的所述第二种类谷物草的全部生理和形态特性。

还提供这样的方法，其中所述谷物草选自于由水稻、小麦、高粱和玉米构成的组。

还提供这样的方法，其中所述谷物草为水稻。

还提供这样的方法，其中所述第一种类的谷物草选自于源于新株型(NPT)品种YP9的水稻植物的等基因系。

还提供这样的方法，其中所述第一种类的谷物草选自于水稻亚种热带粳稻。

还提供这样的方法，其中所述第一种类的谷物草为Daringan。

还提供这样的方法，其中所述第二种类的谷物草选自于水稻亚种籼稻。

还提供这样的方法，其中所述第二种类的谷物草选自于由PSBRc18、Ciherang、TDK1、BR11和Swarna构成的组。

本发明还提供了栽培谷物草植物的方法，包含栽培本文的种子。

本发明还提供了栽培谷物草植物的方法，包含栽培本文的植物部分。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一个彩色制图。在请求并支付必要的费用后，由官方提供具有彩色绘图的本专利或专利申请公开的副本。

图1A～图1D：SPIKE的近等基因系(NIL,near-isogenicline)的产量相关性状的表征。图1A：显示IR64和NIL-SPIKE的植物形态的照片。比例尺(scalebar)：20cm。图1B：显示IR64和NIL-SPIKE的穗结构的照片。比例尺：10cm。图1C：显示IR64(左叶)和NIL-SPIKE(右叶)的旗叶的照片。比例尺：5cm。图1D：IR64和NIL-SPIKE的穗颈(panicleneck)的横截面的照片。比例尺：500μm。

图1E～图1J：SPIKE的近等基因系(NIL)的产量相关性状的表征。柱状图(bargraph)显示了IR64和NIL-SPIKE之间的比较：小穗数/穗(n＝8)(图1E)、旗叶宽度(n＝9)(图1F)、成熟时的根干重(n＝10)(图1G)、糙米的垩白率(图1H)、穗颈中的维管束数(n＝20)(图1I)、和在两个旱季(DS)和雨季(WS)中的粒重/m²(图1J)。图1J中的柱上方的百分比为相对于IR64的NIL的产量增加。数值为平均值，须(whisker)表示s.d.(图1J中为s.e.m.)。***显著性在0.1％；**1％；*5％；n.s.，不显著。

图2A：SPIKE的图位克隆(map-basedcloning)和表达分析。高分辨率图将SPIKE基因座缩小至Ind4和Ind12之间的18.0-kbp区。候选基因以红色表示。方块表示基因模型预测的假象。图下方的数字表示重组体的数量。

图2B：SPIKE的图位克隆和表达分析。IR64和NIL-SPIKE(NIL)的茎(culm)、叶、叶鞘和根中的SPIKE的半定量表达分析。

图2C～图2D：SPIKE的图位克隆和表达分析。显示(C)冠根和侧根的横截面中(比例尺：50μm)和(D)幼穗中(比例尺：2mm)中NIL-SPIKE启动子所驱动的GUS生产的照片。

图2E：SPIKE的图位克隆和表达分析。显示在IR64和NIL-SPIKE的幼穗的3–5-、6–10-、11–20-和21–50-mm期的SPIKE定量表达分析的柱状图。将表达校准至IR64的3–5-mm穗期。数值是三个重复的平均值，须表示s.e.m.，*显著性在5％；n.s.，不显著。

图3A～图3D：通过过度表达和基因沉默对SPIKE的转基因分析。(图3A)显示IR64植物和其中SPIKE通过泛素启动子被过度表达的Ubi:SPIKE植物的形态学的照片。比例尺：20cm。(图3B)显示IR64和Ubi:SPIKE的穗结构的照片。比例尺：5cm。显示IR64(n＝17)和携带有单个拷贝(n＝20)和五个拷贝(n＝13)的Ubi:SPIKE植物的小穗数/穗(图3C)及旗叶宽度(图3D)的柱状图。

图3E～图3H：通过过度表达和基因沉默对SPIKE的转基因分析。(图3E)显示NIL-SPIKE植物和其中SPIKE被amiRNA沉默的转基因植物的形态的照片。比例尺：20cm。(图3F)显示NIL-SPIKE和转基因植物的穗结构的照片。比例尺：5cm。显示NIL-SPIKE(n＝5)和amiRNA1(n＝4)及amiRNA转基因植物(n＝3)的小穗数/穗(图3F)和旗叶宽度(图3H)的柱状图。数值为平均植，须表示s.d.。在C、D、G和H中示出了在5％水平下多重比较的杜克-克莱默检验的结果。

图4A～图4B：SPIKE提高了籼稻遗传背景的谷物产量。基因定位(蓝色椭圆)和照片显示了新植物品种型YP4的植物形态(图4A)和IRRI146与IRRI146-SPIKE的植物形态(图4B)。比例尺：20cm。

图4C～图4F：通过过度表达和基因沉默对SPIKE的转基因分析。柱状图显示了IRRI146和IRRI146-SPIKE之间的比较：(图4C)粒重/m²，(图4D)小穗数/穗，和(图4E)旗叶宽度(n＝0)。(图4F)柱状图显示了具有和不具有SPIKE的籼稻品种PSBRc18(来自菲律宾，n＝10)、TDK1(来自老挝，n＝10)、Ciherang(来自印度尼西亚，n＝13)、Swarna(来自印度，n＝17)和BR11(来自孟加拉国，n＝27)之间的小穗数/穗的比较，表征在菲律宾的IRRI的田间进行。数值为平均值，须显示s.e.，***显著性在0.1％；**1％；*5％。

图5：显示用于总小穗数/穗(NIL-SPIKE；右)的QTL的近等基因系以及在SPIKE隔离群体的育种(发育，development)方案的图。具有高小穗数的YTH326具有来自热带粳稻Daringan的基因渗入的片段；YTH326选自于BC3子代以用于遗传分析。使用DNA标记通过前景(foreground)和背景选择来选择NIL-SPIKE。凝胶图片显示了通过侧翼标记RM17483和RM17486的SPIKE区的基因型。

图6A～图6D：柱状图显示了2011的雨季(2011WS)和2012的旱季(2012DS)中IR64(蓝)和NIL-SPIKE(橙)的形态性状：(图6A)实粒(饱满谷粒，filledgrain)率(n＝20)；(图6B)单株穗数(穗数/植物，paniclenumberperplant)(n＝20)；(图6C)1000-粒重(n＝20)；(图6D)至抽穗的天数(n＝12)。数值为均值，须显示s.d.，**显著性在1％水平；*显著性在5％水平；n.s.，不显著。

图7：小穗数/穗、二次枝梗数(secondarybranchnumber)和叶宽度的高分辨率图。在Ind4和Ind12之间具有重组的植物的基因型，对于IR64表示为白色，对于YP9片段表示为灰色。影线框(hatchedbox)指示具有重组的区域。括号内的数字显示了在分子标记之间具有重组的植物数。数值为均值，须显示s.d.，**显著性在1％水平；*显著性在5％水平。

图8：在IR64和NIL-SPIKE中的SPIKE候选区中的三个预测基因的RT-PCR。为预测的基因Os04g52479、Os04g52500和Os04g52504设计了引物。分子标记Ex6.2、Ex7.2和Ex8.1是分别为Os04g52479、Os04g52500和Os04g52504开发的。UBQ5为一对用于扩增作为对照的泛素的引物。

图9A：作物种类之间的SPIKE蛋白质序列的比较。图示出了SPIKE的系统树。

图9B：作物种类之间的SPIKE蛋白质序列的比较。对比显示了水稻(IR64为SEQIDNO:6且NIL-SPIKE为SEQIDNO:7)、短柄草(Brachypodium)(SEQIDNO:90)、小麦(SEQIDNO:91)、高梁(SEQIDNO:92)和玉米(SEQIDNO:93)之间的比较。灰色区域指示胰蛋白酶样丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶结构域。红条指示IR64和YP9之间的取代。星号指示完全同源；分号指示氨基酸替代且间隔(间隔线，space)指示完全缺乏同源性。右边的整数指示每种蛋白质中的氨基酸残基的累计数。

