CN103988777B

CN103988777B - 一种小叶矮生型广玉兰的嫩茎段离体培养方法

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Publication number: CN103988777B
Application number: CN201410143713.3A
Authority: CN
Inventors: 陆锦明; 朱天华; 汤桂钧
Original assignee: Shanghai Minhang District Nursery
Current assignee: Shanghai Minhang District Nursery
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2014-04-11
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2034-04-11
Also published as: CN103988777A

Abstract

本发明涉及一种小叶矮生型广玉兰的嫩茎段离体培养方法，属于植物组织培养技术领域。所述的方法包括以下步骤：1)、拟接种材料的选择与预处理，2）、外植体的消毒，3）、无菌系的建立，4）、丛生芽的诱导与增殖培养，5）、壮苗与生根培养，6）、试管苗的炼苗与移栽。本发明具有的有益效果：丛生芽的诱导率达到90%以上，壮苗生根培养后的生根率达到96%以上，存活率可达96%以上，繁殖速度快、繁殖率高、脱病毒及提纯复壮等优点，克服现有技术中繁殖系数低、周期长、受季节限制等缺陷，可在短时间内工厂化生产优质种苗以满足城乡绿化之需。以一个茎段为例，一年内可工厂化快速繁殖种苗上万株，且质量优异。

Description

一种小叶矮生型广玉兰的嫩茎段离体培养方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种小叶矮生型广玉兰的嫩茎段离体培养方法。

背景技术

小叶矮生型广玉兰是近年从国外引进的广玉兰新树种，是广玉兰的变种，叶小，树体紧凑矮生，树高只占广玉兰的一半左右属名贵品种，可作绿化、盆花，四季常绿，观赏性强花色洁白优雅，4～5月开花，适应性强，耐零下15度低温。其种苗主要靠扦插、嫁接等常规方法繁殖(目前国内尚未推广)，但周期长且生根率低，无法满足生产用种苗之需。

诱导率直接体现了植物的繁殖率和繁殖速度，专利号为201110372472.6的中国专利：一种提高红麻子叶不定芽诱导率的方法，以红麻种子无菌苗子叶为外植体材料进行不定芽诱导、增殖，不定芽诱导培养基为：MS+0.1-3mg/L TDZ+0.01-1mg/LNAA+0.1-3mg/LAgNO3，不定芽增殖培养基为：MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+100mg/L LH；以上不定芽诱导、增殖的培养条件均以光、暗培养时间分别为14h和10h循环进行、光照强度为20000LX、温度为26±1℃的条件进行培养，红麻子叶不定芽的诱导最高可达到了85％。

又如专利号为201310255798.X的中国专利：一种广玉兰高效栽培方法，是在苗木栽植时加大密植，当苗木生长到干径5厘米以上时，对局部苗木进行增施肥料，对未增施肥苗木进行短截措施，在增施肥苗木干径达到10～12厘米后，对增施肥苗木进行移植，余下苗木再增施肥料。是利用广玉兰主枝顶端生长优势和强阳性特点，首先在苗木栽植时适当加大密植，充分利用土地和空间；当苗木生长到干径5厘米时采用施肥和短截及密度调整的方法，来改善苗圃中部分苗木生长环境，促进这些苗木快速优先生长；通过局部苗木的施肥，人为拉开苗木间的生长势，使部分苗木接受的光照、空气、水分和营养更多，其生长更加优势突出，可明显提高广玉兰出圃规格，提前实现苗木商品化和高效益；通过对未施肥苗木进行短截措施，可抑制这些苗木在短期内(3年左右)较慢生长，保证未短截苗木优先较快生长(即施肥苗)；在优势苗木达到商品苗后，对苗木进行移植并供应市场，余下苗木再增施肥料，由于密度的调整，阳光、空气、水分和营养空间增大了，苗木的生长就更加快了，苗圃的整体效益就提高了。

再如专利号为201110243132.3的中国专利：一种广玉兰的栽培方法，于冬季整地施肥，将田地挖60厘米深进行整地，每亩施基肥包括：鸡粪800～1200公斤、复合肥80～120公斤，或每施入腐熟的饼肥300～500公斤、复合肥100～200公斤；将1～2年生广玉兰嫁接苗定植培养，株距为1.8m～2.5m，行距为1.0m～1.8m，2～3年后于3月下旬至4月初进行隔株移栽，株距为1.8m～2.5m，行距为2.0m～3.6m；移栽后的3年内，在春季、夏季进行修剪，保留树冠高度为树高的1/3，主干在1.6m～2.0m下无分叉，及时摘心、除萌，并重点培养主干，发明目的是提高抗旱性、抗倒伏性、耐水性和生长速度。

