CN100348090C - 一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法,包括①冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养;②以冬枣茎尖生长点和叶片为处理材料,用秋水仙素处理进行染色体加倍;③小苗生根和移栽;④四倍体植株的嫁接;⑤四倍体植株的特征和应用等步骤。本发明以细胞分裂旺盛的茎尖和叶片为处理材料,能有效地克服基因型制约,获得同质多倍体植株的效率高,对具有重要经济价值的枣的遗传改良有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法,属于农业生物技术领域或植物细胞工程领域。
背景技术
我国是枣树的起源地和栽培中心,种质资源非常丰富。冬枣(Ziziphus juj uba Mill。)是鼠李科枣属植物,因果实成熟在寒露节后而得名。冬枣风味独特,产量高,是品质优良的一个鲜食栽培品种,在果树生产、贸易上具有重要的经济价值。沾化冬枣是冬枣中鲜食品质最好的品种之一,主产子山东省渤海湾地区,适合在中低度盐地生长,经济价值很高。然而,沾化冬枣存在果实偏小、果核大、果皮薄及耐贮性差等缺点,而且农户为追求产量,使用激素处理增大果实,极大的降低了沾化冬枣的优良品质。由于冬枣花小,雌雄蕊分离困难,落花落果严重,胚容易退化,到目前为止,冬枣育种工作基本上停留在田间品种选优,周期长和效率低下。
多倍化是植物进化变异的自然现象,也是促进植物发生进化改变的重要力量(杨继,2001)。被子植物中,约70%的种类在进化过程中发生过一次或多次多倍化(Masterson,1994),这表明多倍化可以增强植物的适应性和竞争力。多倍体植株在形态上多表现营养器官和生殖器官的巨大性,适应性、抗逆性较强,此外次生代谢产物也因倍性变化而产生变化。对以收获营养器官为目的的果树来说多倍体果实在果实大小、品质、环境的适应性及抗逆性方面具有更大的优势,而且还可能表现无核或少核的优异性状,在生产和育种上具有重要经济价值(Stanford,1983)。二倍体玫瑰香葡萄利用秋水仙素得到的四倍体植株,不仅保持了二倍体的优良品种,而且增强了抗逆性,果实也显著增大,获得了极好的经济性状(罗耀武,1995)。秋水仙素诱导的同源四倍体金柑表现大果、无或少核的多倍体性状(李传生和张美珍,1988)。
有性多倍化是多倍体形成的主要路线,2n配子在多倍性形成中起着极其重要的作用。对于不能产生2n配子或仅能产生SDR(second division restitution)或PMD(Post-meitotic doubling)型配子的作物,体细胞染色体加倍是进行多倍化的理想途径(Stanford,1983)。前人研究认为适合染色体加倍的作物应具备染色体数目少、收获营养体为主、异花授粉及多年生和营养繁殖的特性(Dewey,1981)。自1937年Blakeslee和Avery利用秋水仙素诱导曼陀罗四倍体植株获得成功以后,秋水仙素在果树多倍体诱导方面的得到广泛应用,用来改良果实性状或诱导杂交亲本(Preieri,2001)。沾化冬枣多倍体诱导技术难度较大,主要是由于目前冬枣的组培体系效率较低,植株在培养基上生长缓慢。目前关于冬枣的离体培养体系报道较少,王玉珍(1999)和徐华陵(2003)以冬枣的茎尖和茎段为外植体培养,获得了再生植株,但繁殖效率不高。陈宗礼等(2002)以沾化冬枣叶片为外植体,诱导愈伤组织的产生,但愈伤组织分化率仅为40%。
枣利用秋水仙素处理进行染色体加倍的研究报道较少,严仁玲等(1996)用不同浓度的秋水仙素处理金丝小枣试管苗单芽茎段,促使不定芽染色体加倍,获得了同源四倍体株系。蒋洪恩等(2004)以冬枣、临猗梨枣和辣椒枣一年生嫁接苗为试材,以秋水仙碱为诱变剂诱导多倍体,但仅在临猗梨枣中获得一株纯化的四倍体植株。
目前报道获得的四倍体枣为金丝小枣和临猗梨枣,是与冬枣基因型完全不同的栽培品种,而且在所用处理材料类型、秋水仙素处理程序,培养基种类以及激素方面都有显著差异。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明要解决的问题是,以冬枣茎尖和叶片为处理材料,利用离体培养体系,用秋水仙素诱导染色体加倍手段,建立一种冬枣多倍体诱导体系的方法,以选择获得同质四倍体植株。