图10A～图10C：通过NIL-SPIKE启动子驱动的GUS的表达。照片显示了(图10A)发芽的种子(比例尺：2mm)、(图10B)秆和穗颈的维管束(比例尺：500μm)、(图10C)幼叶(比例尺：2mm)。

图11A～图11B：SPIKE的表达的比较以及T₀植物(Ubi::SPIKE)的表征。(图11A)SPIKE在Ubi::SPIKE过表达子植物中的表达。UBQ5和OsActin1为用于扩增作为对照的泛素和肌动蛋白的引物对。(图11B)SPIKE在amiRNA基因沉默的植物中的表达。

图11C～图11D：SPIKE的表达的比较和T₀植物(Ubi::SPIKE)的表征。(图11C)显示具有零至七个拷贝数的T₀过表达子(overexpressor)植物之间的小穗数/穗的点图。(图11D)显示具有零至七个拷贝数的T₀过表达的植物之间的旗叶宽度的点图。

图11E：SPIKE的表达的比较和T₀植物(Ubi::SPIKE)的表征。通过在由BamHI消化的DNA上进行Southern杂交的拷贝数。蓝色方块指示Ubi:SPIKE(单个)植物，而红色方块指示Ubi:SPIKE(多个)植物。

图12A～图12D：野生型(T65)(绿)、nal1突变体(Fn188)(红)、IR64(蓝)、和NIL-SPIKE(橙)之间的农艺性状的比较：柱状图显示了(图12A)穗长、(图12B)旗叶长度、(图12C)旗叶宽度、(图12D)总小穗数/穗的比较。须表示s.d.；n＝15。不同的字母指示通过用于多重比较的杜克-克莱默检验显著性差异在1％水平。T65、Fn188、IR64和NIL-SPIKE于2011年8～11月种植于日本石垣市日本国际农业科学研究中心的热带农业研究阵线(TropicalAgriculturalResearchFront,JapanInternationalResearchCenterforAgriculturalSciences,Ishigaki,Okinawa,Japan)。在每一个点，在以丘间20cm和行间30cm播种15天之后，每丘移植单株植物。我们施用28kgha–1的P、28kgha–1的K和28kgha–1的N作为基础肥料并且在分蘖期施用相同的量。

图13A～图13B：在IR64和NIL-SPIKE中的胚芽鞘中的IAA运输。(图13A)柱状图显示了在琼脂块上的IR64和NIL-SPIKE的0–3mm胚芽鞘中的IAA生物合成的比较(n＝6)。(图13B)柱状图显示了在琼脂块上的IR64(蓝)和NIL-SPIKE(橙)(n＝6)的1.5–3mm胚芽鞘的IAA生物合成的比较。

图13C：在IR64和NIL-SPIKE中的胚芽鞘中的IAA运输。图表显示了使用胚芽鞘节(1.5–3.0mm)研究极性IAA运输的方法(n＝3)。

图13D：在IR64和NIL-SPIKE中的胚芽鞘中的IAA运输。柱状图显示了在IR64(蓝)和NIL-SPIKE(橙)胚芽鞘的极性IAA运输。须显示了s.d.。在27℃在红光下将表面灭菌种子萌芽2天，然后在黑暗中萌芽1天。对于IAA生物合成测定，用刀片(razorblade)切出六个胚芽鞘切段并且放置在1.2％琼脂块(3mm×15mm×2mm)上并且培育指定的时间。对于IAA运输测定，将三个胚芽鞘切段(1.5–3.0mm)放置在琼脂块上30分钟以耗尽IAA，然后放置在含有处于10mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)中的3μMIAA的滤纸上以接触顶或底切割面10分钟。然后，将所述胚芽鞘放置在一个新的琼脂块上。经过给定的时间段后，将琼脂块冻结在液体N2中。通过GC-SIM-MS确定IAA。

图14：Nal1序列比较。

图15：Nal1序列比较。图显示了预测基因06(PG06：假定窄叶1)、07(PG07：假定卵磷脂胆固醇酰基转移酶)和08(PG08：假想蛋白质)的ClustalW多重序列比对。从上至下的对比：水稻_cDNA；EST；Predgeneset；AutoPredgeneset；Genscan_arabi；Genscan_玉米；fgenesh_mono；水稻HMM；blastx_nr；mzef；AutoPredLTR；RepeatMasker；tRNAscan；tRNAscan；RepeatMasker；AutoPredLTR；mzef；blastx_nr；水稻HMM；fgenesh_mono；Genscan_玉米；Genscan_arabi；AutoPredneneset；Predgeneset；EST；和水稻_cDNA。

图16A～图16B：IR64、NIL-SPIKE和NIL-qTSN4.6之间的TSN和FLW的比较。柱状图比较了IR64、NIL(来自YP9的NIL-SPIKE)、FVW29(来自日本晴(Nipponbare)的NIL-qTSN4.6)、FVW32(来自日本晴的NIL-qTSN4.6)和FVW34(来自日本晴的NIL-qTSN4.6)之间的(图16A)旗叶宽度和(图16B)总小穗数。NIL-qTSN4.6的FLW与NIL-SPIKE的FLW相同，而NIL-qTSN4.6的TSN为IR64和NIL-SPIKE之间的中间表型。

具体实施方式

在整个本公开中，参照了各种出版物、专利和公布的专利说明书。这些出版物、专利和公布的专利说明书的公开在此通过引用并入本公开中，以更加充分地描述本发明所属技术领域的状态。

单数术语“一个(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”，除非上下文另有明确说明，包括多个指代物。类似地，措辞“或(or)”意为包括“和(and)”，除非上下文另有明确说明。还应当理解的是，为核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小、和所有分子量或分子质量值均是近似值，并且它们提供用于说明。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以在本公开的实践和测试中使用，但是下文描述了适合的方法和材料。术语“包含(comprises)”是指“包括(includes)”。缩写“e.g.”来源于拉丁文exempligratia并且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(forexample)”同义。

定义

“产量”描述了由植物或一组或一批植物生产的谷物的量。可以多种方式来测量产量，包括但不限于谷物产量/m²、tha^-1(t公倾^-1)、和单株平均谷物产量(平均谷物产量/植物，averagegrainyieldperplant)。

本文中所使用的“表型性状”是植物的可观察到的特征的不同变量(variant)，例如谷物产量，它们可以由植物遗传或可以通过诸如转染等方法人工并入到植物中。

本文中使用的“基因渗入(渐渗)”是指由于回交，一种或多种基因或一组基因从一种植物种类移动至另一种植物种类的基因复合物中。

本文中使用的“转基因植物细胞”是指例如通过农杆菌介导的转化或通过使用涂布有重组DNA的微粒的轰击或通过其它方法，转化有稳定-整合的、非天然的、重组DNA的植物细胞。本发明的转基因植物细胞可以是最初转化的植物细胞，其表现为可再生为分化组织的微生物或子代植物细胞，例如再生为具有稳定整合的、非天然的重组DNA的转基因植物或来源于子代转基因植的种子或花粉。

本文中使用的“转基因植物”是指基因组被重组DNA的稳定整合而改变的植物。转基因植物包括由最初转化的植物细胞再生的植物或来自转化植物的后代或杂交的子代转基因植物。

本文中使用的“重组DNA”是指经基因工程化并在细胞外构建的DNA，包括含有天然存在的DNA或cDNA或合成DNA的DNA。

“百分比同一性”是指在整个序列(例如核苷酸序列或氨基酸序列)对比窗口中，DNA或蛋白质片段的序列保持不变的程度。百分比同一性优选使用局部比对算法诸如BLASTp来在整个对比长度上进行计算。如本文中所使用的，当通过BLASTp产生的对比具有最小e-值时，序列是“匹配的(aligned)”。

本文中使用的“启动子”是指用于启动转录的调控DNA。“在植物细胞中是功能性的启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子，无论其原始来源是否是植物细胞，例如，众所周知农杆菌(Agrobacterium)启动子在植物细胞中是功能性的。因此，植物启动子包括获自于植物、植物病毒和细菌(诸如农杆菌与慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)细菌)的启动子DNA。

