CN107691226B - 荷花体细胞胚胎发生途径的再生用培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种荷花体细胞胚胎发生途径的再生用培养基及其应用。该培养基包括胚性愈伤诱导与增殖培养基和胚状体发生培养基，培养方法是将外植体放入胚性愈伤诱导与增殖培养基中培养，诱导出愈伤组织并进行增殖培养；将愈伤组织块转移到胚状体发生培养基中，发育形成胚状体；将产生的胚状体移入胚萌发培养基中进行萌发，发育形成子叶形胚；将萌发的子叶形胚移至含荷花成苗培养基中成苗培养，然后移栽至自然环境中。通过本发明的培养基培养，一个外植体能分化出一块胚性愈伤团，从中能高效分化1000个以上的体细胞胚并最终萌发，既能促进荷花的转基因发展，又可以为荷花的栽培应用提供大量的种苗。

Description

荷花体细胞胚胎发生途径的再生用培养基及其应用

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体而言，涉及植物的组织培养体系，尤其涉及一种荷花体细胞胚胎发生途径的再生用培养基及其应用。

背景技术

荷花(NelumbonuciferaGaertn.)为莲科莲属多年生水生花卉，是中国十大传统名花之一，具有很高的观赏价值、经济价值和独特的文化内涵，深受人们喜爱。根据其用途，可分为藕莲、籽莲与花莲。

2013年，荷花品种--中国古代莲的全基因组测序完成，为荷花的基因功能研究奠定了良好的基础。然而，作为转基因重要技术基础的荷花遗传转化再生体系尚不成熟，严重制约了荷花转基因工作的开展。尽管以荷花为研究对象的组织培养技术有研究并成功获得植株再生的报道，但它的的组织培养不能象其它作物容易诱导再生(如小麦、水稻、玉米等形成胚性愈伤后多次继代增殖与保存，并诱导高效分化和再生植株)，因此一直被认为是难以进行培养的园艺作物，限制了荷花组织培养及转基因技术在育种领域的应用。

一般来说，植株再生的途径可分为两种，一种途径是由茎尖直接分化形成丛生苗，然后进行增殖，最后诱导生根获得完整植株，即器官发生途径。器官发生途径的优点在于诱导过程相对简单，但它的缺点在于增殖系数低，同时，此种再生途径被认为是多细胞起源，易形成嵌合体，导致假阳性转化植株的出现，因此在转基因的应用上受很大的限制。对荷花来说，目前此途径主要依靠荷花成熟胚在试管中离体培养出无菌苗，再用无菌苗的茎尖作为外植体诱导出愈伤，然后对愈伤组织诱导不定芽分化，最后生根成苗。关于用荷花成熟胚进行无菌苗培养时取荷花种胚的方法以及消毒的方法，郭娜娜等(荷花成熟胚的组织培养[J].河南科学,2013(3):281-284.)使用浓硫酸腐蚀莲子种皮，用小刀破壳后直接用酒精和氯化汞消毒后成熟胚的离体成活率达到86.63％，最终可以形成无菌苗。

另一种途径则是通过体细胞胚胎发生途径，即先通过诱导外植体形成胚性愈伤，进一步诱导胚性愈伤发育成成熟的胚状体并萌发成完整植株，此过程类似于植物的有性繁殖，体细胞胚胎发生途径的困难在于，胚性愈伤与胚状体的诱导与增殖周期长，获得难度大且有基因型的差异，但因为它在以下方面的几个特点使这项技术极具吸引力：一、一旦成功诱导出胚性愈伤，它可以获得几百倍甚至上千倍的增殖系数；二，胚性愈伤可以长期保持；三、体细胞胚被认为是单细胞起源，在遗传转化过程中不易形成嵌合体导致假阳性的发生，因此是转基因的良好受体。在荷花上，目前尚未见体细胞胚胎再生途径方面的报道。

现有技术中荷花作为商业开发时，利用种藕进行人工繁育的繁殖系数低、成本高；同时在基础研究中缺乏高效的再生体系，限制了基因工程育种工作的开展；这些因素不利于荷花的经济栽培与遗传育种工作。因此，通过研究获得一种荷花的高效再生体系，以解决荷花人工胚状体的获取、基因工程育种等问题，并实现荷花的人工快速离体培养与再生，这显得尤为重要。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种荷花的未成熟子叶体细胞胚诱导、增殖、分化、萌发与成苗方法，以实现荷花的快速经济繁育，极大提高荷花的繁育系数，同时本发明得到的再生体系可以为荷花的基因工程育种提供良好的材料基础。

为了实现本发明的上述目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了一种荷花未成熟子叶体细胞胚胎发生途径的再生方法，该方法包括利用外植体诱导进行组织培养的步骤，所采用的外植体为荷花合子胚中的未成熟子叶。