以上公开的技术，虽然可提高植物某些性能指标，但周期仍较长，难满足大规模生产需要，而且是针对红麻、广玉兰等植物，与小叶矮生型广玉兰生长特点和性质有区别，目前针对小叶矮生型广玉兰栽培方法的研究还是空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种繁殖率高、繁殖速度快的小叶矮生型广玉兰种苗培养方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种小叶矮生型广玉兰的嫩茎段离体培养方法，包括以下步骤：

1)、拟接种材料的选择与预处理：选取当年萌发的半木质化新枝，剪去已展平的叶片，用洗衣粉冲洗三遍，置于自来水龙头下冲洗3h；

2)、外植体的消毒：在超净台上，先用75％(vol)乙醇溶液消毒1～2min，然后用0.2％(vol)的新洁尔敏溶液消毒15min，最后用10％(vol)次氯酸钠溶液消毒15～20min，用无菌水冲洗三遍后无菌滤纸吸干水份；

3)、无菌系的建立：在超净台上将嫩枝切成1.3～2.0cm的茎段，每个茎段带1～2个茎节，切除切口处因消毒而坏死的组织，将外植体培养于第一培养基进行新芽的诱导培养，培育成无菌系；所述用于建立无菌系的第一培养基的配方为：MS+0.5～1mg/L ZT+1.0～2.0mg/L BA+0.05～0.1mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH值为5.6～5.8；

4)、丛生芽的诱导及增殖：待茎段新芽伸长至1cm以上时，将新芽切下接种至第二培养基上诱导丛生芽，并在该培养基上进行丛生芽的增殖；所述用于诱导丛生芽并增殖的第二培养基的配方为：MS+2～3mg/L KT+0.2～0.3mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH值为5.6～5.8；

5)、将丛生芽在靠近试管苗最下面的叶片着生处下面0.3～0.4mm处切成单芽，切口为每个单芽最下面的叶片着生处下面0.3mm～0.4mm处，并将单芽接种于第三培养基进行壮苗生根培养；所述用于试管苗壮苗与生根的第三培养基的配方为：1/2MS+0.5～1.0mg/LIBA+0.5～1AC g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH值为5.6～5.8；

6)、试管苗的炼苗与移栽：将生根的试管苗移栽至泥炭和珍珠岩混合的基质中，浇足水后用塑料薄膜覆盖保温保湿防失水萎蔫，7天后揭开薄膜炼苗，每天叶面喷水3～5次，15～20天后施肥料液；30～35天后移栽至灌满纯泥炭的塑料穴盘中，经3～4个月培养后直接移栽至土壤或大的容器中。

作为优选的技术方案：所述步骤3)中无菌系的建立、所述步骤4)中丛生芽的诱导与增殖、以及所述步骤5)中壮苗与生根培养，均在如下条件下进行：温度24～26℃、光照强度3000LX，光照时间为10～12h/d。

作为优选的技术方案：所述的步骤6)的基质中泥炭和珍珠岩的重量比为4∶1～3∶1。

作为优选的技术方案：所述的步骤6)的肥料液中含有0.1～0.2wt％硝酸铵、0.1～0.2wt％磷酸二氢钾、0.1～0.2wt％硫酸镁。

半木质化枝条：一般所指当年生的枝条，新的枝条在经过两个月左右的时间会出现木质化的倾向，半木质化就是嫩枝至木质化枝条的过渡生长阶段，就好比人生长阶段的青春期。

本发明具有的有益效果：

丛生芽的诱导率达到90％以上，壮苗生根培养后的生根率达到95％以上，存活率可达100％，具有繁殖速度快、繁殖率高、脱病毒及提纯复壮等优点，克服现有技术中繁殖系数低、周期长、受季节限制等缺陷，可在短时间内工厂化生产优质种苗以满足城乡绿化之需。以一个茎段为例，一年内可工厂化快速繁殖种苗上万株，且质量优异。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不仅仅局限于实施例。

实施例1

2)、外植体的消毒：在超净台上，先用75％(vol)乙醇溶液消毒1min，然后用0.2％(vol)的新洁尔敏溶液消毒15min，最后用10％(vol)次氯酸钠溶液消毒15min，用无菌水冲洗三遍后无菌滤纸吸干水份；

3)、无菌系的建立：在超净台上将嫩枝切成1.3cm长的茎段，每个茎段带1～2个茎节，切除切口处因消毒而坏死的组织，将外植体培养于第一培养基进行新芽的诱导培养，培育成无菌系；

第一培养基的配方为：MS+0.5mg/L ZT+1.0mg/L BA+0.05mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5g/L，pH值为5.6～5.8。

经过培养一个月培养，诱导出来丛生芽，实验数据统计，诱导率为92％。

4)、丛生芽的诱导及增殖：待茎段新芽伸长至1cm以上时，将新芽切下接种至第二培养基上诱导丛生芽，并在该培养基上进行丛生芽的增殖；

用于诱导丛生芽并增殖的第二培养基的配方为：MS+2mg/L KT+0.2mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5g/L，pH值为5.6～5.8。