本文中使用的“可操作地连接”是指重组DNA构建体中两个或更多个DNA片段的关联，以便一个(例如蛋白质编码DNA)的功能受到另一个(例如启动子)的控制。

本文中使用的“表达”是指产生，例如当同源DNA被转录至mRNA再翻译至蛋白质时，在植物细胞中表达蛋白质。

本文中使用的“对照植物”是指不含赋予增强的谷物产量的重组DNA的植物。使用对照植物来识别并选择具有增强的谷物产量的转基因植物。适合的对照植物可以为用来生成转基因植物的亲本系的非转基因植物，即缺乏重组DNA。在一些情况下，适合的对照植物可以是不含重组DNA的半合子转基因植物系的子代植物，称为阴性分离体(segregant)。

术语“数量性状基因座”或“QTL”是指具有至少两个反映连续分布的表型性状的差异表达的等位基因的多态遗传基因座。

在本公开的上下文中的术语“与…相关联”或“相关联的”是指例如，处于连锁不平衡中的核酸和表型性状，即如果核酸和表型独立地分离，核酸与性状更经常在子代植物中一起发现。

术语“标记(标记物)”或“分子标记”或“遗传标记”是指遗传基因座(“标记焦点(markerfocus)”)，当识别遗传连接的基因座(诸如基因或数量性状基因座(QTL))时，其用作参考点。该术语还可以指代与所述基因组序列互补的核酸序列，诸如用作探针或引物的核酸。所述引物可以与标记序列的上游或下游序列互补。该术语还可以指代与标记相关联的扩增产物。该术语还可以指代与标记相关联的等位基因。与表型相关联的等位变异使得标记能够在序列的基础上区分种质(germplasm)。

在本公开的上下文中的术语“杂交的(crossed)”或“杂交”是指通过授粉的配子融合以产生子代(即，细胞、种子或植物)。该术语还涵盖有性杂交(一株植物被另一植物授粉)和自交(自花授粉，即在花粉和胚珠来自相同的植物或来自遗传上相同的植物时)。

通过转基因方法生产具有提高的谷物产量的水稻植物

根据一个具体的实施方式，包含新型基因SPIKE的核酸(优选DNA)序列或其产量提高部分可以用来生产具有提高的谷物产量的水稻植物。在这一方面，该实施方式提供了SPIKE或其产量提高部分用于产生具有提高的谷物产量的水稻植物的应用，并且涉及将包含SPIKE的核酸序列导入到籼稻品种中。所述核酸序列可以来源于任何合适的供体水稻植物。能够提供包含SPIKE的核酸序列的适合供体水稻植物或其产量提高部分是热带粳稻地方品种(landrace)Daringan、NPT品种YP9(IR68522-10-2-2)(其来源于籼稻品种Shennung89-366和Daringan的杂交)、热带粳稻巴厘岛Ontjer、和NPTIR65564-22-2-3(来自BaliOntjer)与IRRI146之间的杂交的子代。表现出相对高的谷物产量并且包含SPIKE的其它相关水稻植物也可以用作供体植物。

一旦在适合的供体水稻植物已识别，可以通过任何可用的方法将包含SPIKE的核酸序列或其产量提高部分转移至适合的受体植物中。例如，可以通过将供体水稻植物与易感受体水稻植物杂交(即通过基因渗入)、通过转化、通过原生质体融合、通过双单倍体技术或通过胚拯救、或者通过任何其它核酸转移系统来转移所述核酸序列，任选地随后选择包含SPIKE并且表现出提高的谷物产量的后代植物。对于转移的转基因方法，可以通过使用本领域中已知的方法从供体植物分离出包含SPIKE的核酸序列或其产量提高部分，并且可以通过转基因的方法，例如通过载体、在配子中、或以任何其它合适的转移元件如涂敷有所述核酸序列的弹道粒子(ballisticparticle)的方式，将分离的核酸序列转移到受体植物中。

植物转化一般包括构建在植物细胞中发挥功能的表达载体。在某些实施方式中，此种载体包含含有SPIKE的核酸序列或其产量提高部分并且处于调控元件(诸如启动子)的控制中或可操作地连接至该调控元件。该表达载体可以含有一个或多个此种可操作地连接的基因/调控元件的组合，前提条件是包含在所述组合中的基因的至少一个是SPIKE。所述载体可以为质粒的形式，并且可以单独使用或与其它质粒组合，使用本领域中已知的转化方法诸如农杆菌转化体系，以提供具有提高的谷物产量的转基因植物。

表达载体可以包括至少一个可操作地连接至调控元件(诸如启动子)的标记基因，其允许含有所述标记的转化细胞可以通过阴性选择(通过抑制不含有可选择的标记基因的细胞生长)或通过阳性选择(通过筛选由标记基因编码的产物)来回收。许多常用于植物转化的可选择的标记基因在本领域中是众所周知的，并且包括例如编码代谢解毒可能为抗生素或除草剂的选择性化学试剂的酶的基因或编码对抑制剂不敏感的改变靶的基因。本领域中已知多种阳性选择方法，诸如甘露糖选择。替代地，可以使用无标记转化来获得不具有所述标记基因的植物，其技术在本领域中是已知的。

将表达载体导入到植物中的一种方法是基于农杆菌的天然转化系统(参见例如Horschetal.,1985)。将表达载体导入到植物组织中的方法包括直接感染或使用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培养植物细胞。农杆菌载体系统的描述及农杆菌介导的基因转移的方法由Gruber和Crosby,1993以及Moloneyetal.,1989提供。还参见美国专利号5,591,616。植物表达载体和报告基因以及转化方案的一般描述以及农杆菌载体系统和用于农杆菌介导的基因转移方法的描述可以在Gruber和Crosby,1993中找到。培养植物组织的一般方法由例如Mikietal.,1993和Phillips,etal.,1988提供。用于分子克隆技术以及适合的表达载体的适合参考手册为Sambrook和Russell(2001)。

使用众所周知的方法组装在转基因方法中有用的重组DNA构建体，并且典型地包含可操作地连接至DNA的启动子，其表达提供了增强的农艺性状。其它构建体组分可以包括附加的调节元件，诸如5’前导区和用于增强转录的内含子、3’非翻译区(诸如聚腺苷酸化信号和位点)、转运用DNA(DNAfortransit)或信号肽。

已经描述了在植物细胞中具有活性的许多启动子。这些包括存在于植物基因组中的启动子以及来自其它来源的启动子，包括携带在根癌农杆菌的肿瘤诱导质粒的胭脂碱合成酶(NOS)启动子以及章鱼碱合成酶(OCS)启动子以及来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子。在植物细胞中发挥功能的启动子为本领域技术人员已知并且可用于本发明的重组多核苷酸中以提供所需基因在转基因植物细胞中的表达。

另外，所述启动子可以改变为含有多个“增强子序列”以协助提高基因表达。通过包括具有此种构建体的增强子序列，所选择蛋白质的表达可以得到增强。这些增强子经常出现在真核细胞中发挥功能的启动子中转录起始的5’，但是经常可以插入在编码序列的上游(5’)或下游(3’)。在一些情况下，这些5’增强元件为内含子。作为增强子特别有用的是水稻肌动蛋白1基因和水稻肌动蛋白2基因的5’内含子、玉米醇脱氢酶基因的内含子、玉米热休克蛋白70基因内含子和玉米皱缩1基因。

将表达载体导入到植物中的另一种方法基于微粒介导的转化(microprojectile-mediatedtransformation)，其中DNA被携带在微粒(微弹，microprojectile)的表面上。使用弹道装置将表达载体导入到植物组织中，所述弹道装置将微粒加速到速度300～600m/s，这足以穿透植物细胞壁和膜(参见，Sanfordetal.,1987,1993；Sanford,1988,1990；Kleinetal.,1988,1992)。用于将DNA导入到植物中的另一种方法是通过靶细胞的超声处理(参见Zhangetal.,1991)。替代地，已经使用脂质体或原生质体融合来将表达载体导入到植物中(参见例如Deshayesetal.,1985和Christouetal.,1987)。已经报道了使用CaCl₂沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA向原生质体中的直接摄取(参见例如Hainetal.1985和Draperetal.,1982)。还已经描述了原生质体和完整细胞和组织的电穿孔(D'Halluinetal.,1992和Laursenetal.,1994)。