进一步地，本发明所提供的荷花未成熟子叶体细胞胚胎发生途径的再生方法，该方法包括如下步骤：

(1)选取荷花受精后合子胚中的未成熟子叶作为组织培养的外植体，对外植体进行消毒及清洁处理；

(2)将外植体放入胚性愈伤诱导与增殖培养基中培养，诱导出愈伤组织并进行增殖培养；

(3)将愈伤组织块转移到胚状体发生培养基中，发育形成胚状体；

(4)将产生的胚状体移入胚萌发培养基中进行萌发，发育形成子叶形胚；

(5)将萌发的子叶形胚移至含荷花成苗培养基中成苗培养，然后移栽至自然环境中。

优选地，如上所述荷花未成熟子叶体细胞胚胎发生途径的再生方法，其中步骤(1)中对于发育较大的未成熟子叶，将其切割成约1-2mm小块。

优选地，如上所述荷花未成熟子叶体细胞胚胎发生途径的再生方法，其中步骤(2)中所述的胚性愈伤诱导与增殖培养基的配方为基本MS培养基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、0.5-5.0mg/L的2,4-D、0.5-2.0mg/L的BAP和0.7％的琼脂糖，调节pH为5.5-6.0；外植体放在盛有上述培养基的培养皿中，然后用封口膜将培养皿包好；培养条件为黑暗或弱光中，25±2℃培养4-8周；当愈伤组织诱导出来，将胚性愈伤组织分成直径为0.2-0.5cm的小块，将各小块分别接入装有所述胚性愈伤诱导与增殖培养基的器皿中进行胚性愈伤组织的增殖。

优选地，如上所述荷花未成熟子叶体细胞胚胎发生途径的再生方法，其中步骤(3)中所述的胚状体发生培养基的配方为基本MS培养基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的BAP和0.7％的琼脂糖，调节pH为5.5-6.0；将步骤2所得的胚性愈伤组织接入盛有上述培养基的培养皿中，然后用封口膜将培养皿包好；培养条件为16/8h光周期，光照强度为1000-1500lux，25±2℃培养3-4周。

优选地，如上所述荷花未成熟子叶体细胞胚胎发生途径的再生方法，其中步骤(4)中所述的胚萌发培养基的配方为1/2MS培养基，添加10-50mg/L的GA₃、0-0.5mg/L的BAP与0.7％的琼脂糖；培养条件为16/8h光周期，光照强度为2000-3000lux，25±2℃培养1-6周。

优选地，如上所述荷花未成熟子叶体细胞胚胎发生途径的再生方法，其中步骤(5)中所述的荷花成苗培养基为双层培养基，基中下层为固体培养基，上层为液体培养基，固体培养基的配方为1/2MS培养基，添加0.2mg/L的IBA与0.7％的琼脂糖，液体培养基的配方为2％蔗糖水溶液，调节pH为5.5-6.0。

进一步优选地，如上所述荷花未成熟子叶体细胞胚胎发生途径的再生方法，其中步骤(5)中当荷花茎伸长至6-8cm后，将其移栽至泥塘中培养。

与现有技术相比，本发明的荷花未成熟子叶体细胞胚胎发生途径的再生方法具有如下有益效果和突出优点：其一，培养速度快，从诱导伤愈组织6-8个星期之后，胚性愈伤组织开始形成，8-10个星期之后胚形态已经开始发生并形成子叶形胚，然后将已诱导的小苗进行移栽，可进一步培养成苗；其二，经济适用性高，每克愈伤组织可以分化成500-800个胚状体或者不断在新愈伤培养基上扩大培养，这取决于材料、培养基与激素的应用，一般而言通过3-4周的培养可以扩大8-10倍；其三，能促进荷花的商业开发，有效提高荷花生产上的繁殖系数，满足园艺栽培与大批量生产的要求；其四，荷花的转基因研究刚刚起步，本发明中建立的高效再生体系可以为荷花的转基因奠定良好的基础；其五，本发明的方法易于实施，便于推广。

附图说明

图1为荷花品种‘红建莲’体细胞胚胎发生过程；其中：

a.花后10d未成熟合子胚子叶接种42d后形成的愈伤；

b.胚性愈伤的增殖(黑色部分为老愈伤组织，淡黄色部分为新形成的愈伤)；

c.体细胞胚的萌发(多个体细胞胚发育至鱼雷形胚)；

d.胚性愈伤及胚的早期萌发；

e.两个独立的子叶型胚的萌发示意茎尖的形成；

f.胚白化与畸形的产生；

g.体细胞胚的生根；

h.小苗的移栽与生长发育。

具体实施方式

以下实施例进一步描述本发明方法的实施过程和有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变也包含在本发明范围之内。另外，本发明所采用的试剂，其中：

GA₃的化学成分为赤霉素，使用时配制成高浓度母液，即0.5mg/mL。具体配制方法：称取50mgGA₃，先用2-3mL95％酒精溶解，然后用蒸馏水定容至100mL，即可使用。