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法,包括①冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养;②以冬枣茎尖生长点和叶片为处理材料,用秋水仙素处理进行染色体加倍;③小苗生根和移栽;④四倍体植株的嫁接;⑤四倍体植株的特征和应用;其中,所述的冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养是指:将茎尖转入茎延伸培养基生长,将叶片转入叶片诱导丛生芽培养基生长;所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法是:将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片,放于含有质量体积百分比为0.01%-0.2%的秋水仙素的MS液体培养基中,在25℃±2℃黑暗条件下,100rmp摇动24-72小时,之后,无菌水冲洗2-3次,茎尖转入茎延伸培养基中培养,叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养,30-35天继代一次;所述小苗生根和移栽方法是指:将秋水仙素处理诱导后的四倍体冬枣组织培养苗,接种在生根培养基中,进行生根;当根长2cm-3cm时,移入砂∶蛭石的重量比为1∶1的基质中,前6-7天盖好封口膜,保持湿度为90%,20℃~25℃环境下,生长15-20天,之后移至室外土壤中生长,其间每2-3天浇一次1/2 MS培养基无机盐溶液,隔天浇水一次。
上述茎延伸培养基是指:添加有1-3mg L-1赤霉素(GA3)、0.1-0.5mg L-1 6-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固体培养基;
上述叶片诱导丛生芽培养基是指:添加有0.5-2mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.3-1mg L-1吲哚乙酸(IAA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基;
上述生根培养基是指:添加有0.1-0.5mg L-1吲哚乙酸(IAA),0.2-1mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基;
在上述培养基中涉及的激素浓度的优选量,因培养材料的基因型不同,可在所述用量范围内变动。
上述MS固体培养基(Murashige and Skoog)的配方是:KNO3 1900mg L-1,NH4NO3 1650mgL-1,CaCl2·2H2O 440mg L-1,MgSO4·7H2O 370mgL-1,KH2PO4·H2O 170mg L-1,FeSO4·7H2O27.8mg L-1,EDTA·Na237.3mg L-1,ZnSO4·7H2O 10mg L-1,MnSO4·4H2O 22.3mg L-1,H3BO310mg L-1,KI 0.83mg L-1,Na2MoO4·2 H2O0.5mg L-1,CuSO4·5H2O0.025mg L-1,CoCl2·6H2O0.025mg L-1,盐酸硫胺素10.0mg L-1,盐酸吡哆醇1.0mg L-1,烟酸1.0mg L-1,甘氨酸2.0mg L-1,肌醇100.0mg L-1,生物素0.05mg L-1,蔗糖30g L-1,琼脂粉6g L-1,pH 6.0;该培养基主要用于冬枣茎尖培养和继代。
上述WPM固体培养基(Woody plant medium)的配方是:NH4NO3 400mg L-1,CaCl2·H2O96mg L-1,Ca(NO3)2 556mg L-1,MgSO4·7H2O 370mgL-1,K2SO49900mg L-1,KH2PO4·H2O 170mgL-1,FeSO4·7H2O 27.8mg L-1,EDTA·Na237.3mg L-1,ZnSO4·7H2O 8.6mg L-1,MnSO4·H2O22.3mg L-1,H3BO3 6.2mg L-1,Na2MoO4·2H2O 0.25mg L-1,CuSO4·5H2O 0.25mg L-1,盐酸硫胺素1.6mg L-1,烟酸0.5mg L-1,肌醇100.0mg L-1,蔗糖30g L-1,琼脂粉6g L-1,pH 6.0;该培养基主要用于冬枣叶片离体培养。
上述Nithsh固体培养基的配方是:KNO3 950mg L-1,NH4NO3 720mg L-1,CaCl2·2H2O166mg L-1,MgSO4·7H2O 185mg L-1,KH2PO4·H2O 68mg L-1,FeSO4·7H2O 27.85mg L-1,EDTA·Na2 37.3mg L-1,ZnSO4·7H2O 10mg L-1,MnSO4·4H2O 25mg L-1,KI 10mg L-1,CoCl2·6H2O 0.025mg L-1,MoO30.25mg L-1,肌醇5000mg L-1,蔗糖30g L-1,琼脂粉6g L-1,pH 6.0;该培养基主要用于栽培苗的生根。
其中,MS液体培养基、WPM液体培养基、Nithsh液体培养基的配方是指:不添加所述的琼脂粉的配方;
上述1/2MS基本培养基无机盐溶液是指:MS液体培养基无机盐成分含量的一半。
本发明中所述培养基及植物生长调节物质均热压灭菌;秋水仙素过滤灭菌,在培养基灭菌后加入。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中,所述冬枣是指鼠李科枣属植物的晚熟栽培枣品种(Zizyphus jujuba Mill)。