在转化水稻靶组织之后，上述可选择的标记基因的表达允许使用当前在本领域中公知的再生和选择方法择优先择转化的细胞、组织和/或植物。本文所描述的标记也可以用于该目的。

通过非转基因方法生产具有提高的谷物产量的水稻植物

在用于生产具有提高的产量的水稻植物的另一个实施方式中，可以使用原生质体融合将核酸从供体植物转移至受体植物中。原生质体融合是两个或更多个原生质体(通过酶处理除去了细胞壁的细胞)之间的诱发或自发的联合，诸如体细胞杂交，以生产单个双核或多核细胞。(甚至可以由不能在自然界中杂种繁殖的植物物种来获得的)所述融合细胞组织培养成表现出性状的所需组合的杂交植物。更具体地，第一原生质体可以获自于表现出提高的谷物产量的水稻植物或其它植物系。例如，可以使用来自Darigan、YP9或BaliOntjer的原生质体。第二原生质体可以获自水稻或其它植物种类，优选广受欢迎的籼稻品种。此外，所述第二原生质体可以来自包含商业所需特性的水稻种类，诸如但不限于抗病性、抗虫性、耐杂草性等。然后使用本领域中已知的传统原生质体融合程序来融合原生质体。

替代地，在包含SPIKE的核酸从供体植物向受体植物的转移中可以采用胚拯救。胚拯救可以用作在植物不能产生有活力的种子时从杂交(杂种，cross)中分离胚的程度。在这种工艺中，植物的受精子房或未成熟的种子经组织培养以产生新植物。

还可以使用传统育种技术以将编码SPIKE的核酸序列基因渗入到其中需要更高的谷物产量的靶受体水稻植物中，优选籼稻品种。在一个方法中，被称为家系育种(pedigreebreeding)，将包含编码SPIKE的核酸序列的供体水稻植物与其中需要更高的谷物产量的水稻植物杂交，优选籼稻品种。然后将产生的植物群体(表示为F1杂种)自花授粉和结籽(F2种子)。然后，对由F2种子生长的F2植物提高的谷物产量进行筛选。可以许多不同的方式对所述群体进行提高谷物产量的筛选。例如，可以通过几个季节的田间评估来筛选群体。可以通过谷物产量/m²(GYS)、每公顷谷物的重量(例如tha^-1、kgha^-1)、单株平均粒重或本领域中已知的其它方法来确定产量。

可通过本文所描述的方法获得的具有提高的谷物产量的水稻植物或其部分也是本发明的一个实施方式

一个特定的实施方式涉及具有提高的谷物产量的水稻植物或其部分，其包含处于其基因组中的SPIKE或其产量提高部分，其中SPIKE或其产量提高部分不处于其天然遗传背景中。本文中所描述的具有提高的谷物产量的水稻植物可以是任何遗传类型，诸如自交、杂交、单倍体、二倍体、单性结实(parthenocarp)或转基因。进一步的，本发明的植物可以是用于提高谷物产量性状的杂合子或纯合子，优选纯合子。尽管可以将SPIKE或其产量提高部分转移至任何植物中以提供具有提高的谷物产量的植物，但是本文所描述的方法和植物优选涉及谷物禾本科(禾谷科、禾谷家族，cerealgrassfamily)，更优选水稻。

具有提高的谷物产量的近交水稻系可以使用轮回选择和回交、自交和/或双单倍体技术或用来形成亲本系的任何其它技术来开发。在选择和回交的方法中，可以通过使轮回亲本与第一供体植物(其不同于轮回亲本并且在本文中称为“非轮回亲本”)杂交以将提高的谷物产量基因渗入到靶受体植物(称为轮回亲本)。所述轮回亲本是其中需要提高谷物产量的植物，优选籼稻品种。任选地，所述轮回亲本具有商业可取的特性，诸如但是不限于抗病性、抗虫性、耐杂草性等。所述非轮回亲本包含编码SPIKE的核酸序列。非轮回亲本可以是与轮回亲本生杂交可育(cross-fertile)的任何植物种类或近交系。将由轮回亲本与非轮回亲本之间杂交产生的子代回交至所述轮回亲本。然后筛选所产生的植物群体。可以许多不同的方式来筛选所述群体。然后将表现出提高的谷物产量并且包含编码SPIKE的必需的核酸序列的F1杂交植物进行选择并且自交并且在许多代中进行选择以使得水稻植物变得越来越近交。这种连续的自交和选择的工艺可以进行0～5或更多代。这种育种和选择的结果是产生与提高的谷物产量相关联的基因以及与商业利益性状相关联的其它基因遗传上同质(同源，homogenous)的系。

替代使用生物测定的表型病理筛选，可以使用本文中所描述的分子标记、杂交探针、或多核苷酸中的一种或多种来进行标记辅助的选择(MAS)，来识别包含编码SPIKE的核酸序列的那些子代。替代地，可以使用MAS来确认由定量生物测定获得的结果。一旦做出了适合的选择，则重复所述过程。将向轮回亲本的回交和选择提高的谷物产量的工艺重复约五代或更多代。由这种工艺产生的子代对于SPIKE是杂合的。然后将最后的回交代自交，以提供具有提高的谷物产量的纯合纯育种后代。

本文中所描述的具有提高的谷物产量的水稻系可以用于附加的杂交中以声称具有提高的谷物产量的杂交植物。例如，通过本文所描述的方法生产的具有提高的谷物产量的第一近交水稻植物可以与具有商业需要的性状(诸如但不限于抗病性、抗虫性、耐杂草性等)的第二近交水稻植物杂交。这种第二近交水稻系可以具有或可以不具有相对提高的谷物产量。

标记辅助的选择和回交

本文中描述了SPIKE标记辅助的选择(MAS)和标记辅助的回交(MABC)

分子标记可以包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)或简单序列重复(SSR)。开发作物物种中的分子标记的主要动机是，通过标记辅助的选择(MAS)和标记辅助的回交(MABC)在植物育种中增加效率的潜力。使用遗传标记等位基因来识别在一个或多个基因座含有所需基因型并且预计将所需要的基因型与所需要的表型一起转移给它们的子代的植物。遗传标记等位基因可以用来识别在一个基因座或在多个未连锁的或连锁的基因座(例如单倍型)含有所需要的基因型并且预计将所需的基因型与所需的表型一起转移给它们的子代的植物。

在所需表型(例如提高的谷物产量)和多态染色体基因座被确定为一起分离之后，能够使用这些多态基因座来选择相应于所需表型的等位基因：一种称为标记辅助的选择的工艺(MAS)。简言之，在来自待选择植物的生物样品中检测与标记核酸相对应的核酸。这种检测可以采用探针核酸与标记的杂交的形式，例如使用等位基因特异性杂交、Southern分析、Northern分析、原位杂交、引物杂交，随后是PCR扩增标记的区域等。本文中描述了各种用于检测标记的程序。在验证了生物样品中的特定标记和/或标记等位基因的存在(或不存在)之后，选择所述植物，即用于通过选择性育种来产生子代植物。

对大量植物进行提高的谷物产量的筛选是昂贵、耗时且不可靠的。将本文所描述的基因连锁核酸用作提高谷物产量的遗传标记，是一种在育种方案中选择能够育性恢复的植物的有效方法。例如，标记辅助的选择在田间评价提高的谷物产量中的一个优势是，MAS可以在一年中的任何时间进行，而与生长季节无关。另外，环境的影响与MAS无关。

MAS在植物育种中的另一种应用是辅助通过回交育种的轮回亲本基因型的恢复。回交育种是一种将子代与其亲本之一杂交的方法。回交通常用于一个或少数几个基因座从供体亲本基因渗入到在其他情况下来自轮回亲本的所需遗传背景中这一目的而进行。回交的循环次数越多，轮回亲本对所产生的种类的遗传贡献越大。这往往是必要的，因为供体亲本植物在其他情况下可能是不可取的。相反，作为强化育种(intensivebreeding)方案的结果的种类可能仅在一个所需的性状上存在缺陷，诸如提高的谷物产量。可以进行回交来选择或反对(抵制，against)一个性状。