增殖培养一个月，长出较多丛芽，增殖系数达到3～4。(增殖系数＝瓶苗在一个周期内形成的有效苗数/接种苗数，是一个衡量植物分化能力的指标)。

5)、将丛生芽在靠近试管苗最下面的叶片着生处下面0.3mm处切成单芽，切口为每个单芽最下面的叶片着生处下面0.3mm处，并将单芽接种于第三培养基进行壮苗生根培养；

用于试管苗壮苗与生根的第三培养基的配方为：1/2MS+0.5mg/LIBA+0.5ACg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉5.5g/L，pH值为5.6～5.8。

转接好生根，放在培养室培养，过了一个星期，试管苗基部开始膨胀，开始冒根，再过一个星期，根基本长好了，每颗根数3～5条，根长1～2cm，生根率97％。

6)、试管苗的炼苗与移栽：将生根的试管苗移栽至泥炭和珍珠岩混合的基质中，基质中泥炭和珍珠岩的重量比为3∶1。浇足水后用塑料薄膜覆盖保温保湿防失水萎蔫，7天后揭开薄膜炼苗，每天叶面喷水3～5次，15天后施肥料液，肥料液中含有0.1wt％硝酸铵、0.1wt％磷酸二氢钾、0.1wt％硫酸镁。30天后移栽至灌满纯泥炭的塑料穴盘中，经3个月培养后，移栽至灌满纯泥炭的塑料穴盘中，存活率达100％且缓苗期短、生长快。

上述步骤3)中无菌系的建立、上述步骤4)中丛生芽的诱导与增殖、以及所述步骤5)中壮苗与生根培养，均在如下条件下进行：温度24～26℃、光照强度3000LX，光照时间为10h/d。

实施例2

2)、外植体的消毒：在超净台上，先用75％(vol)乙醇溶液消毒2min，然后用0.2％(vol)的新洁尔敏溶液消毒15min，最后用10％(vol)次氯酸钠溶液消毒20min，用无菌水冲洗三遍后无菌滤纸吸干水份；

3)、无菌系的建立：在超净台上将嫩枝切成2.0cm长的茎段，每个茎段带1～2个茎节，切除切口处因消毒而坏死的组织，将外植体培养于第一培养基进行新芽的诱导培养，培育成无菌系；

第一培养基的配方为：MS+1mg/L ZT+2.0mg/L BA+0.1mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉6.5g/L，pH值为5.6～5.7。

经过培养一个月培养，诱导出来丛生芽，实验数据统计，诱导率为94％。

用于诱导丛生芽并增殖的第二培养基的配方为：MS+3mg/L KT+0.3mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉6.5g/L，pH值为5.6～5.7。

增殖培养一个月，长出较多丛芽，增殖系数达到3～5。(增殖系数＝瓶苗在一个周期内形成的有效苗数/接种苗数，是一个衡量植物分化能力的指标)。

5)、将丛生芽在靠近试管苗最下面的叶片着生处下面0.4mm处切成单芽，切口为每个单芽最下面的叶片着生处下面0.4mm处，并将单芽接种于第三培养基进行壮苗生根培养；

用于试管苗壮苗与生根的第三培养基的配方为：1/2MS+1.0mg/LIBA+1ACg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉6.5g/L，pH值为5.6～5.7。

转接好生根，放在培养室培养，过了一个星期，试管苗基部开始膨胀，开始冒根，再过一个星期，根基本长好了，每颗根数3～6条，根长1.2～2cm，生根率98％。

6)、试管苗的炼苗与移栽：将生根的试管苗移栽至泥炭和珍珠岩混合的基质中，基质中泥炭和珍珠岩的重量比为4∶1。浇足水后用塑料薄膜覆盖保温保湿防失水萎蔫，7天后揭开薄膜炼苗，每天叶面喷水3～5次，20天后施肥料液，肥料液中含有0.2wt％硝酸铵、0.2wt％磷酸二氢钾、0.2wt％硫酸镁。35天后移栽至灌满纯泥炭的塑料穴盘中，经4个月培养后，移栽至灌满纯泥炭的塑料穴盘中，存活率达100％且缓苗期短、生长快。

上述步骤3)中无菌系的建立、上述步骤4)中丛生芽的诱导与增殖、以及所述步骤5)中壮苗与生根培养，均在如下条件下进行：温度24～26℃、光照强度3000LX，光照时间为12h/d。

实施例3

2)、外植体的消毒：在超净台上，先用75％(vol)乙醇溶液消毒1min，然后用0.2％(vol)的新洁尔敏溶液消毒15min，最后用10％(vol)次氯酸钠溶液消毒18min，用无菌水冲洗三遍后无菌滤纸吸干水份；

