CN102090328B

CN102090328B - 樱桃砧木组织培养基及培养基的改进方法

Info

Publication number: CN102090328B
Application number: CN2010105286914A
Authority: CN
Inventors: 江文; 肖宝祥; 罗飞; 杨扬
Original assignee: Tianjin Cherry Valley Agricultural Science & Technology Development Co Ltd
Current assignee: Tianjin Cherry Valley Agricultural Science & Technology Development Co Ltd
Priority date: 2010-11-03
Filing date: 2010-11-03
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-11-03
Also published as: CN102090328A

Abstract

本发明公开了一种樱桃砧木组织培养基，它是由优化MS基础母液2-60ml/L；蔗糖2545g/L；琼脂6.5-7.0g/L；6-苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L；吲哚丁酸0.1-0.3mg/L；VC0.061-0.067mg/L；吲哚乙酸0.05-1.00mg/L；活性炭1000-1200mg/L组成，该培养基特别适合于樱桃矮化砧木的芽生长培养和壮苗培养以及诱导生根培养，增殖和生根效果好，使樱桃矮化砧木生根率达95--98％，而且根系粗壮整齐，同时组培苗生长健壮，叶色浓绿，有效地节约了人力和物力，移栽成活率可达95％，为大规模生产奠定了基础。本发明的组培方法具有简便易行、简化了程序、提高了工效、降低了成本等优点，解决了组织培养过程中存在褐变、玻璃化等问题，可用于吉塞拉甜樱桃矮化砧木规模化生产的快速繁殖。

Description

樱桃砧木组织培养基及培养基的改进方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及通过组织培养技术促进植物再生的方法，更具体的说是樱桃砧木组织培养基及培养基的改进方法。

背景技术

樱桃属于蔷薇科落叶乔木果树，成熟时颜色鲜红，玲珑剔透，味美形娇，树姿优美，富含糖和铁质，营养丰富，是重要的果树和园林绿化树，又具有很高的食用和药用价值，近年来在我国广泛栽培，发展潜力巨大。

目前樱桃的生产中主要采用扦插、压条和分根蘖繁殖，不但繁殖系数低，而且造成品种退化，病虫害传播蔓延。采用组织培养技术可以快速繁殖作物新品种，加快新品种的推广速度，同时植物组织培养培育的组培苗，遗传基因高度一致，生产稳定，苗木品质性能好，能为产业化生产提供优质的苗木。我国植物组织培养的研究从20世纪50年代开始，至今已有六七十年的历史，组织培养的发展进展快速，已有丰硕的研究成果，尤其近10多年来全国各地许多农业科研院所和高校都开展了植物组织培养研究工作，其发展更为迅速，研究范围涉及农作物、观赏植物、园艺作物、经济林木等上千种植物品种，植物茎尖培养脱病毒技术以及离体快繁技术也日趋成熟。但我国植物组织培养中仍然存在很多问题，其中经常出现的主要致命问题如组培苗的污染、褐化、玻璃化以及繁殖系数较低等，很多技术环节至今未能达到理想效果导致不能进行规模化生产，阻碍了我国组培脱毒苗木的规模化生产进程。

植物的组织培养是否成功，在很大程度上取决于培养基选用是否合适。培养基好比土壤，是组织培养中离体材料赖以生存和发展的基地，而选择培养基更应该综合考虑植物组织不同材料以及不同生长阶段，根据植物生长需要配置最适合的培养基。培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他们根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。40年代White培养基用得较多。而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快。

目前，我国主要引进欧美樱桃品种及砧木，主要采用微茎尖技术、组织培养技术繁育具有生长优势的良种果树脱毒种苗，一般采用MS基本培养基，与其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高。MS基本培养基较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响离子间的平衡。MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，它的液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显成功。这种培养基中的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。