可以通过本领域中已经确立的多种方法来检测与群体的成员之间的遗传多态性相对应的标记(例如限制性片段长度多态性、同工酶标记(isozymemarker)、等位基因特异性杂交(ASH)、植物基因组的扩增可变序列(amplifiedvariablesequencesoftheplantgenome)、自持续序列复制(self-sustainedsequencereplication)、简单序列重复(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)或扩增片段长度多态性(AFLP))。

大多数遗传标记依赖于核酸的用于检测它们的一种或多种性质。例如，一些用于检测遗传标记的技术利用探针核酸与相应于所述遗传标记的核酸的杂交。杂交形式包括但不限于溶液相、固相、混合相或原位杂交测定。通过将探针(其典型地为与待检测的核酸的子片段的相对应的子片段或合成寡核苷酸)与限制性消化基因组DNA的杂交来检测作为限制性片段长度多态性(RFLP)的标记。选择限制酶以提供在不同的个体中至少两个替代(或多态性)长度的限制性片段，并且限制酶在系与系之间往往不同。确定为每次杂交产生信息片段的(一个或多个)限制酶在本领域中是众所周知的简单程序。在适合的基质(例如琼脂糖)中通过长度分离并且转移至膜(例如硝基纤维素、尼龙)后，在导致探针与靶平衡结合的条件下将标记的探针杂交，随后通过洗涤除去过量的探针。可以克隆和/或合成针对标记基因座的核酸探针。适合于与核酸探针使用的可检测标记包括任何可通过光谱、放射性同位素、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的组合物。有用的标记包括用于以标记的链霉抗生物素蛋白(streptavidin)偶联物、磁珠、荧光染料、放射性标记、酶和比色标记染色的生物素。其它标记包括结合标记有荧光团、化学发光剂和酶的抗体的配体。标记标记物可以诸如通过使用针对标记基因座的标记的PCR引物来容易地实现。

然后使用最典型地放射自显影或其它类似检测技术(例如，荧光照相术、液体闪烁计数器等)来检测杂交的探针。本领域中广泛可获得具体的杂交方案的实例。

扩增的可变序列是指在同一物种的成员之间表现出高核酸残基可变性的植物基因组的扩增序列。所有的生物体均具有可变的基因组序列并且每种生物体(除了克隆之外)具有不同组的可变序列。一旦确定，具体可变序列的存在可以用来预测表型性状。优选地，来自植物的DNA充当用于以侧接DNA的可变序列的引物进行扩增的模板。扩增所述可变序列，然后进行测序。

体外扩增技术在本领域中是众所周知的。技术实例包括体外方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Ο,β-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA)。基本上任何RNA均可以转化为适合于限制性消化、PCR扩增和使用逆转录酶及聚合酶测序的双链DNA。

例如在扩增反应中用作引物且用作核酸序列探针的寡核苷酸典型地是根据固相亚磷酰胺三酯法来化学合成或可以简单地商业订购。

替代地，自持续序列复制可以用来识别遗传标记。自持续序列复制是指一种使用在基本等温条件下在体外指数复制的靶核酸序列的核酸扩增的方法，其通过使用涉及逆转录病毒复制的三种酶活性：(1)逆转录酶、(2)核糖核酸酶H和(3)DNA-依赖性RNA聚合酶。通过模拟通过cDNA中间体的RNA复制的逆转录病毒策略，这种反应累积了原始靶的cDNA和RNA拷贝。

具有许多不同类型的分子标记，包括扩增片段长度多态性(AFLP)、等位基因特异性杂交(ASH)、单核苷酸多态性(SNP)、简单序列重复(SSR)和同工酶标记。SSR数据是通过将引物杂交至植物基因组的保守区而生成的，该保守区侧接SSR序列。然后使用PCR来扩增引物之间的重复。然后将扩增的序列进行电泳以确定尺寸并因此测定二、三和四核苷酸重复。

通过以上列举的任何方法(例如RFLP、AFLP、SSR等)确定SPIKE在表现出优选的表型性状的植物的基因组中的存在。如果来自植物的核酸对于所需的遗传标记呈阳性，可以将该植物自交以形成真正的具有相同基因型的育种系或其可以与具有相同标记或具有其它所需特性的植物杂交以形成有性杂交的杂种世代。

本发明的材料和方法可以类似地用来在除了水稻之外的谷物草(诸如小麦、高粱和玉米)中赋予提高的谷物产量。

实施例

在下列实施例中进一步限定本文所描述的方法和实施方式，其中所有的份和百分比均按重量计并且度是摄氏度，除非另有说明。本发明的某些实施方式限定在本文的实施例中。应当理解的是，这些实施例虽然指示了本发明的优选实施方式，但是它们仅以示例性的方式给出。由本文的论述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。

结果

NIL-SPIKE的表征

在此处指定为SPIKE(SPIKELET编号)的数量性状基因座(QTL)qTSN4，通过使用用于SPIKE的NIL(NIL-SPIKE)来进行表征(图1A)。NIL-SPIKE具有比IR64更大的穗(图1B)、叶(图1C)和穗颈(图1D)。在产量相关性状中，其具有更高的TSN(图1E)、旗叶宽度(FLW；图1F)、根干重(RDW；图1G)和实粒率(图2A)，但具有更低的穗数/植物和1000-粒重(图2B,2C)。显著地，与实粒率一起，改善了谷粒的外观(图1H)，推测是由于增加的维管束数(VBN；图1I)加强了向较大数量的小穗的同化供应(assimilatesupply)。因此，在四个种植季节中，NIL的谷物产量/m²(GYS)均一致地高于IR64，在四个季节中的三个中是显著的(图1J)。与IR64(～400g/m²)相比，NIL的平均GYS在旱季时高出28％且在雨季高出24％。因此，通过增大库容大小(sinksize)(高TSN)、源尺寸(宽FLW和高RDW)以及转运能力(高VBN)而实现了NIL的GYS增加且不降低谷粒外观。此外，至抽穗的天数未改变(图2D)。因此，SPIKE高度有用于提高产量而不改变局部适应性状。

高分辨率连锁图谱和SPIKE的识别

为了识别SPIKE的基因，使用用于评价TSN的7996BC₄F₃植物来进行高分辨率连锁分析。候选区域处于标记Ind4和Ind12之间(18.0kbp)，其中MichiganStateUniversity的水稻基因组注释项目(RiceGenomeAnnotationProject)数据库预测了三个基因(图2A)。除了TSN之外，所提议的基因与二次分枝数和叶宽的增加相关联(图7)。幼穗中的表达分析显示，仅表达了Os04g52479(Nal1:NARROWLEAF1)(图8)，因此是SPIKE的最可能的候选物。SPIKE的预测的氨基酸序列的分析显示在IR64和NIL-SPIKE之间存在三个氨基酸取代，它们中的一个处于胰蛋白酶样丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶结构域中(图9)。另外，SPIKE蛋白显示出与短柄草(Brachypodium)、小麦、高粱和玉米具有>84％的同一性以及在胰蛋白酶样丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶结构域中的高类似性。这种类似性表明了SPIKE蛋白质家族在这些物种之间的生物化学功能的保守性。

SPIKE的表达分析

SPIKE在多个器官中一致性表达(图2B)。为了在植物发育期间分析SPIKE的表达，在转基因IR64植物中在天然SPIKE启动子的控制下表达β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因。组织化学分析显示了在穗颈和茎、叶(图6A～6C)、冠根、侧根(图2C)和幼穗(图2D)的胚芽鞘、维管束中的GUS活性。除了胚芽鞘之外，GUS表达的模式与NIL-SPIKE中的器官增大一致。定量RT-PCR显示，幼穗中在各个时期的SPIKE的表达在NIL-SPIKE中比在IR64中的一致性更高，且在21–50-mm时期为IR64的两倍(P＝0.05；图2E)。结果显示，幼穗期的SPIKE表达的增加提高了小穗数。