上述冬枣优选是沾化冬枣。
上述冬枣因在寒露节后成熟而得名,丰产稳产,适应性强,是鲜食优良枣品种。沾化冬枣是其中鲜食品质最好的品种之一,主产于我省渤海湾地区。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中,所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法优选是:将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片,放于含有质量体积百分比为0.05%-0.1%的秋水仙素的MS液体培养基中,在25℃黑暗条件下,100rmp摇动48-72小时,之后,无菌水冲洗2-3次,茎尖转入茎延伸培养基中培养,叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养,30天继代一次。
上述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法最优选是:将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片,放于含有质量体积百分比为0.1%的秋水仙素的MS液体培养基中,在25℃黑暗条件下,100rmp摇动48小时,之后,无菌水冲洗2-3次,茎尖转入茎延伸培养基中培养,叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养,30天继代一次。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中,所述茎延伸培养基优选是指:添加有1-2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2-0.4mg L-1 6-苄基嘌呤(6-BA)和300mg L-1酪蛋白水解物的MS固体培养基;所述叶片诱导丛生芽培养基是指:添加有1-2mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.5-1mg L-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基;所述生根培养基是指:添加有0.2-0.3mg L-1吲哚乙酸(IAA),0.3-0.6mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基。
上述茎延伸培养基最优选添加有2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2mg L-1 6-苄基嘌呤(6-BA)和300mg L-1酪蛋白水解物的MS固体培养基。
上述叶片诱导丛生芽培养基最优选添加有1.3mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.7mgL-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基。
在上述的秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法中,处理后植株的倍性鉴定采用流式细胞仪测定叶片DNA含量的方式,DNA含量是二倍体植株两倍的即为四倍体植株(见图1)。细胞学观察结果验证了流式细胞仪的分析结果,对照二倍体的沾化冬枣根尖染色体数为2n=2x=24,而四倍体沾化冬枣植株的根尖染色体数目为2n=4x=48(见图2)。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中,所述生根培养基最优选添加有0.2mg L-1吲哚乙酸(IAA),0.3mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中,所述四倍体植株的嫁接方法优选是,选取生长健壮的四倍体组培苗和移栽苗,在5-6月份嫁接在沾化冬枣大树或枣砧木上。处理中,按常规嫁接方式处理砧木和接穗的切口,嫁接口用塑料薄膜缠绕,上部用塑料袋罩住保湿,并注意遮阴。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中,所述四倍体植株的特征表现为植株生长缓慢,茎粗壮,节间较短,叶形变圆,气孔密度和大小均与二倍体植株有显著性差异(见图3)。
利用本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法,以冬枣茎尖生长点和叶片为受体材料,采用秋水仙素处理诱导染色体加倍,建立了多倍体诱导体系,经选择获得同质四倍体植株,将在冬枣生产和育种上起重要作用。冬枣生长点不经脱分化过程直接出芽,具有基因型依赖性小、体细胞无性系变异小等优点,是合适的多倍体诱导材料。