吉塞拉甜樱桃矮化砧木是目前在我国非常适用的樱桃砧木，其中吉塞拉5、6号是经实践证明适用于规模化生产的品种。吉塞拉5、6号甜樱桃矮化砧木由德国育成，为酸樱桃(Prunus cerasus)与灰毛叶樱桃(P.canesceus)进行种间杂交培育的三倍体杂种砧木，在西欧、北美应用广泛。该种砧木于1998年由美国引入我国，经过7年的区域试验和观察，发现吉塞拉5、6号与大多数品种亲和良好，具有明显的矮化、丰产、早实性强、抗病、抗盐、耐涝、土壤适应范围广、固地性能好、抗寒、产量高等优点。由于其为无性系砧木，不能采用种子繁殖。采用常规压条及硬枝扦插生根困难，当前，在我国主要采用的是组织培养方法繁育，但吉塞拉甜樱桃矮化砧木在组织培养过程中还存在褐变、玻璃化等致命问题，一再影响生产产量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种樱桃砧木组织培养基我们通过一系列实验及实践操作，对现用樱桃培养基进行了改进，取得了很好的效果。

本发明的另一个目的在于一种樱桃砧木培养基的改进方法。为实现上述目的本发明公开如下的技术方案：

一种用于繁殖樱桃植株的组织培养基，其特征在于它是由初代培养、继代培养、壮苗培养、诱导生根培养四部分培养基组成，其原料组成如下：

优化MS基础母液2-60ML/L；

蔗糖25-45g/L；

琼脂6.5-7.0g/L；

6-苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L；

吲哚丁酸IBA 0.1-0.3mg/L；

V_C 0.061-0.067mg/L；

吲哚乙酸IAA 0.05-1.00mg/；

活性碳1000-1200mg/L；

其中优化MS基础母液是由下述单位：g/L的原料组成

本发明所述的组织培养基包括：初代培养、继代培养、壮苗培养、诱导生根培养其中的各成分如下：

(1)初代培养组成：优化MS基础母液2-60ML/L/L+40g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.6mg/L6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.3mg/L IBA吲哚丁酸+0.067mg/LV_C；

(2)继代培养组成：优化MS基础母液2-60ML/L+42g/L蔗糖+6.8g/L琼脂+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L IBA；

(3)壮苗培养组成：优化MS基础母液2-60ML/L+40g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L IBA；

(4)诱导生根培养组成：优化MS基础母液2-25ML/L+25g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+1.0mg/L IAA吲哚乙酸+0.2mg/L IBA+活性碳1000mg/L。

本发明所述的樱桃植株指的是：吉塞拉甜樱桃矮化砧木芽苗。特别是吉塞拉甜樱桃矮化砧木5号或6号芽苗。

本发明进一步公开了完整樱桃植株的繁殖方法，其特征在于按如下的步骤进行：

(1)初代培养：从田间采集的吉塞拉6号外植体剥离出的叶原基，采用优化MS基础母液2-60ML/L(其中1号20ML/L，2号10ML/L，3号10ML/L，4号5ML/L，5号10ML/L)+40g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.6mg/L6-BA+0.3mg/LIBA+0.067mg/LVC培养；三周后慢慢出现分生侧芽转入继代培养；

(2)继代培养：采用优化MS基础母液2-60ML/L(其中1号20ML/L，2号10ML/L，3号10ML/L，4号5ML/L，5号10ML/L)+42g/L蔗糖+6.8g/L琼脂+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA，在光照强度3000lx，每天持续12小时光照，室内湿度保持70％-80％，进行继代培养。

(3)壮苗培养：采用优化MS基础母液2-60ML/L(其中1号20ML/L，2号10ML/L，3号10ML/L，4号5ML/L，5号10ML/L)+40g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA培养，光照强度3000lx，每天持续12小时光照，室内湿度保持70％-80％进行壮苗培养。

(4)诱导生根培养：采用优化MS基础母液2-25ML/L+25g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+1.0mg/L IAA+0.2mg/L IBA+活性碳1000mg/L，光照强度3000lx，每天持续12小时光照，室内湿度保持70％-80％进行诱导生根培养。(优化MS基础母液2-25ML/L具体为1号8ML/L，2号4ML/L，3号4ML/L，4号2ML/L，5号4ML/L)