通过转基因分析的SPIKE的基因验证

为了验证收集的数据并且为了洞察SPIKE的功能，生成了过表达子系(使用组成型启动子)和沉默系(使用人工microRNA:amiRNA)。通过转化将与泛素启动子(Ubi:SPIKE)融合的含有来自NIL-SPIKE的SPIKE的cDNA的DNA片段导入到IR64中。过表达子转基因植物显示出与NIL-SPIKE相似的表型，包括大穗和宽旗叶(图3A、图3B)。携带单个拷贝的植物具有比IR64显著更高的TSN和FLW(图3C、3D)。携带多个拷贝的植物比具有单个拷贝的那些具有显著更大的TSN和FLW，表明TSN和FLW与SPIKE的表达一起增加。在该事件中观察到了携带多个拷贝的显著更高的转录本(图7A)。这表明了SPIKE转录本对植物表型的剂量效应。此外，T₀Ubi:SPIKE植物的TSN和FLW随拷贝数增加(图7C～7E)。相反，将靶向SPIKE的第一(amiRNA1)和第四外显子(amiRNA4)的两个amiRNA前体转化至NIL-SPIKE中以下调SPIKE(图3E、3F；7B)，产生了具有比NIL-SPIKE显著更低的TSN和更窄叶子的转基因植物(图3G、3H)。

相对于野生型Taichung65，nal1(功能丧失)突变体Fn188类似地显示出降低的TSN和FLW(图12)。这些结果表明SPIKE(来自热带粳稻的Nal1的新等位基因)与表达对应地增大了穗和旗叶。尽管Nal1报告为与生长素极性运输相关，但是未观察到IR64和NIL-SPIKE之间的吲哚乙酸(IAA)生物合成或运输的差异(图13)。转基因分析表明，SPIKE与Nal1相同，其影响在叶中叶脉图案和生长素极性运输。从自然变异识别的SPIKE为来自热带粳稻的新等位基因，而从突变系中识别的nal1为丧失功能的突变。与野生型相比，nal1突变体降低了TSN，而来自热带粳稻的新等位基因在Nal1中显示出增加的TSN。数据显示，生长素转运活性在穗分化期与TSN相关。通过增加TSN，从而增加了NIL-SPIKE的谷物产量。

通过SPIKE增强籼稻品种的谷物产量

为了评价SPIKE在不同的遗传背景中增加产量的效能，将所述基因基因渗入到新的高产量的籼稻品种IRRI146(在菲律宾发布为‘NSICRc158’)中。轮回回交至IRRI146并且标记辅助选择(MAS)产生了IRRI146-SPIKENIL(图4A、图4B)。由于IRRI146-SPIKE与IRRI146具有98％的遗传同一性，所以SPIKE在IRRI146中的多效性作用(pleiotropiceffects)与在NIL-SPIKE中的类似。IRRI146-SPIKE的GYS、TSN和FLW显著高于IRRI146的GYS、TSN和FLW(图4C～图4E)。类似地，将来自YP9的SPIKE导入到具有不同遗传和地域背景的五种流行的籼稻品种中。在不同遗传背景的流行籼稻品种，来自菲律宾的PSBRc18(IR51672-62-2-1-1-2-3)、来自印度尼西亚的Ciherang、来自老挝的TDK1、来自孟加拉国的BR11、来自印度的Swarna上确认了其效果。对于SPIKE为纯合子的植物比轮回亲本具有显著更高的TSN(图4F)。

材料与方法

植物材料

通过回交育种，在籼稻品种IR64的遗传背景中开发了334BC₃-衍生的IL，其在遗传自NPT品种的农艺性状上存在变异。我们选择了衍生自NPT品种YP9(IR68522-10-2-2)的具有高TSN的IL：YTH326(IR84640-11-110-6-4-2-2-4-2-2-3-B)，该NPT品种YP9(IR68522-10-2-2)衍生自籼稻品种Shennung89-366和热带粳稻地方品种Daringan之间的杂交(图5)。使用衍生自IR64和YTH326之间的杂交的BC₄F₂群体，在染色体4的长臂上的SSR标记RM3423和RM17492之间识别了用于高TSN的qTSN4。通过选自BC₄F₂群体的植物的自花授粉而开发了NIL-SPIKE并且用于评估农艺性状、转化和表达。

携带nal1的系Fn188由KyushuUniversity的国家生物资源项目提供。Fn188是由来源于作为供体亲本的nal1突变体与作为轮回亲本的粳稻品种Taichung65之间的杂交的BC₃子代开发的。nal1基因座定位在染色体4的长臂上的标记C1100和C600之间。由于认为Nal1与SPIKE相同，所以将Fn188用于农艺表征以比较SPIKE的效果。

IRRI146-SPIKE的开发

高产量籼稻品种IRRI146(IR77186-122-2-2-3)最近在菲律宾发布为‘NSICRc158’。将来自热带粳稻巴厘岛Ontjer的NPTIR65564-22-2-3与IRRI146之间杂交的子代回交至IRRI146三次。在每一代中，使用SPIKE-侧翼标记RM5503和RM6909进行MAS。使用覆盖所有染色体的116个多态性SSR标记进行96BC₃F₁植物的全基因组调查。选择一株BC₃F₁植物并且自花授粉以在IRRI146遗传背景中开发用于SPIKE的NIL。将这种IRRI146-SPIKE与轮回亲本进行农艺性状与谷物产量的比较。

具有SPIKE的籼稻品种的开发

通过回交和MAS将SPIKE基因渗入至五个流行品种中：PSBRc18(IR51672-62-2-1-1-2-3)(菲律宾)、Ciherang(印度尼西亚)、TDK1(老挝)、BR11(孟加拉共和国)和Swarna(印度)。将YP9和每个品种之间杂交的子代回交至流行品种两次。在每一代中，使用SPIKE-侧翼标记Ind2和RM17487进行MAS。从每个BC₂F₂群体选择SPIKE的纯合植物并且在田间评价TSN。

SPIKE的表型评价

所有的植物均种植于IRRI、洛斯巴尼奥斯、拉古娜、菲律宾的田间，并且评价成熟期的1000-粒重量、PN、FLW和TSN。在颈(neck)下1cm处切下穗轴(paniclerachis)，并且在立体显微镜下对VBN计数。在成熟期测量在盆中生长的植物的RDW。

为了评价谷物产量，在随机地块中种植IR64、NIL-SPIKE、IRRI146和IRRI146-SPIKE，每系四个重复。每个地块的面积至少为4.8m²；在以丘间20cm和行间25cm播种后的第21天，每丘移植三株植物。作为底肥(basaldressing)，在移植之前的一天施用N、P和K各30kg/ha，并且在移植后的第2和4周施用30kg/haN两次作为追肥(topdressing)。在成熟期，收获1.0m²的水稻植物(每地块20丘)，在70℃在烘箱中将植物干燥5天。在14％水分含量的基础上计算GYS。使用谷粒检查器(Cervitec1625GrainInspector,FOSSAnalytical,Denmark)评价谷粒垩白，每系四个重复。

高分辨率连锁图

由SPIKE的杂合BC₄F₂植物产生的7996BC₄F₃植物的基因组DNA提取自鲜叶。具有侧翼标记RM17450和RM3836之间组合的1073BC₄F₃植物的基因组DNA通过十六烷基三甲基溴化铵方法单独从冻干叶中提取。选择表现出RM3423和AGT3之间的重组的41BC₄F₃植物进行自花授粉以产生用于子代测试的BC₄F₄系。在BC₄F₄系中，从代表性重组体中选择纯合植物并且评价TSN和FLW。将二十二个DNA标记用于图谱构建(表1)。