本发明能获得大量的具有很强植株再生能力的组培苗,再生植株体细胞无性系变异小。本发明的特点在于:1)大幅度减少基因型障碍,可诱导绝大多数基因型的冬枣快速产生大量离体茎尖;2)培养的冬枣茎尖生长点分裂旺盛,生长速度快,适于细胞学和分子生物学实验;3)取材不受季节限制;4)可以较高频率的诱导同质多倍体植株。
附图说明
图1冬枣二倍体及四倍体植株的DNA含量
其中:A二倍体植株叶片的DNA含量,B四倍体植株叶片的DNA含量
图2冬枣二倍体及四倍体植株的染色体数目
其中:A二倍体植株根尖染色体数目(2n=2x=24),B四倍体植株叶片的DNA含量测定(2n=4x=48)
图3冬枣二倍体及四倍体植株的气孔密度和大小
其中:A二倍体植株叶片气孔密度和大小;B四倍体植株叶片气孔密度和大小
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明:
实施例1
沾化冬枣茎尖培养
沾化冬枣是鲜食品质最好的冬枣品种之一,主产于我省渤海湾地区。沾化冬枣休眠芽在28℃,70%湿度的恒温培养箱中水培萌发。萌发的幼枝剪成单芽茎段,70%酒精杀菌30s,0.1%的升汞消毒8min,无菌水冲洗3-4次,然后接种在添加1mg L-1 GA3和0.2 mg L-1 6-BA的MS固体培养基上,35天继代一次。组织培养苗10-15天可生长2cm以上,生长点细胞处于旺盛分裂状态。
秋水仙素(Sigma,USA)添加在含有1mg L-1 GA3和0.2mg L-1 BA的MS液体培养基中,终浓度为0.1%。将细胞分裂旺盛的茎尖放于含有0.1%浓度秋水仙素的MS液体培养基中,25℃黑暗条件下,100rmp摇动48h。秋水仙素处理后的茎尖,无菌水冲洗2-3次,转入添加1mg L-1 GA3和0.2mg L-1 6-BA的MS培养基中培养。
上述MS固体培养基(Murashige and Skoog)的配方是:KNO3 1900mg L-1,NH4NO31650mgL-1,CaCl2·2H2O 440mg L-1,MgSO4·7H2O 370mgL-1,KH2PO4·H2O 170mg L-1,FeSO4·7H2O27.8mg L-1,EDTA·Na237.3mg L-1,ZnSO4·7H2O 10mg L-1,MnSO4·4H2O 22.3mg L-1,H3BO310mg L-1,KI 0.83mg L-1,Na2MoO4·2 H2O 0.5mg L-1,CuSO4·5H2O 0.025mg L-1,CoCl2·6H2O0.025mg L-1,盐酸硫胺素10.0mg L-1,盐酸吡哆醇1.0mg L-1,烟酸1.0mg L-1,甘氨酸2.0mg L-1,肌醇100.0mg L-1,生物素0.05mg L-1,蔗糖30g L-1,琼脂粉6g L-1,pH 6.0。
上述Nithsh固体培养基的配方是:KNO3950mg L-1,NH4NO3720mg L-1,CaCl2·2H2O166mg L-1,MgSO4·7H2O 185mg L-1,KH2PO4·H2O 68mg L-1,FeSO4·7H2O 27.85mg L-1,EDTA·Na237.3mg L-1,ZnSO4·7H2O 10mg L-1,MnSO4·4H2O 25mg L-1,KI 10mg L-1,CoCl2·6H2O 0.025mg L-1,MoO30.25mg L-1,肌醇5000mg L-1,蔗糖30g L-1,琼脂粉6g L-1,pH 6.0。
处理植株的倍性鉴定
秋水仙素处理茎尖通过流式细胞仪测定叶片DNA含量,四倍体植株的DNA含量是二倍体植株的两倍(见图1)。细胞学观察结果验证了流式细胞仪的分析结果,对照二倍体的沾化冬枣根尖染色体数为2n=2x=24,而四倍体沾化冬枣植株的根尖染色体数目为2n=4x=48(见图2)。
四倍体植株的生根和移栽
对诱导的四倍体沾化冬枣组培苗接种在添加0.2mg L-1IAA和0.3mg L-1IBA的生根培养基中,进行生根。当根长2-3cm时,移入砂与蛭石1∶1的基质中,开始一周盖好封口膜,保持湿度在90%,温度为25℃。温室环境下生长15-16天后移至土壤中,每2-3天浇一次1/2 MS培养基无机盐溶液,隔天浇水一次。
四倍体植株的嫁接
选取生长健壮的四倍体组培苗和移栽苗,在5-6月份嫁接在树龄10-15的沾化冬枣大树或枣砧木上,按常规嫁接方式处理砧木和接穗的切口,嫁接口用塑料薄膜缠绕,上部用塑料袋罩住保湿,并注意遮阴。
四倍体植株特征和应用
四倍体植株生长缓慢,茎粗壮,节间较短,叶形变圆,二倍体与四倍体植株的气孔密度和大小均有显著性差异(见图3)。
实施例2
具体方法如实施例1,其中,茎延伸培养基激素浓度为1.5mg L-1 GA3和0.3mg L-16-BA,秋水仙素浓度为0.1%,处理时间为72小时,诱导获得了同质四倍体植株,生根培养基激素浓度为0.3mg L-1 IAA和0.4mg L-1 IBA。
实施例3
具体方法如实施例1,其中,茎延伸培养基激素浓度为2mg L-1 GA3和0.4mg L-1 6-BA,秋水仙素浓度为0.1%,处理时间为48小时,诱导获得了同质四倍体植株,生根培养基激素浓度为0.3mg L-1 IAA和0.6mg L-1 IBA。
实施例4
