CN103299909B - 一种樱桃幼苗的组织培养规模化繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种樱桃幼苗的组织培养规模化繁殖方法，包括以下步骤：1)拟接种材料的预处理，2)外植体的消毒，3)无菌系的建立，4)芽的增殖培养，5)壮苗与生根培养，6)试管苗移栽。采用本发明方法进行樱桃幼苗的组织培养快速繁殖，具有外植体污染率低、繁殖系数高、种苗质量好、移栽成活率高等优点，该方法克服常规技术中繁殖系数低、周期长、受季节限制等缺陷。

Description

一种樱桃幼苗的组织培养规模化繁殖方法

技术领域

本发明属植物组织培养技术领域，具体涉及一种樱桃幼苗的组织培养规模化繁殖方法。

背景技术

樱属（Cerasus）植物有120多个种，多数分布在欧洲和亚洲。世界上栽培较多的种有中国樱桃（Prunus pseudoerasus Lindl.）、欧洲甜樱桃（Prunus avium L.）、欧洲酸樱桃（Prunuscerasus L.）和毛樱桃（Prunus tomentosa Thub.）四个种。樱桃具有树体矮化开张、结果早、丰产、抗病性强、适应性广等优良特性，其果实是一种高档水果，营养丰富，甜酸可口，经济价值高。樱桃传统的繁殖方法是根蘖、压条或扦插繁殖，速度慢、幼苗生长不一致，不能满足大面积栽培推广优良品种的需要且常规繁殖方法的种苗在栽培过程中易患根癌病，致使树体衰落及黄化死亡，这是樱桃的致命病害，同样也是我国樱桃矮化密植栽培发展的制约因素。利用组织培养技术进行快速繁殖，生产优质种苗，具有繁殖速度快、稳定性高及消除根癌病等特点，是解决其规模化栽培种苗问题的有效方法。

现有技术有许多关于樱桃组织培养的相关报道，例如，王瑞等以大樱桃矮化砧木吉塞拉6号为实验材料，研究了不同生长调节剂配比对大樱桃茎芽再生形成不定芽的诱导效应。结果表明：(1)大樱桃不定芽的再生存在腋芽再生与基部丛芽再生两种基本方式；(2)当培养基中生长调节剂组配为6-BA(1mg/L)+KT(0.5mg/L)+IBA(0.2mg/L)时，大樱桃茎芽外植体的分化水平达到最高；(3)MS+6-BA(1mg/L)+KT(1mg/L)+IBA(0.3mg/L)是大樱桃不定芽高频再生的最佳培养条件【王瑞等，大樱桃“吉塞拉”试管苗优化培养基的筛选，陕西农业科学，2012(3):37-45】。魏明杰等以甜樱桃品种高砂、顽童和中国樱桃品种莱阳矮樱为材料开展了组培快繁技术研究。结果表明，高砂、顽童和莱阳矮樱3个樱桃品种茎尖组培苗在F14培养基上的增殖系数比MS高，前一处理的增殖系数分别是4.17、3.78和5.0，后一处理分别是3.33、3.22和4.17；以F14+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+GA2.0mg/L对高砂和顽童的茎尖组培苗增殖系数大，以F14+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+GA2.0mg/L对高砂组培苗的增殖系数大，促进节间伸长的效果好；在培养基F14+IBA1.0mg/L上，平均生根率高砂较顽童高；在F14+IBA1.0mg/L上添加活性炭500～1000mg/L时，可有效提高顽童的生根率【魏明杰等，樱桃组培快繁技术研究，落叶果树2012，44(2):09-13】。袁小环等开展了甜樱桃组培苗的生根研究，结果表明：1/2F14为最适基本培养基；液体培养对组培苗的生根有很大的促进作用，根部黑暗条件培养次之,生长素质量浓度配比以IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L效果最好，生根率可达89.7%【袁小环等，甜樱桃组培苗的生根研究，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2004，32(4):71-78】。

俗话说，樱桃好吃，树难载。尽管樱桃的组织培养研究已取得了一定的进展，但还存在着初始培养中培养物容易污染，繁殖系数低，生根困难，移栽存活率低等问题，严重限制了樱桃的规模化繁殖和栽培。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种樱桃幼苗的组织培养规模化繁殖方法，这种方法具有污染率低、繁殖系数高、种苗质量好、移栽成活率高的特点。采用该方法繁育樱桃幼苗，繁殖系数可达5.8，繁殖的幼苗茎叶粗壮、根系发达，移栽存活率达98%。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。

所述的樱桃幼苗的组织培养规模化繁殖方法，以樱桃茎段为外植体建立无菌系，从而进行离体快速繁殖，具体包括如下步骤：

1)接种材料的预处理：于11月中下旬，选择生长健壮、无病虫害的樱桃枝条，摘去自然落叶后残留的叶片，用透明硫酸纸套住枝条顶端20cm～30cm，基部用回形针固定。

2)外植体的准备与消毒：翌年6月，选取新抽生的半木质化的嫩枝，剪去叶片，用洗洁精清洗后，用流水冲洗2～4h，在超净工作台上先用75%v/v的乙醇溶液浸泡消毒，然后用10%v/v的次氯酸钠溶液浸泡消毒，再用无菌水冲洗。