表1：染色体4上的用于高分辨率定位总小穗数的QTL的DNA标记

SPIKE的转化

使用引物对8M17-c1由来源于NIL-SPIKE的幼穗的cDNA扩增包含SPIKE的全长编码区的片段。将所述片段连接到玉米泛素启动子和胭脂碱合成酶终止子之间的二元载体pCAMBIA1300int-prUbi1-tNOS以生成过表体载体。使用农杆菌介导转化，我们将该载体导入到了IR64中。通过Southern印迹分析来评价再生植物的转基因拷贝数。对于SPIKE的基因沉默，使用了amiRNA方法。使用WebMicroRNADesigner3软件设计两个21-bpamiRNA序列—amiRNA1(TATAAGAAGTATGCTGCGCTA(SEQIDNO:4)，用于SPIKE的第一外显子)和amiRNA4(TTAATATCAAGTTCCAGACGC(SEQIDNO；5)，用于第四外显子)。以质粒pNW55作为模板，使用重叠PCR通过定位诱变来生成amiRNA前体(表1)。将该前体连接到二元载体pCAMBIA1300int-prUbi1-tNOS以生成沉默载体。使用农杆菌介导转化，我们将该载体导入到了NIL-SPIKE中。将转基因植物(T₀)移植到盆中，并且将T₁植物以丘间20cm且行间30cm移植到温室中。评价这些植物的TSN和FLW。

为了生成启动子：GUS载体，使用引物对UP6-1从SPIKE的ATG密码子上游扩增1918-bp片段。将该扩增的片段连接到GUS报告基因的上游的二元载体pCAMBIA0380(Cambia,Canberra,ACT,Australia)。通过农杆菌介导转化将这种载体导入到IR64中。对再生植物的器官进行采样以分析GUS活性。

表达分析和IAA运输

通过使用RNeasyPlantMiniKit(Qiagen,California,USA)从各器官中提取总RNA。为了识别SPIKE的候选基因，使用1μg总RNA进行RT-PCR。以用于每一候选物的基因特异性引物使用1μLcDNA进行PCR(表1)。对于在不同器官中的表达的比较，在幼穗分化始期(panicleinitiationstage)提取幼穗、茎、叶鞘、叶和根的总RNA。使用引物对seq8M17-56和ReverTraAceqPCRRT试剂盒(Toyobo,Osaka,Japan)以500ng总RNA进行RT-PCR。在LightCycler480系统(RocheAppliedScience)上，使用引物对seq8M17-56以LightCycler480SYBRGreenIMasterMix，用1/5cDNA混合物进行qRT-PCR反应。将数据归一化至看家基因泛素(Ubiquitin)(Os01g22490)的表达。

通过气相色谱-选择离子监测-质谱(GC-SIM-MS)测量从切胚芽鞘运输到琼脂块(图13)的IAA的量，以调查IR64和NIL-SPIKE胚芽鞘中的IAA生物合成速率。为了调查IR64和NIL-SPIKE胚芽鞘中的极性IAA运输，将3μMIAA施加到胚芽鞘切段(1.5～3.0mm)的顶面上30min，然后在琼脂块上将该胚芽鞘温育10min，并且通过上述的GC-SIM-MS测量运输的IAA。

在本说明书中提及的所有出版物(包括专利和非专利文献)通过引用明确地并入本文。本文中引用的任何文献的引用不旨在承认前述任一者是相关的现有技术。关于这些文献的日期的所有陈述或关于这些文献的内容的所有表述均基于申请人可获得的信息并且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。

虽然已经参照各种且优选的实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本发明的实质范围的条件下可以进行各种变化且可以使用等同物来替代其元素。此外，在不脱离本发明的实质范围的条件下，可以进行许多修改以使特定的情况或材料适应本发明的教导。

因此，意图在于本发明不受限于为实施本发明所设想的本文公开的特定实施方式，并且本发明将包括落入权利要求书范围内的所有实施方式。

Claims

1.一种用于生产具有提高的谷物产量的子代水稻植物的方法，包括：

a)提供包含基因SPIKE的第一水稻植物；

b)使所述第一水稻植物与第二水稻植物杂交以产生子代水稻植物；

c)对所述第二水稻植物分析所述基因SPIKE；

d)识别并选择包含所述基因SPIKE并且相对于所述第二水稻植物具有提高的谷物产量的子代水稻植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE包含选自于由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101和SEQIDNO:102构成的组中的多核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE包含一种多核苷序列，所述多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于选自于由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101、和SEQIDNO:102构成的组中的序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE包含一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一于SEQIDNO:2。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测选自于由RM5503、RM3423和Ind4构成的组中的第一上游分子标记以及选自于由RM6909、AGT3、RM17487、RM17486和Ind12构成的组中的第二下游分子标记来识别的。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测选自于由RM3423和Ind4构成的组中的第一上游分子标记以及选自于由AGT3、RM17487、RM17486和Ind12构成的组中的第二下游分子标记来识别的，其中所述第一上游分子标记和第二下游分子标记是使用表1中列示的相应的正向引物和反向引物来检测的。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测约105个碱基对的第一分子标记Ind2和约252个碱基对的第二分子标记RM17487来识别的。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测约105个碱基对的第一分子标记Ind2(正向引物：ACAAGAAGCCGGGAAACCTA(SEQIDNO:27)；反向引物：CTCCTCCGGTCCTCCTTAAC(SEQIDNO:28)以及约252个碱基对的第二分子标记RM17487(正向引物：CGGAGCATGTGGAGAGGAACTCG(SEQIDNO:55)；反向引物：GGAGAGGGCAAGGGCTTCTTCG(SEQIDNO:56)来识别的。

9.一种生产具有提高的谷物产量的近交水稻植物的方法，包括：

a)根据权利要求1所述的方法生产具有提高的谷物产量的水稻植物；

b)使步骤a)中产生的水稻植物与其自身或另一水稻植物杂交以产生子代水稻种子；

c)种植步骤b)的子代水稻种子以产生具有提高的谷物产量的另外的水稻植物；和

d)重复所述杂交和种植步骤0～7次以生成具有提高的谷物产量的近交水稻植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤c)进一步包括步骤：识别并选择表现出提高的谷物产量的水稻植物。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法进一步包括步骤：选择纯合子近交水稻植物。

12.一种用于生产具有提高的谷物产量的水稻植物的方法，所述方法包括：

a)提供包含基因SPIKE的第一水稻植物；

b)将编码基因SPIKE的核酸从所述第一水稻植物转移至第二水稻植物；

c)对所述第二水稻植物分析所述基因SPIKE；

d)识别并选择包含所述基因SPIKE并且当与转移之前的所述第二水稻植物相比时表现出提高的谷物产量的第二水稻植物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述基因SPIKE包含选自于由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101和SEQIDNO:102构成的组中的多核苷酸序列。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述基因SPIKE包含一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于选自于由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101和SEQIDNO:102构成的组中的序列。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述基因SPIKE包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SEQIDNO:2的多核苷酸序列。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测选自于由RM5503、RM3423和Ind4构成的组中的第一上游分子标记以及选自于由RM6909、AGT3、RM17487、RM17486和Ind12构成的组中的第二下游分子标记来识别的。

17.根据权利要求12所述的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测选自于由RM3423和Ind4构成的组中的第一上游分子标记以及选自于由AGT3、RM17487、RM17486和Ind12构成的组中的第二下游分子标记来识别的，其中所述第一上游分子标记和第二下游分子标记是使用表1中列示的相应的正向引物和反向引物来检测的。

18.根据权利要求12所述的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测约105个碱基对的第一分子标记Ind2以及约252个碱基对的第二分子标记RM17487来识别的。

19.根据权利要求12所述的方法，其中所述基因SPIKE是通过检测约105个碱基对的第一分子标记Ind2(正向引物：ACAAGAAGCCGGGAAACCTA(SEQIDNO:27)；反向引物：CTCCTCCGGTCCTCCTTAAC(SEQIDNO:28)以及约252个碱基对的第二分子标记RM17487(正向引物：CGGAGCATGTGGAGAGGAACTCG(SEQIDNO:55)；反向引物：GGAGAGGGCAAGGGCTTCTTCG(SEQIDNO:56)来识别的。

20.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸从所述第一水稻植物向所述第二水稻植物的转移是通过使所述第一水稻植物与所述第二水稻植物杂交来进行的，以生产包含所述基因SPIKE的后代植物，并且其中在一个或多个后代植物上进行步骤c)和d)。