具体方法如实施例1,茎延伸培养基激素浓度为1.5mg L-1 GA3和0.3mg L-1 6-BA,秋水仙素浓度为0.1%,处理时间为24h,诱导获得了同质四倍体植株,生根培养基激素浓度为0.3mg L-1 IAA和0.4mg L-1 IBA。
实施例5
具体方法如实施例1,其中,所处理材料为冬枣叶片,叶片WPM培养基激素浓度为1.3mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.7mg L-1吲哚乙酸(IAA)。秋水仙素浓度为0.1%,处理时间为24小时,诱导获得了同质四倍体植株,生根培养基激素浓度为0.3mg L-1 IAA和0.4mg L-1 IBA。
上述WPM固体培养基(Woody plant medium)的配方是:NH4NO3 400mg L-1,CaCl2·H2O96mg L-1,Ca(NO3)2 556mg L-1,MgSO4·7H2O 370mgL-1,K2SO49900mg L-1,KH2PO4·H2O 170mgL-1,FeSO4·7H2O 27.8mg L-1,EDTA·Na237.3mg L-1,ZnSO4·7H2O 8.6mg L-1,MnSO4·H2O22.3mg L-1,H3BO3 6.2mg L-1,Na2MoO4·2H2O 0.25mg L-1,CuSO4·5H2O O.25mg L-1,盐酸硫胺素1.6mg L-1,烟酸0.5mg L-1,肌醇100.0mg L-1,蔗糖30g L-1,琼脂粉6g L-1,pH 6.0。
Claims (8)
1.一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法,包括①冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养;②以冬枣茎尖生长点和叶片为处理材料,用秋水仙素处理进行染色体加倍;③小苗生根和移栽;④四倍体植株的嫁接;其特征在于:所述的冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养是指:将茎尖转入茎延伸培养基生长,将叶片转入叶片诱导丛生芽培养基生长;所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法是:将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片,放于含有质量体积百分比为0.01%-0.2%的秋水仙素的MS液体培养基中,在25℃±2℃黑暗条件下,100rmp摇动24-72小时,之后,无菌水冲洗2-3次,茎尖转入茎延伸培养基中培养,叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养,30-35天继代一次;所述小苗生根和移栽方法是指:将秋水仙素处理诱导后的四倍体冬枣组织培养苗,接种在生根培养基中,进行生根;当根长2-3cm时,移入砂∶蛭石的重量比为1∶1的基质中,前6-7天盖好封口膜,保持湿度为90%,20℃~25℃环境下,生长15-20天,之后移至室外土壤中生长,其间每2-3天浇一次1/2MS培养基无机盐溶液,隔天浇水一次;
上述茎延伸培养基是指:添加有1-3mgL-1赤霉素、0.1-0.5mgL-16-苄基嘌呤和100-500mgL-1酪蛋白水解物的MS固体培养基;
上述叶片诱导丛生芽培养基是指:添加有0.5-2mgL-1噻二唑苯基脲、0.3-1mgL-1吲哚乙酸和100-500mgL-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基;
上述生根培养基是指:添加有0.1-0.5mgL-1吲哚乙酸,0.2-1mgL-1吲哚丁酸的Nitsh固体培养基;
上述MS固体培养基的配方是:KNO31900mgL-1,NH4NO31650mgL-1,CaCl2·2H2O440mgL-1,MgSO4·7H2O370mgL-1,KH2PO4·H2O170mgL-1,FeSO4·7H2O27.8mgL-1,EDTA·Na237.3mgL-1,ZnSO4·7H2O10mgL-1,MnSO4·4H2O22.3mgL-1,H3BO310mgL-1,KI0.83mgL-1,Na2MoO4·2H2O0.5mgL-1,CuSO4·5H2O0.025mgL-1,CoCl2·6H2O0.025mgL-1,盐酸硫胺素10.0mgL-1,盐酸吡哆醇1.0mgL-1,烟酸1.0mgL-1,甘氨酸2.0mgL-1,肌醇100.0mgL-1,生物素0.05mgL-1,蔗糖30gL-1,琼脂粉6gL-1,pH6.0;
