CN103155862B - 麻竹花药诱导体胚并获得再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了麻竹（Dendrocalamus latiflorus Munro）花药诱导体胚并获得再生植株的方法，属于生物技术和现代农业技术领域。本发明包括外植体的选择、外植体的预处理、外植体的消毒与接种、体胚诱导与增殖、体胚分化、组培苗生根培养与移栽，其特征在于，麻竹花药体胚诱导与增殖培养基为M8+2 mg.L-1 NAA+0.5 mg.L-1 6-BA+15 mg.L-1 PAA+7.5 mg.L-1 STS+500 mg.L-1 CH+100 mg.L-1 Proline+100 mg.L-1 Glutamin+5.4% Maltose+0.8% Agar，pH5.8，所述体胚分化培养基上MS+1 mg.L-1 NAA+0.5 mg.L-16-BA+4 mg.L-1KT+3%Sucrose+0.8% Agar，pH5.8；所述麻竹花药组培苗生根培养基为1/2MS+ 3%Sucrose+0.8% Agar 3%,pH5.8。利用本发明得到的再生苗可用于麻竹品种选育。
Description
技术领域
本发明涉及麻竹的组织培养技术，特别是一种从麻竹花药诱导体胚，最终获得再生植株的方法，属于生物技术和现代农业技术领域。
背景技术
麻竹(DendrocalamuslatiflorusMunro)为禾本科竹亚科牡竹属麻竹亚属，原产中国，自然分布于福建、台湾、广东、广西、贵州和云南等省，是我国华南及东南沿海地区重要的优良、速生、笋材两用的大型丛生竹种之一。麻竹很少开花，品种选育主要以自然界优良无性系选育为主，遗传改良受到限制。虽然以麻竹营养器官为外植体能够获得愈伤组织，但难以诱导分化，获得再生植株。1990年Tsay首先报道了麻竹花药离体培养（PlantCellRep9,349–351）。他们在含2，4-D的培养基上诱导出胚性愈伤并获得再生植株，经过15个月的培养获得了十几棵单倍体植株，移栽生长6个月后死亡，此后未见相关报道。利用花药离体培养可在短期内获得性状丰富的单倍体或纯合的二倍体植株，大幅度缩短育种周期，提高选择效率。对于麻竹来说，通过花药培养诱导胚性愈伤组织，建立植株再生体系，突破麻竹组织培养技术的瓶颈，将为现代生物技术应用于麻竹育种开辟新的途径。
发明内容
本发明提供一种麻竹花药培养方法，通过选择处于特定发育时期的未成熟花药、添加植物生长调节剂、优化培养条件来提高麻竹胚性愈伤组织的诱导率和再生植株的成功率，
本发明的具体描述如下：
1、所述的麻竹花药应选择小孢子的发育时期为单核靠边期的花药，此时从外观上观察，小穗呈淡紫色，长1.2cm左右，顶端小花柱头稍微露出，花药呈淡黄色。
2、所述的外植体在接种前先经过2-6天的低温（4-15℃）预处理。
3、所述的外植体采用流水冲洗1小时，70%乙醇表面消毒，消毒时间为30秒，无菌水冲洗3-5次后，2%次氯酸钠进行表面消毒，消毒时间控制在10-15分钟，无菌水冲洗3-5次。
4、所述的体胚诱导与增殖时，培养条件为暗培养；温度为22-28℃。
5、所述的体胚分化时，光照条件为人工辅助光1000-3000lux，光照时间14-16小时/天；温度为22-27℃。
6、所述体胚诱导与增殖培养基M8+2mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+15mg·L-1PAA+7.5mg·L-1STS+500mg·L-1CH+100mg·L-1Proline+100mg·L-1Glutamin+5.4%Maltose+0.8%Agar,pH5.8。
7、所述体胚分化培养基为MS+1mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+4mg·L-1KT+3%Sucrose+0.8%Agar,pH5.8。
8、所述的麻竹生根培养基为1/2MS+3%Sucrose+0.8%Agar3%,pH5.8。
9、所述组培苗经在生根培养基中培养3-5周后，练苗3-4天，移栽至蛭石泥炭土基质中培养，保持湿度高于80%，每天喷水2-3次。
具体实施方式
步骤1
采集发育时期为单核靠边期的麻竹花药。