3)无菌系的建立：用无菌吸水纸吸干外植体表面的水份，将嫩枝切成1～2cm长的茎段，每个茎段带1～2个茎节，切除切口处因消毒而坏死的组织，将外植体培养于初始培养基（配方：硝酸铵减半为825mg/L；添加硝酸钙278mg/L的改良的MS培养基+1～2mg/LZT+0.5～1.0mg/L BA+0.1～0.2mg/L NAA+0.5～1.5水解酪蛋白+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH=5.6～5.8）。完成接种后，将培养物置于培养架，不开灯，2周后开灯进行光照培养。光照为12h/d，光照强度为3000lx的条件下培养。培养室温度为24℃±2℃。

4)芽的增殖培养：将得到的无菌系新芽分割后，接种于增殖培养基（配方：硝酸铵减半为825mg/L；添加硝酸钙278mg/L的改良的MS培养基+0.5～1mg/L BA+0.1～0.5mg/LKT+0.1～0.2mg/L NAA+0.001～0.1mg/L TDZ+0.5～1.5g/L水解酪蛋白+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH=5.6-5.8），进行增殖培养；在后续的继代增殖培养过程中，将丛芽基部分割后培养于新鲜的增殖培养基继续进行增殖培养。

5)壮苗与生根培养：将增殖的丛生芽离基部0.6～1.2cm处切成单芽，接种于生根培养基（配方：大量元素减半、微量元素不变的MS培养基+1～2mg/L IBA+0.2～0.5mg/LNAA+0.5～1.0g/L水解酪蛋白+蔗糖20g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH=5.6～5.8），进行诱导生根培养，15～20d可获得樱桃生根试管苗，生根率达98%。

6)试管苗移栽：将试管苗带瓶在常温下炼苗3～5d，然后打开瓶盖继续炼苗2～3天，轻轻取出试管苗，去除其基部培养基后移栽于配比为1:1:1（v/v）的泥炭+椰糠+珍珠岩的基质中，移栽后浇足水，并保持温度为24℃±2℃，空气湿度70～80%。

7)统计成活率：上述试管苗移栽35d后统计成活率。

其中，上述方法中，所述步骤4)、5)进行光照培养，光照为12h/d，光照强度为3000lx的条件下培养。培养室温度为24℃±2℃。

所述步骤5)中，将增殖的丛生芽切成单芽时，保持每个单芽有3～5片叶，切割处离单芽最下面1张叶的基部2mm左右。

有益效果：

1、本发明对拟接种材料进行预处理，阻止了病虫害、灰尘、杂菌的影响，可大大减少病虫害的侵染，外植体经消毒后接种于初始培养基，污染率很低（<1%）。

2、采用本发明方法进行外植体的消毒，避免使用组织培养中常用的消毒剂--氯化汞，简化了消毒方法，还大大降低了消毒液对外植体的影响，且所用消毒剂对人体健康和环境安全危害小。

3、利用本发明方法进行樱桃组织培养快速繁殖种苗，繁殖系数大（5.8），种苗质量好，移栽成活率高（98%），因此可降低种苗繁殖成本，克服传统方法繁殖速度慢，受季节影响大等问题。

如无特殊说明，本发明所述的各术语含义如下：

ZT：玉米素。

BA：6-苄基腺嘌呤。

NAA：萘乙酸。

KT：激动素，6-糠基氨基嘌呤。

TDZ：噻苯隆，脱叶灵，脱叶脲。

IBA：3-吲哚丁酸。

MS培养基配方如下表所示：

所述改良的MS培养基是指硝酸铵减半调整为825mg/L，其他成分不变；并添加硝酸钙278mg/L的MS培养基。

附图说明

图1为增殖培养35d后的樱桃丛芽。

图2为移栽于苗床30d的樱桃试管苗。

图3为移栽30d的樱桃试管苗生长情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。应当说明的是，以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1

1)接种材料的预处理：于11月中下旬，选择生长健壮、无病虫害的樱桃枝条，摘去自然落叶后残留的叶片，用透明硫酸纸套住枝条顶端25cm左右，基部用回形针固定。

2)外植体的准备与消毒：翌年6月，选取新抽生的半木质化的嫩枝，剪去叶片，用洗洁精清洗后，用流水冲洗3h，在超净工作台上先用75%的乙醇溶液浸泡消毒1min，然后用10%的次氯酸钠溶液浸泡消毒12min，再用无菌水冲洗4次。

3)无菌系的建立：用无菌吸水纸吸干外植体表面的水份，将嫩枝切成1.5cm左右的茎段，每个茎段带1～2个茎节，切除切口处因消毒而坏死的组织，将外植体培养于初始培养基（配方：硝酸铵减半为825mg/L；添加硝酸钙278mg/L的改良的MS培养基+1mg/LZT+0.5mg/L BA+0.2mg/L NAA+0.5g/L水解酪蛋白+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5-6.5g/L，pH=5.6-5.8）。完成接种后，将培养物置于培养架，不开灯，2周后开灯进行光照培养。光照为12h/d，光照强度为3000lx的条件下培养。培养室温度为24℃左右。

