CN104871965B - 一种利用野生稻同时培育粳稻和籼稻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用野生稻同时培育粳稻和籼稻的方法。该方法包括亲本杂交、胚挽救、回交、自交和粳籼稻鉴定，其中：亲本杂交是以元江普通野生稻作为父本，粳稻为母本，以死亡的粳稻花药与元江普通野生稻花粉按1:1的质量比混合得的混合花粉授粉；胚培养基为：改良MS+琼脂粉8g/L+蔗糖10g/L，pH5.8‑6.0。本发明大大提高了杂交成功率，将杂交获得的幼胚进行胚挽救，使栽培稻与野生稻远缘杂交成功率从0‑3％提高到60％‑70％，各步骤的协同作用，同时获得了粳型稻和籼型稻，其方法简单易行，为培育地方特有粳稻新品系和籼稻新品系提供了新的方法和技术支持。

Description

一种利用野生稻同时培育粳稻和籼稻的方法

技术领域

本发明涉及粳稻和籼稻育种的方法，特别是一种利用野生稻作为亲本同时培育粳稻和籼稻的方法，属于农作物育种技术领域。

背景技术

水稻是世界半数以上人口的主食作物，栽培种即全世界广泛栽培的亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)和仅局限于西非的非洲栽培稻(Oryza glaberrima steud.)，在我国，栽培稻种为亚洲栽培稻，种下分为两个亚种即籼稻(Oryza sativa L.ssp.indica)和粳稻(Oryza sativaL.ssp.japonica)。我国在水稻栽培上是一个粳籼并重的国家，早在两千年前就已认识到有粳籼两亚种的存在，并在漫长的历史过程中形成了南籼北粳的布局(程侃声，亚洲栽培稻籼粳亚种的鉴别，昆明：云南科技出版社，1993，1-33)。这两个亚种都有很重要的种植生产意义。不断培育新的籼稻或粳稻新品种，才能满足生产需要。

针对粳稻和籼稻新品系的培育，相关研究学者提出了新的培育方法。徐海等，2012年在《沈阳农业大学学报》的《栽培稻的粳籼分化与杂交育种研究进展》中阐述了，目前粳籼稻培育的比较广泛应用的技术—粳籼稻亚种间杂交优势利用技术，但籼粳稻杂交育成品种、亚种特征性状基本上没有变化，杂交后代出现明显的两极分化。邓启云和袁隆平，2010年在《第1届中国杂交水稻大会论文集》的《利用野生稻高产基因培育超级杂交稻研究》中表明了，通过分子技术手段转移野生稻中有利性状基因创新水稻新品质是水稻遗传育种领域的研究热点。稻种家们利用野生稻中的不少有益基因转移到栽培品种中，成功地获得了一些水稻新品系。但该技术还处于野生稻的部分基因应用阶段，未形成系统性的水稻新品系培育技术，育种效率还不够理想。迄今为止，尚未见到将该技术应用于同时培育粳籼稻新品种的报道。

发明内容

鉴于该技术的现状，本发明提供了一种利用野生稻同时培育粳稻和籼稻新品种的方法，旨在为栽培稻新品种培育提供一种新的技术平台。该方法是采用元江普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)与粳稻的亲本组合，获得性状稳定的粳稻新品系和籼稻新品系。

本发明的技术方案是：

一种利用野生稻同时培育粳稻和籼稻的方法，包括亲本杂交、胚挽救、回交、自交和粳籼稻鉴定，具体步骤如下：

(1)亲本杂交：元江普通野生稻作为父本，粳稻为母本，分期对粳稻进行播种，以调节粳稻的花期与元江普通野生稻的花期相遇；在粳稻和元江普通野生稻同时处于开花期时，于早晨7点-11点，剪去粳稻颖壳1/3，再用镊子挑出粳稻的花药，放置50min-70min，待挑出的粳稻的花药死亡后收集元江普通野生稻花粉，将死亡的粳稻花药与元江普通野生稻花粉按1:1的质量比混合得混合花粉，再用所述混合花粉对前述已挑出了花药的粳稻母本进行授粉套袋处理,从授粉的第2天起，连续5天，每天对授粉穗喷施浓度为50mg/L的GA₃溶液一次；

(2)胚挽救：在超净台上，将受精10-15天的杂种胚消毒处理后接种于装有胚培养基的透明玻璃培养瓶中，将所述培养瓶置于温度25℃、空气相对湿度70％、光照强度4000Lx的光照恒温培养箱中培养，每天光照时间为12小时；所述胚培养基为：改良MS+琼脂粉8g/L+蔗糖10g/L，pH5.8-6.0；所述改良MS的配方由以下大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成：大量元素为：KNO₃1266mg/L，NH₄NO₃1100mg/L，KH₂PO₄170mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L，CaCl₂·2H₂O 440mg/L，微量元素为：KI 0.83mg/L，H₃BO₃6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O11.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，铁盐为：Na₂·EDTA37.3mg/L，FeSO₄·7H₂O27.8mg/L，有机成分为：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L；待杂种胚长成三叶期生根小苗时，从培养瓶中取出小苗用自来水冲洗去除琼脂，放到试管中，加入自来水，自来水淹没小苗根部，进行炼苗处理，所述炼苗处理是：试管口用透明保鲜膜封住，放入温度为25℃、空气相对湿度为70％、光照强度为4000Lx的培养室中培养，每天光照时间为12小时，同时从炼苗处理的第一天至第五天，每天用大头针在封口的保鲜膜膜上刺出10-15个小孔，第六天将小苗移栽到盛有土壤的培养钵，在温室按常规温室水稻栽培进行管理，获得F₁植株，