(5)过渡移栽：采用常规的方法直接将完成生根炼苗的组培砧木转入装有营养土的穴盘中，保持炼苗大棚温度在15-30摄氏度之间，室内湿度保持50％-80％，根据苗的适应情况，由弱自然光照逐渐加强，逐渐通风，培养40-60天在苗高10-15厘米左右，转入完全通风强自然光照的绿色炼苗阶段，适应4-7天时即可移栽入大田，移栽成活率可达95％以上。

本发明的樱桃砧木培养基所具有的积极效果在于：

(1)采用本发明的优化培养基，将从田间采集的吉塞拉6号外植体剥离出的叶原基，培养基无褐化现象，接种三天后叶原基开始长大，一周后底部产生愈伤组织，茎尖长高，随后愈伤组织变黑，茎尖绿色，三周后慢慢出现分生侧芽即可转入继代培养基培养。而采用同样的方法，使用目前的基础MS培养基培养从田间采集的吉塞拉6号外植体剥离出的叶原基，接种一天培养基褐化严重，同时后来分生缓慢且呈现细长状，叶子颜色呈现色白绿的状况。

(2)本发明采用的继代培养阶段主要要解决褐变及玻璃化问题，除了光照强度、温度、适度、摆放密度等影响因素外，培养基也起着至关重要的作用。特别是适当提高蔗糖、琼脂浓度，杜绝了玻璃苗的情况出现。

(3)很多组培过程都没有壮苗培养培养基培养的过程，单一地加强光照强度或延长光照时间，不仅导致瓶苗褐变严重，瓶苗长势参差不齐，难以控制，最后影响诱导生根阶段出现黄叶、生根率低且根条数少，直接导致存活率低。本发明采用的壮苗培养避免了上述问题的出现，樱桃砧木苗长势好，叶大茎粗壮。

(4)本发明采用的诱导生根培养可使生根率高达95--98％，单株根条数均超过3根，80％达5根以上。

具体实施方式

下面通过最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。以下实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明，其中樱桃砧木枝条由从陕西省良种果树苗木繁育中心购买的当年生樱桃芽苗上采集，其他所用试剂均有市售。

实施例1

一.配制优化培养基母液的具体操作

1号大量元素：制备时，按表中排列的顺序，分别称出并进行溶解，以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到2升。

2号大量元素：按表中量称出并进行溶解，最后加蒸馏水，使其总量达到1升。

3号铁盐：铁盐要单独配制。由硫酸亚铁(FeSO₁·7H₂O)2.78克和乙二胺四乙酸二钠(Na-EDTA)3.73克溶于1升水中配成，配制完成后置于棕色玻璃瓶储存。

4号微量元素：因用量少，为称量精确起见，应使用电子天平逐一称取，逐次溶解并混在一起，制成1L母液。

5号有机物质：使用电子天平逐一称取，逐次溶解并混在一起，制成1L母液。

另外，吲哚乙酸，吲哚丁酸，6-氨基腺嘌呤，分别配成所需的浓度，用时按培养基配方中要求的量分别加入。

配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用1～2毫升0.1N(克当量浓度)氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。配制细胞分裂素时，应先用少量0.5或1N的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量。以上各种混合液(母液)或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。

二.配制培养基的具体操作

①根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。

②将①中称好的琼脂加蒸馏水300～400毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。

③将蔗糖，加入煮好的琼脂中，搅拌均匀，并保持加热煮制20分钟，停止加热，后将①中所取的各种物质加入，加入蒸馏水至1000ML，搅拌均匀，配成培养基。

④用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入③中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8-6.0之间即可，一般由于后期高压灭菌过程会反酸，故将PH调至5.9为合适。

⑤将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶(或试管)中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5，如100ml的三角瓶装培养基至50ml即可。

三.培养基的灭菌与保存

培养基配制完毕后，应立即灭菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内，在汽相121--126℃条件下，灭菌20分钟。经过灭菌的培养基应迅速平放冷却备用，如若批量制备，应置于10℃下保存，在4～5℃低温下保存要更好些。