21.根据权利要求12所述的方法，其中核酸从所述第一水稻植物向所述第二水稻植物的转移是通过转基因方法、通过杂交、通过回交、通过原生质体融合、通过双单倍体技术或通过胚拯救来进行的。

22.根据权利要求12所述的方法，其中回交导致基因SPIKE的基因渗入以及至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％的所述第二水稻植物的基因组的恢复。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第二水稻植物的基因组的恢复为92％和97％之间。

24.根据权利要求12所述的方法，其中步骤d)进一步包括使所述第二水稻植物经受用于测量谷物产量的生物测定。

25.一种具有提高的谷物产量的水稻植物或其部分，通过根据权利要求12所述的方法生产，其中所述水稻植物或其部分包含基因SPIKE，并且其中所述基因SPIKE不处于其天然遗传背景中。

26.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一水稻植物选自于来源于新株型(NPT)品种YP9的水稻植物的等基因系。

27.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一水稻植物选自于水稻(Oryzasativa)亚种热带粳稻(tropicaljaponica)。

28.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一水稻植物为Daringan。

29.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二水稻植物选自于水稻亚种籼稻(indica)。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第二水稻植物选自于由PSBRc18、Ciherang、TDK1、BR11和Swarna构成的组。

31.一种转基因植物细胞，包含：

a)至少一种植物启动子；和

b)至少一种多核苷酸，其编码至少70％同一于蛋白质SPIKE的多肽序列(SEQIDNO:3)的多肽序列；

其中所述启动子和多核苷酸可操作地连接并且并入到植物细胞染色体DNA中。

32.权利要求31的转基因植物细胞，其中所述细胞的类型选自于由水稻、小麦、高粱和玉米构成的组。

33.权利要求31的转基因植物细胞，其中所述植物细胞对于基因SPIKE是纯合的。

34.一种转基因植物，包含多个权利要求31的细胞。

35.一种转基因植物，包含：

a)至少一种植物启动子；和

b)至少一种至少70％同一于SPIKE的多核苷酸序列的多核苷酸序列，其中SPIKE的多核苷酸序列包含选自于由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101和SEQIDNO:102构成的组中的序列；

其中所述启动子和多核苷酸可操作地连接并且并入到植物染色体DNA中。

36.权利要求35的转基因植物，其中所述植物选自于由水稻、小麦、高粱和玉米构成的组。

37.权利要求36的转基因植物，其中所述植物是水稻植物。

38.权利要求35的转基因植物，其中所述多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SPIKE的多核苷酸序列。

39.权利要求35的转基因植物，其中所述植物对于基因SPIKE是纯合的。

40.权利要求35的植物的种子。

41.权利要求35的植物的植物部分。

42.权利要求35的转基因植物，其中所述植物表现出选自于由以下构成的组的表型：相对于相应非转基因植物增加的谷物产量/m²；相对于相应非转基因植物增加的总小穗数/穗；以及相对于相应非转基因植物增加的旗叶宽度。

43.一种用于选择转基因植物的方法，包括：

a)对群体进行提高的谷物产量的筛选，其中所述群体中的植物包含至少一种转基因植物细胞，所述细胞具有并入到其染色体DNA中的重组DNA，其中所述重组DNA包含启动子，所述启动子在植物细胞中是功能性的并且功能性地连接于至少70％同一于SPIKE的多核苷酸序列的多核苷酸序列的开放阅读框，其中所述群体中的包含至少一个转基因植物细胞的个体植物表现出的谷物产量相同于或大于对照植物的谷物产量，所述对照植物不包含至少一种转基因植物细胞；和

b)从所述群体中选择一种或多种植物，所述植物表现出的谷物产量大于对照植物的谷物产量，所述对照植物不包含至少一种转基因植物细胞。

44.权利要求43的方法，进一步包括步骤：从步骤b)中选择的一种或多种植物中收集种子。

45.权利要求43的方法，进一步包括：

a)验证所述重组DNA稳定地整合到所选择的植物中；和

b)分析所选择的植物的组织以确定至少70％同一于SPIKE的多核苷酸序列的多核苷酸序列的表达，其中所述SPIKE的多核苷酸序列包含选自于由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101和SEQIDNO:102构成的组的序列。

46.根据权利要求43所述的方法，其中所述多核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SPIKE的多核苷酸序列。

47.权利要求43的方法，其中所述转基因植物选自于由水稻、小麦、高粱和玉米构成的组。

48.权利要求47的转基因植物，其中所述转基因植物为水稻植物。

49.一种提高谷物草的谷物产量的方法，包括：

a)使第一种类的谷物草的植物与第二种类的谷物草杂交，其中所述第一种类包含包括对应于基因SPIKE的多核苷酸序列的染色体DNA，其中所述第二种类不包含包括对应于基因SPIKE的多核苷酸序列的染色体DNA，其中所述对应于基因SPIKE的多核苷酸序列包含选自于由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101和SEQIDNO:102构成的组中的序列；

b)选择一种或多种具有染色体DNA的子代植物，所述染色体DNA包括对应于基因SPIKE的多核苷酸序列；

c)回交所选择的子代植物以产生回交子代植物；

d)选择一种或多种具有染色体DNA的回交子代植物，所述染色体DNA包括对应于基因SPIKE的多核苷酸序列；

e)重复步骤c)和d)一次或多次以产生第三代或更高代的具有染色体DNA和所述第二种类的谷物草在与所述第一种类的谷物草杂交之前的所有生理和形态特征的回交子代植物，所述染色体DNA包括对应于基因SPIKE的多核苷酸序列。

50.权利要求49的方法，其中所述谷物草选自于由水稻、小麦、高粱和玉米构成的组。

51.权利要求49的方法，其中所述谷物草是水稻。

52.权利要求49的方法，其中所述第一种类的谷物草选自于来源于新株型(NPT)品种YP9的水稻植物的等基因系。

53.根据权利要求49所述的方法，其中所述第一种类的谷物草选自于水稻亚种热带粳稻。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述第一种类的谷物草是Daringan。

55.根据权利要求49所述的方法，其中所述第二种类的谷物草选自于水稻亚种籼稻。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述第二种类的谷物草选自于由PSBRc18、Ciherang、TDK1、BR11和Swarna构成的组。

57.根据权利要求49所述的方法，其中所述对应于基因SPIKE的多核苷酸序列的检测是使用遗传标记来进行的。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述对应于基因SPIKE的多核苷酸序列的检测包括：检测选自于由RM5503、RM3423和Ind4构成的组中的第一上游分子标记以及选自于由RM6909、AGT3、RM17487、RM17486和Ind12构成的组中的第二下游分子标记。

59.根据权利要求57所述的方法，其中所述对应于基因SPIKE的多核苷酸序列的检测包括：检测选自于由RM3423和Ind4构成的组中的第一上游分子标记和选自于由AGT3、RM17487、RM17486和Ind12构成的组中的第二下游分子标记，其中所述第一上游分子标记和第二下游分子标记是使用表1中列示的相应的正向引物和反向引物来检测的。

60.根据权利要求57所述的方法，其中所述对应于基因SPIKE的多核苷酸序列的检测包括：检测约105个碱基对的第一分子标记Ind2和约252个碱基对的第二分子标记RM17487。

61.根据权利要求57所述的方法，其中所述对应于基因SPIKE的多核苷酸序列的检测包括：检测约105个碱基对的第一分子标记Ind2(正向引物：ACAAGAAGCCGGGAAACCTA(SEQIDNO:27)；反向引物：CTCCTCCGGTCCTCCTTAAC(SEQIDNO:28)以及约252个碱基对的第二分子标记RM17487(正向引物：CGGAGCATGTGGAGAGGAACTCG(SEQIDNO:55)；反向引物：GGAGAGGGCAAGGGCTTCTTCG(SEQIDNO:56)。

62.一种栽培谷物草植物的方法，包括栽培权利要求40的种子。

63.一种栽培谷物草植物的方法，包括栽培权利要求41的植物部分。