上述WPM固体培养基的配方是:NH4NO3400mgL-1,CaCl2·H2O96mgL-1,Ca(NO3)2556mgL-1,MgSO4·7H2O370mgL-1,K2SO49900mgL-1,KH2PO4·H2O170mgL-1,FeSO4·7H2O27.8mgL-1,EDTA·Na237.3mgL-1,ZnSO4·7H2O8.6mgL-1,MnSO4·H2O22.3mgL-1,H3BO36.2mgL-1,Na2MoO4·2H2O0.25mgL-1,CuSO4·5H2O0.25mgL-1,盐酸硫胺素1.6mgL-1,烟酸0.5mgL-1,肌醇100.0mgL-1,蔗糖30gL-1,琼脂粉6gL-1,pH6.0;
上述Nithsh固体培养基的配方是:KNO3950mgL-1,NH4NO3720mgL-1,CaCl2·2H2O166mgL-1,MgSO4·7H2O185mgL-1,KH2PO4·H2O68mgL-1,FeSO4·7H2O27.85mgL-1,EDTA·Na237.3mgL-1,ZnSO4·7H2O10mgL-1,MnSO4·4H2O25mgL-1,KI10mgL-1,CoCl2·6H2O0.025mgL-1,MoO30.25mgL-1,肌醇5000mgL-1,蔗糖30gL-1,琼脂粉6gL-1,pH6.0;
其中,MS液体培养基、WPM液体培养基、Nithsh液体培养基的配方是指:不添加所述的琼脂粉的配方;
上述1/2MS培养基无机盐溶液是指:MS液体培养基无机盐成分含量的一半。
2.按照权利要求1所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法,其特征在于:所述冬枣是指鼠李科枣属植物晚熟的栽培品种,拉丁文学名为Zizyphus jujuba Mill。
3.按照权利要求2所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法,其特征在于:所述冬枣是沾化冬枣。
4.按照权利要求1所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法,其特征在于:所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法是:将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片,放于含有质量体积百分比为0.05-0.1%的秋水仙素的MS液体培养基中,在25℃黑暗条件下,100rmp摇动48-72小时,之后,无菌水冲洗2-3次,茎尖转入茎延伸培养基中培养,叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养,30天继代一次。
5.按照权利要求4所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法,其特征在于:所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法是:将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片,放于含有质量体积百分比为0.1%的秋水仙素的MS液体培养基中,在25℃黑暗条件下,100rmp摇动48小时,之后,无菌水冲洗2-3次,茎尖转入茎延伸培养基中培养,叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养,30天继代一次。
6.按照权利要求1、4或5所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法,其特征在于:所述茎延伸培养基是指:添加有1-2mgL-1赤霉素、0.2-0.4mgL-1 6-苄基嘌呤和300mgL-1酪蛋白水解物的MS固体培养基;所述叶片诱导丛生芽培养基是指:添加有1-2mgL-1噻二唑苯基脲、0.5-1mgL-1吲哚乙酸和300mgL-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基;所述生根培养基是指:添加有0.2-0.3mgL-1吲哚乙酸,0.3-0.6mgL-1吲哚丁酸的Nitsh固体培养基。
7.按照权利要求6所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法,其特征在于:所述茎延伸培养基是指:添加有2mgL-1赤霉素、0.2mgL-16-苄基嘌呤和300mgL-1酪蛋白水解物的MS固体培养基;所述叶片诱导丛生芽培养基是指:添加有1.3mgL-1噻二唑苯基脲、0.7mgL-1吲哚乙酸和300mgL-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基;所述生根培养基是指:添加有0.2mgL-1吲哚乙酸,0.3mgL-1吲哚丁酸的Nitsh固体培养基。
8.按照权利要求1所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法,其特征在于:所述四倍体植株的嫁接方法是,选取生长健壮的四倍体组培苗和移栽苗,在5-6月份嫁接在沾化冬枣大树或枣砧木上。
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