3)、无菌系的建立：在超净台上将嫩枝切成1.5cm长的茎段，每个茎段带1～2个茎节，切除切口处因消毒而坏死的组织，将外植体培养于第一培养基进行新芽的诱导培养，培育成无菌系；

第一培养基的配方为：MS+0.7mg/L ZT+1.5mg/L BA+0.07mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，pH值为5.7～5.8。

经过培养一个月培养，诱导出来丛生芽，实验数据统计，诱导率为91％。

用于诱导丛生芽并增殖的第二培养基的配方为：MS+2.5mg/L KT+0.25mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，pH值为5.6～5.8。

5)、将丛生芽在靠近试管苗最下面的叶片着生处下面0.35mm处切成单芽，切口为每个单芽最下面的叶片着生处下面0.35mm处，并将单芽接种于第三培养基进行壮苗生根培养；

用于试管苗壮苗与生根的第三培养基的配方为：1/2MS+0.75mg/LIBA+0.75AC g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉6g/L，pH值为5.6～5.8。

转接好生根，放在培养室培养，过了一个星期，试管苗基部开始膨胀，开始冒根，再过一个星期，根基本长好了，每颗根数4～5条，根长1～2cm，生根率98％。

6)、试管苗的炼苗与移栽：将生根的试管苗移栽至泥炭和珍珠岩混合的基质中，基质中泥炭和珍珠岩的重量比为3∶1。浇足水后用塑料薄膜覆盖保温保湿防失水萎蔫，7天后揭开薄膜炼苗，每天叶面喷水3～5次，17天后施肥料液，肥料液中含有0.15wt％硝酸铵、0.15wt％磷酸二氢钾、0.15wt％硫酸镁。30天后移栽至灌满纯泥炭的塑料穴盘中，经3个月培养后，移栽至灌满纯泥炭的塑料穴盘中，存活率达100％且缓苗期短、生长快。

上述步骤3)中无菌系的建立、上述步骤4)中丛生芽的诱导与增殖、以及所述步骤5)中壮苗与生根培养，均在如下条件下进行：温度24～26℃、光照强度3000LX，光照时间为11h/d。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案，因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims

1.一种小叶矮生型广玉兰的嫩茎段离体培养方法，其特征在于，包括以下歩骤：

2)、外植体的消毒:在超净台上，先用75％(vol)乙醇溶液消毒1～2min，然后用0.2％(vol)的新洁尔敏溶液消毒15min，最后用10％(vol)次氯酸钠溶液消毒15～20min，用无菌水冲洗三遍后无菌滤纸吸干水份；

3)、无菌系的建立：在超净台上将嫩枝切成1.3～2.0cm长的茎段，每个茎段带1～2个茎节，切除切口处因消毒而坏死的组织，将外植体培养于第一培养基进行新芽的诱导培养，培育成无菌系；用于建立无菌系的第一培养基的配方为：MS+0.5～1mg/L ZT+1.0～2.0mg/LBA+0.05～0.1mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH值为5.6～5.8；

4)、丛生芽的诱导及增殖：待茎段新芽伸长至1cm以上时，将新芽切下接种至第二培养基上诱导丛生芽，并在该培养基上进行丛生芽的增殖；第二培养基的配方为：MS+2～3mg/LKT+0.2～0.3mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH值为5.6～5.8；

5)、将丛生芽在靠近试管苗最下面的叶片着生处下面0.3～0.4mm处切成单芽，切口为每个单芽最下面的叶片着生处下面0.3mm～0.4mm处，并将单芽接种于第三培养基进行壮苗生根培养；用于试管苗壮苗与生根的第三培养基的配方为：1/2MS+0.5～1.0mg/L IBA+0.5～1g/L AC+蔗糖20g/L+琼脂粉5.5～6.5g/L，pH值为5.6～5.8；

2.根据权利要求1所述的小叶矮生型广玉兰的嫩茎段离体培养方法，其特征在于，所述步骤3)中无菌系的建立、所述步骤4)中丛生芽的诱导与增殖、以及所述步骤5)中壮苗与生根培养，均在如下条件下进行：温度24～26℃、光照强度3000LX，光照时间为10～12h/d。

3.根据权利要求1所述的小叶矮生型广玉兰的嫩茎段离体培养方法，其特征在于，所述的步骤6)的基质中泥炭和珍珠岩的重量比为4:1～3：1。

4.根据权利要求1所述的小叶矮生型广玉兰的嫩茎段离体培养方法，其特征在于，所述步骤6)的肥料液中含有0.1～0.2wt％硝酸铵、0.1～0.2wt％磷酸二氢钾、0.1～0.2wt％硫酸镁。