在麻竹花期采集长度为1.0-1.4cm小穗，用镊子剥去稃片，剥出花药置于载玻片上，加一小滴醋酸洋红，用镊子捣碎，去除残渣，盖上玻片，显微镜镜检，总结小穗长度、外观等与小孢子发育时期的关系，保证采集、筛选后的小穗中大部分花药处于单核靠边期。通常小穗长1.2cm左右的中上部小花的花药处于单核小孢子晚期，符合花药培养的发育条件。
步骤2
麻竹花药诱导体胚。
采集生长单核晚期的小穗，采用流水冲洗1小时，70%乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗3-5次后，2%次氯酸钠进行表面消毒10-15分钟，无菌水冲洗3-5次；将花药从小穗中剥离，尽量避免花药受伤，均匀接种到花药体胚诱导培养基上。
步骤3
麻竹体胚分化
体胚在原诱导培养基上或者MS培养基上都可以分化成苗，但是在添加了6-BA、NAA和KT的分化培养基上分化效率更高。在含6-BA0.5mg·L-1，NAA1.0mg·L-1，KT4mg·L-1的分化培养基上，麻竹花药体胚分化率可达80%以上，该浓度为麻竹花药体胚分化最佳激素浓度配比。
步骤4
麻竹花药培养组培苗的生根培养
麻竹花药培养诱导的是胚性组织，较易生根，体胚形成后，部分体胚在诱导或分化培养基上即可生根成苗，将已生根的和未生根的苗转入不加任何激素的1/2MS培养基中，添加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，光照条件为人工辅助光1000-3000Lux，光照时间为16h，温度为22-27度。培养3-5周，生根率可达97%。
步骤5
麻竹花药培养再生苗的移栽
待组培苗平均每株生根4-5条，根长带到3-4cm时，即可开始为移栽作准备。炼苗是组培苗移栽前的过渡，可以帮助组培苗逐步适应外界环境，提高成活率。麻竹组培苗炼苗3-4天后，移栽至蛭石泥炭土基质中培养，基质按1：1比例混合，提前铺满穴盘，清水浸透；组培苗移栽后保持湿度80%，每天喷水2-3次，2周后即可进行正常管理，移栽成活率达90%以上。
Claims (5)
1.一种麻竹花药诱导体胚并获得再生植株的方法，包括外植体的选择、外植体的预处理、外植体的消毒与接种、体胚诱导与增殖、体胚分化、组培苗生根培养与移栽，其特征在于，所述外植体经消毒后先在添加植物生长调节剂的改良M8培养基上诱导出愈伤组织并形成体胚，再转移至分化培养基生成植株，在生根培养基上生长3-5周后，移植至泥炭土蛭石基质中于温室或光照培养箱内培养，所述的分化培养基为MS+1mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+4mg·L-1KT+3%Sucrose+0.8%Agar，pH5.8，所述的生根培养基为1/2MS+3%Sucrose+0.8%Agar，pH5.8，所述的改良M8培养基为M8+2mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+15mg·L-1PAA+7.5mg·L-1STS+500mg·L-1CH+100mg·L-1Proline+100mg·L-1Glutamin+5.4%Maltose+0.8%Agar，pH5.8。
2.根据权利要求1所述的一种麻竹花药诱导体胚并获得再生植株的方法，其特征在于，所述的外植体为麻竹未成熟花药，从外观上观察，小穗呈淡紫色，长1.2cm，顶端小花柱头稍微露出，花药呈淡黄色。
3.根据权利要求1所述的一种麻竹花药诱导体胚并获得再生植株的方法，其特征在于，所述外植体在接种前先经过2-6天的4-15℃预处理。
4.根据权利要求1所述的一种麻竹花药诱导体胚并获得再生植株的方法，其特征在于，所述外植体采用流水冲洗1小时，70%乙醇表面消毒，消毒时间为30秒，无菌水冲洗3-5次后，1%-3%次氯酸钠进行表面消毒，消毒时间控制在10-15分钟，无菌水冲洗3-5次。
5.根据权利要求1所述的一种麻竹花药诱导体胚并获得再生植株的方法，其特征在于，所述体胚诱导与增殖时，培养条件为暗培养；温度为22-28℃；当诱导体胚分化时，光照条件为人工辅助光1000-3000lux，光照时间14-16小时/天；温度为22-27℃。
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