(3)回交：将F₁代与步骤(1)所述的粳稻进行2次回交，得到BC₂F₁；

(4)自交：将得到的BC₂F₁植株进行自交16次，每次自交都进行套袋，得到BC₂F₁₇高代稳定材料；

(5)粳籼稻鉴定：将BC₂F₁₇高代稳定材料种植在海拔1200m的粳籼交错区，田间观察记录，按照程侃声的程氏指数法鉴定供试材料的籼型和粳型类型及其数量。

所述粳稻为粳稻合系35。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明在杂交技术上进行了创新，即将自然死亡的母本花粉与野生稻花粉混合，使母本花粉上的识别蛋白仍然能够诱导母本的柱头接受野生稻的花粉，同时结合GA₃的使用，从而成功受精。将杂交获得的幼胚进行胚挽救，使栽培稻与野生稻远缘杂交成功率从0-3％提高到60％-70％，各步骤的协同作用，同时获得了粳型稻和籼型稻，其方法简单易行，为培育地方特有粳稻新品系和籼稻新品系提供了新的方法和技术支持。

本发明方法还在胚挽救进行了改进，提高了野生稻与栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率。本发明通过大量试验，所使用的改良MS，主要降低了现有MS培养基中的KNO₃、NH₄NO₃、KH₂PO₄和MnSO₄·4H₂O浓度，同时不加CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)和盐酸硫胺素(维生素B1)，更适宜幼胚的营养生长，并且由蔗糖适当提供一些C源，后期主要靠其自身光合作用提供C源能量，而又避免传统的MS培养基的营养物质浓度过高使苗徒长或者污染严重。

本发明在胚挽救生长的幼苗炼苗技术也进行了创新。植株炼苗时，连续5天每天用大头针在封口膜上刺出10-15个小孔，促使幼苗逐步适应外界环境，从而大大提高了幼苗的成活率，其操作方便，效果好。

具体实施方式

以下实施例用于对本发明作进一步说明，各实施例中无特殊说明为常规方法。

试验材料：元江普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)直接来源和原始来源于中国云南省，原始来源时间和直接来源时间均为2005年4月(采集方式)。元江普通野生稻被许多专家认为是最原始的普通野生稻类型之一，并且已开始了粳籼的分化。具有许多优良遗传特性，是改良栽培稻的优良物种。粳稻合系35号(市售)是云南省农业科学院育成的一个高产抗寒冷抗稻瘟病的品种，曾经在云南和周边适宜地区大面积推广应用，粳稻合系35可通过云南大天种业有限公司购买得到，云南大天种业有限公司通讯地址：云南省曲靖市罗平县罗雄镇云贵路，邮编：655000。

(1)亲本杂交：以元江普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)为父本；以粳稻合系35号为母本。从5月到7月分期对粳稻合系35进行播种，每隔15天将粳稻合系35播种1次，每次播种30粒，以调节粳稻合系35的花期与元江普通野生稻的花期相遇，在粳稻合系35和元江普通野生稻同时处于开花期时，于早晨7点，选取5株粳稻合系35，用剪刀剪去粳稻合系35颖壳1/3，再用镊子挑出粳稻合系35的花药，放置50min-70min，待挑出的粳稻合系35的花药死亡后收集元江普通野生稻花粉，将死亡的粳稻合系35花药与元江普通野生稻花粉按1:1的质量比混合得混合花粉，再用混合好的花粉对前述已挑出花药的粳稻合系35母本进行授粉套袋处理。从授粉的第2天起，连续5天，每天对授粉穗喷施浓度为50mg/L的GA₃溶液一次。

(2)胚挽救：在超净台上，将受精10-15天的杂种胚消毒处理后接种于装有胚培养基的高为10.5cm，直径为6.5cm的透明玻璃培养瓶中，将所述培养瓶置于温度25℃、空气相对湿度70％、光照强度4000Lx的光照恒温培养箱中培养，每天光照时间为12小时；所述胚培养基：改良MS+琼脂粉8g/L+蔗糖10g/L，pH5.8-6.0；所述改良MS的配方由以下大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成：大量元素为：KNO₃1266mg/L，NH₄NO₃1100mg/L，KH₂PO₄170mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L，CaCl₂·2H₂O 440mg/L，微量元素为：KI 0.83mg/L，H₃BO₃6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 11.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，铁盐为：Na₂·EDTA37.3mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，有机成分为：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L；待杂种胚长成三叶期生根小苗时，从培养瓶中取出小苗用自来水冲洗去除琼脂，放到直径为3cm，高为20cm的大试管中，加入自来水，自来水仅淹没小苗根部，进行炼苗处理，所述炼苗处理是：试管口用透明保鲜膜封住，放入温度为25℃、空气相对湿度为70％、光照强度为4000Lx的培养室中培养，每天光照时间为12小时，同时从炼苗处理的第一天至第五天，每天用大头针在封口的保鲜膜膜上刺出10-15个小孔，第六天将小苗移栽到盛有土壤的培养钵，在温室按常规温室水稻栽培进行管理，获得F₁植株，所述胚培养基的配方按常规方法配制。所述消毒处理为：将杂种胚用体积分数为65％酒精处理30秒，再用质量分数为0.2％的升汞溶液消毒处理10分钟，然后用无菌水清洗6-7次，之后把种子放在灭菌吸水纸上于超净台上风干。