2,4-D的化学成分为2,4-二氯苯氧乙酸，使用时配制成高浓度母液，即0.5mg/mL具体配制方法：准确称量2,4-D50mg，先用2ml95％乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配成浓度为0.5mg/mL的母液。

BAP的化学成分为6-苄氨基嘌呤，使用时配制成高浓度母液，即0.5mg/mL具体配制方法：准确称量BAP50mg，加入2mL量1mol/L氢氧化钠溶液使之完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为0.5mg/mL的BAP的母液。

IBA的化学成分为吲哚丁酸，使用时配制成高浓度母液，即0.5mg/mL具体配制方法：准确称量IBA50mg，用2ml1mol/L氢氧化钠溶液使之完全溶解后，再加蒸馏水定容至100ml，即配成浓度为0.5mg/mL的母液。

1、选取外植体：

以荷花‘红建莲’作为组织培养品种，选取荷花未成熟子叶为组织培养外植体，取开放前的花药及花丝为对照外植体。在6月底，观察不同株系‘红建莲’开花与授粉的时期，并在花后一段时间取其莲座，放置于4℃冰箱进行低温预处理3天。

2、外植体的消毒、接种：

从莲座中取出幼嫩的莲种子，先用2％次氯酸钠溶液浸泡消毒30min，然后用无菌蒸馏水中冲洗三次，去掉种子外层的种皮，取出未成熟合子胚，在超净工作台上用解剖刀将其中的子叶切下，根据发育时期的不同，分别切割成1-2mm长。

3、愈伤组织诱导：

胚性愈伤诱导与增殖培养基的配方为基本MS培养基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、2.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的BAP，调节pH为5.5-5.8，然后加0.7％的琼脂，高压灭菌锅121℃灭菌20分钟；在直径9cm的培养皿上倒好培养基后，将上述预处理后的外植体置于其上，然后用封口膜将培养皿包好置于人工培养箱中；培养条件为黑暗，25±2℃，培养约6-8个星期；当愈伤组织块诱导出来，把胚性愈伤组织分成直径为0.2-0.5cm的小块，将各小块分别放在装有上述胚性愈伤诱导与增殖培养基的器皿中进行胚性愈伤的增殖，每隔28d对胚性愈伤进行1次增殖培养。根据表1的试验统计结果可以看出，接种外植体后42天时，采用本发明培养基配方(EC12)诱导后的愈伤诱导发生率(诱导愈伤发生的外植体数/接种外植体数×100％)为29.59％(29/98)。

表1 ‘红建莲’幼胚子叶及花药、花丝在接种不同愈伤诱导培养基上42天后胚性愈伤形成率

4、体细胞胚诱导：

把愈伤组织分成直径为0.5cm的小块，将上述各小块转移到25ml含有30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的BAP和0.7％的琼脂糖、pH为5.5-6.0的MS培养基中进行体细胞胚的诱导，16/8h光周期，光强为1000-1500lux，温度为27℃，培养3-4周。

5、胚状体的萌发：

将经过上述步骤4处理的胚状体放入装有20-25ml的固体培养基的器皿中，培养基为1/2MS培养基，添加50mg/L的GA₃与0.7％的琼脂糖，培养条件为16/8h光周期，光照强度为2000-3000lux，25±2℃，在培养箱中上培育2-3个星期之后转移到新的培养基中，部分胚状体会萌发分化形成子叶。根据表2的试验统计结果可以看出，采用本发明培养基(8号)诱导后的萌发率(已诱导萌发的胚数/接种体细胞团×100％)为63.47％(73/115)。

表2 红建莲胚状体在不同培养基上的萌发率比较

6、成苗诱导与移栽：

将萌发的子叶形胚移至含荷花成苗培养基的250ml锥形瓶中，培养基为双层培养基，基中下层为75-100ml固体培养基，上层为50-100ml液体培养基。其中，固体培养基成份为1/2MS培养基，添加0.2mg/L的IBA与0.7％的琼脂糖，液体培养基为2％蔗糖水溶液，调节pH为5.5-6.0，6000-8000lux光照下恒温培养。待萌发的子叶形胚生长至荷花茎尖长约6-8cm后且根系发育致密，可将其移栽至泥塘中培养。移栽存活率(移栽存活植株数/移栽总苗数×100％)为97.14％(68/70)。

Claims (3)

1.一种荷花体细胞胚胎发生途径的再生用胚性愈伤诱导与增殖培养基，其特征在于，该培养基的配方为基本MS培养基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、2.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的BAP和0.7％的琼脂糖，调节pH为5.5-5.8。

2.根据权利要求1所述荷花体细胞胚胎发生途径的再生用胚性愈伤诱导与增殖培养基，其特征在于，该培养基培养的外植体为荷花合子胚中的未成熟子叶。

3.一种荷花体细胞胚胎发生途径的再生用胚状体发生培养基，其特征在于，该培养基的配方为基本MS培养基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的BAP和0.7％的琼脂糖，调节pH为5.5-6.0。