四.培养方法：

(1)初代培养：从田间采集的吉塞拉6号外植体剥离出的叶原基，采用1份优化MS基础母液2-60ML/L(1份MS基础母液为1号20ML/L，2号10ML/L，3号10ML/L，4号5ML/L，5号10ML/L)+40g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.6mg/L6-BA+0.3mg/LIBA+0.067mg/LVC培养；三周后慢慢出现分生侧芽转入继代培养；

(2)继代培养：采用1份优化MS基础母液2-60ML/L(1号20ML/L，2号10ML/L，3号10ML/L，4号5ML/L，5号10ML/L)+42g/L蔗糖+6.8g/L琼脂+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA，在光照强度3000lx，每天持续12小时光照，室内湿度保持70％-80％进行继代培养。

(3)壮苗培养：采用1份优化MS基础母液2-60ML/L(1号20ML/L，2号10ML/L，3号10ML/L，4号5ML/L，5号10ML/L)+40g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA培养，光照强度3000lx，每天持续12小时光照，室内湿度保持70％-80％，进行壮苗培养。

(4)诱导生根培养：采用2/5份优化MS基础母液2-25ML/L(具体为1号8ML/L，2号4ML/L，3号4ML/L，4号2ML/L，5号4ML/L)+25g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+1.0mg/LIAA+0.2mg/L IBA+活性碳1000mg/L，光照强度3000lx，每天持续12小时光照，室内湿度保持70％-80％。由壮苗培养基转入诱导生根培养基中做生根培养，培养完整樱桃小植株。本发明的培养基使吉塞拉甜樱桃矮化砧木生根率达95-98％，而且根系粗壮整齐，同时组培苗生长健壮，叶色浓绿，有效地节约了人力和物力，移栽成活率可达95％。

实施例2

本发明效果对比：各阶段操作步骤及培养条件均与上述步骤相同，以下表格显示数据仅表示使用的培养基成分不同单一变量条件所致。(光照强度3000lx，每天持续12小时光照，室内湿度保持70％-80％)

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)过渡移栽：采用常规的方法直接将完成生根炼苗的组培砧木转入装有营养土的穴盘中，保持炼苗大棚温度在15-30摄氏度之间，室内湿度保持50％--80％，根据苗的适应情况，由弱自然光照逐渐加强，逐渐通风，培养40-60天在苗高10-15厘米左右，转入完全通风强自然光照的绿色炼苗阶段，适应4-7天时即可移栽入大田，移栽成活率可达95％以上。

Claims

1.一种樱桃砧木组织培养基，其特征在于它是由初代培养、继代培养、壮苗培养、诱导生根培养四部分的培养基组成，其原料组成如下：

优化MS基础母液 2-20ml/L；

蔗糖 25-45g/L；

琼脂 6.5-7.0g/L；

6-苄氨基嘌呤 0.4-0.6mg/L；

吲哚丁酸IBA IBA 0.1-0.3mg/L；

Vc 0.061-0.067mg/L；

吲哚乙酸IAA 0.05-1.00mg/L；

活性炭 1000-1200mg/L；

其中优化MS基础母液是由下述单位：g/L的原料组成

其中樱桃砧木组织培养基的樱桃植株指的是：吉塞拉甜樱桃矮化砧木5号或6号芽苗；所述的初代培养、继代培养、壮苗培养、诱导生根培养基的成分如下：

(1)初代培养组成：优化MS基础母液5-20ml/L+40g/L 蔗糖+6.5g/L 琼脂+0.6mg/L6-BA+0.3mg/L IBA+0.067mg/LVc；

(2)继代培养组成：优化MS基础母液5-20ml/L+42g/L 蔗糖+6.8g/L 琼脂+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L IBA；

(3)壮苗培养组成：优化MS基础母液5-20ml/L+40g/L 蔗糖+6.5g/L 琼脂+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L IBA；

(4)诱导生根培养组成：优化MS基础母液2-8ml/L+25g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+1.0mg/LIAA+0.2mg/L IBA+活性炭1000mg/L。