(3)回交：将50株F₁代与粳稻合系35进行2次回交，得到50株BC₂F₁。

(4)自交：将得到的50株BC₂F₁植株，进行自交16次，每次自交都进行套袋，自交群体不断扩大，最终获得4000份BC₂F₁₇高代稳定材料。

(5)粳籼稻鉴定：随机选取338份BC₂F₁₇高代稳定材料种植在海拔1200m的粳籼交错区，田间观察记录，按照程侃声的程氏指数法，对供试材料分别每份调查5株，鉴定籼型和粳型材料及其数量。其中粳型占33.7％，籼型占54.4％，籼—粳型为11.8％。这些籼型新品系、粳型新品系可以直接选育为籼稻新品种、粳稻新品种。表1为338份材料粳籼型调查情况。所述程侃声的程氏指数法记载在《程侃声.亚洲栽培稻籼粳亚种的鉴别》，云南科技出版社，1993年出版，第6-7页。

表1 338份BC₂F₁₇材料粳籼型调查情况

通过上述方法，我们从这些籼、粳新品系中，分别选取2份材料，41号和42号，进行推广应用，这两份材料在生产上发挥了很好的增产增收作用。其中41号在2012年和2013年短短2年时间推广应用面积就达到30万亩，产量达到3.5亿公斤，新增社会经济效益7200万元(30万亩×240元/亩)，42号在2012年和2013年期间推广应用面积10万亩，产量达到570万公斤，新增社会经济效益2400万元(10万亩×240元/亩)，因此本发明的应用成效显著。

Claims (2)

1.一种利用野生稻同时培育粳稻和籼稻的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)亲本杂交：元江普通野生稻作为父本，粳稻为母本，分期对粳稻进行播种，以调节粳稻的花期与元江普通野生稻的花期相遇；在粳稻和元江普通野生稻同时处于开花期时，于早晨7点-11点，剪去粳稻颖壳1/3，再用镊子挑出粳稻的花药，待挑出的粳稻的花药死亡后收集元江普通野生稻花粉，将死亡的粳稻花药与元江普通野生稻花粉按1:1的质量比混合得混合花粉，再用所述混合花粉对前述已挑出了花药的粳稻母本进行授粉套袋处理,从授粉的第2天起，连续5天，每天对授粉穗喷施浓度为50mg/L的GA₃溶液一次；

(2)胚挽救：在超净台上，将受精10-15天的杂种胚消毒处理后接种于装有胚培养基的透明玻璃培养瓶中，将所述培养瓶置于温度25℃、空气相对湿度70％、光照强度4000Lx的光照恒温培养箱中培养，每天光照时间为12小时；所述胚培养基为：改良MS+琼脂粉8g/L+蔗糖10g/L，pH5.8-6.0；所述改良MS的配方由以下大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成：大量元素为：KNO₃ 1266mg/L，NH₄NO₃ 1100mg/L，KH₂PO₄ 170mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L，CaCl₂·2H₂O 440mg/L，微量元素为：KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 11.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，铁盐为：Na₂·EDTA 37.3mg/L，FeSO₄·7H₂O27.8mg/L，有机成分为：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L；待杂种胚长成三叶期生根小苗时，从培养瓶中取出小苗用自来水冲洗去除琼脂，放到试管中，加入自来水，自来水淹没小苗根部，进行炼苗处理，所述炼苗处理是：试管口用透明保鲜膜封住，放入温度为25℃、空气相对湿度为70％、光照强度为4000Lx的培养室中培养，每天光照时间为12小时，同时从炼苗处理的第一天至第五天，每天用大头针在封口的保鲜膜膜上刺出10-15个小孔，第六天将小苗移栽到盛有土壤的培养钵，在温室按常规温室水稻栽培进行管理，获得F₁植株，

(3)回交：将F₁代与步骤(1)所述的粳稻进行2次回交，得到BC₂F₁；

(4)自交：将得到的BC₂F₁植株进行自交16次，每次自交都进行套袋，得到BC₂F₁₇高代稳定材料；

(5)粳籼稻鉴定：将BC₂F₁₇高代稳定材料种植在海拔1200m的粳籼交错区，田间观察记录，按照程侃声的程氏指数法鉴定供试材料的籼型和粳型类型及其数量。

2.根据权利要求1所述的一种利用野生稻同时培育粳稻和籼稻的方法，其特征在于：步骤(1)所述粳稻为粳稻合系35。