4)芽的增殖培养：将上一步得到的无菌系新芽分割后，接种于增殖培养基进行增殖培养；在后续的继代增殖培养过程中，将丛芽基部分割后培养于新鲜的增殖培养基继续进行增殖培养，增殖系数达5.8（参看图1）。其中所述的增殖培养基配方为：硝酸铵减半为825mg/L；添加硝酸钙278mg/L的改良的MS培养基+0.5mg/L BA+0.5mg/L KT+0.1mg/LNAA+0.001mg/L TDZ+0.5g/L水解酪蛋白+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5-6.5g/L，pH=5.6-5.8。

5)壮苗与生根培养：将增殖的丛生芽离基部0.6～1.2cm处切成单芽（根据丛芽生长情况确定，保持每个单芽有3～5片叶，2.5cm高，切割处离单芽最下面1张叶的基部2mm左右），接种于生根培养基进行诱导生根培养，20d后可获得樱桃生根试管苗，生根率达98%。其中所述的生根培养基配方为：大量元素减半、微量元素不变的MS培养基+1mg/LIBA++0.2mg/L NAA+0.5g/L水解酪蛋白+蔗糖20g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH=5.6-5.8。

6)试管苗移栽：将试管苗带瓶在常温下炼苗4d，然后打开瓶盖继续炼苗2天，轻轻取出试管苗，去除其基部培养基后移栽于配比为1:1:1（v/v）的泥炭+椰糠+珍珠岩的基质中，移栽后浇足水，并保持温度为24℃左右，空气湿度70～80%。

7)统计成活率：移栽35d后，统计试管苗成活率为98%（参看图2），小苗叶片茂盛、根系发达（参看图3）。

Claims (5)

1.一种樱桃幼苗的组织培养规模化繁殖方法，其特征在于，以樱桃茎段为外植体建立无菌系，从而进行离体快速繁殖，具体包括以下步骤：

1)接种材料的预处理：于11月中下旬，选择生长健壮、无病虫害的樱桃枝条，摘去自然落叶后残留的叶片，用透明硫酸纸套住枝条顶端20cm～30cm，基部用回形针固定；

2)外植体的准备与消毒：翌年6月，选取预处理的半木质化嫩枝，剪去叶片，用洗洁精清洗后，用流水冲洗2～4h，在超净工作台上先用75％v/v的乙醇溶液浸泡消毒，然后用10％v/v的次氯酸钠溶液浸泡消毒，再用无菌水冲洗；

3)无菌系的建立：用无菌吸水纸吸干外植体表面的水份，将嫩枝切成1～2cm长的茎段，每个茎段带1～2个茎节，切除切口处因消毒而坏死的组织，将外植体培养于初始培养基；其中前期进行培养架上自然培养，2周后进行光照培养；

所述的初始培养基配方为：改良的MS培养基+1～2mg/L ZT+0.5～1.0mg/L BA+0.1～0.2mg/L NAA+0.5～1.5水解酪蛋白+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.6-5.8；

4)芽的增殖培养：将上一步得到的无菌系新芽分割后，接种于增殖培养基进行增殖培养；在后续的继代增殖培养过程中，将丛芽基部分割后培养于新鲜的增殖培养基继续进行增殖培养，对于较长的新芽切割分段后培养；

所述的增殖培养基配方为：改良的MS培养基+0.5～1mg/L BA+0.1～0.5mg/L KT+0.1～0.2mg/L NAA+0.001～0.1mg/L TDZ+0.5～1.5g/L水解酪蛋白+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.6-5.8；

5)壮苗与生根培养：将增殖的丛生芽离基部0.6～1.2cm处切成单芽，接种于生根培养基进行诱导生根培养，培养得樱桃生根试管苗；

所述的生根培养基配方为：大量元素减半、微量元素不变的MS培养基+1～2mg/LIBA+0.2～0.5mg/L NAA+0.5～1.0g/L水解酪蛋白+蔗糖20g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.6-5.8；

6)试管苗移栽：将生根试管苗带瓶盖在常温下炼苗3～5d，打开瓶盖继续炼苗2～3d，轻轻取出试管苗，去除其基部培养基后移栽，移栽后浇足水，并保持温度24℃±2℃，空气湿度70～80％；

所述改良的MS培养基是指硝酸铵减半调整为825mg/L，其他成分不变，并添加硝酸钙278mg/L的MS培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的培养架上自然培养是指将培养物置于培养室的培养架上，但不开灯，光照强度为300勒克斯；所述光照培养，其光照为12h/d，光照强度为3000lx；培养室温度为24℃±2℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)、5)进行光照培养，光照为12h/d，光照强度为3000lx的条件下培养，培养室温度为24℃±2℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中，将增殖的丛生芽切成单芽时，保持每个单芽有3～5片叶，切割处离单芽最下面1片叶的基部2mm±1mm。

5.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，步骤6)中，移栽基质为体积比为1:1:1的泥炭、椰糠和珍珠岩。