CN104303996A - 红竹体细胞胚胎发生的方法 - Google Patents

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岳晋军
顾小平
袁金玲
吴晓丽
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Abstract

本发明公开了红竹Phyllostachys iridescens体细胞胚胎发生的方法，它是通过将外植体适宜消毒后，在诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织，胚性愈伤组织经增殖培养后首先在胚状体诱导培养基上形成胚状体，然后在萌发培养基上形成再生植株，最后再生植株经过壮苗培养、炼苗后移栽成活。本发明解决了红竹体细胞胚胎发生的难题，为实现红竹的转基因研究、原生质体再生等生物技术育种奠定了基础。

Description

红竹体细胞胚胎发生的方法
技术领域
本发明涉及林木生物技术和组织培养领域，特别涉及到红竹体细胞胚胎发生。
背景技术
自1958年德国科学家培养胡萝卜根实现体细胞胚胎发生以来，体细胞胚胎发生已经成为植物育种领域的重要方法之一。竹类植物首例体细胞胚胎发生的报道始于1982年，迄今，国内外和本专利有关的竹类植物胚性愈伤组织诱导和植株再生的报道主要有：
1982年，Metha等报道了由印度刺竹(Bambusa arundinacea)成熟胚诱导出愈伤组织并获得再生植株(参考文献1)。
1985年，Rao等报道以牡竹(Dendrocalamus strictus)成熟种子诱导出愈伤组织，进而实现植株再生(参考文献2)。
1986年，Yeh等用绿竹(B.oldhamii)的花序诱导出愈伤组织，并获得再生植株(参考文献3)。
1987年，Yeh等报道由麻竹(Sinocalamus latiflora)(＝D.latiflorus)种胚愈伤组织实现植株再生(参考文献4)。
1990年，Tsay等利用麻竹(S.latiflora)花药诱导出愈伤组织并实现植株再生(参考文献5)。
1994年，Rout等实现了龙头竹(B.vulgaris)、龙竹(D.giganteus)和牡竹(D.strictus)等三个竹种的植株再生(参考文献6)。
2002年，Godbole等用版纳甜龙竹(D.hamiltonii)秆芽诱导出愈伤组织并实现植株再生(参考文献7)。
2003年，Ramanayake等诱导出龙竹(D.giganteus)的愈伤组织并实现器官再生(参考文献8)。
2004年，Kalia等培养俯竹(B.nutans)的枝条和叶片并实现植株再生(参考文献9)；同年，Lin等报道实现乌脚绿竹(B.edulis)的植株再生(参考文献10)。
2007年，Gillis等利用巴苦竹(B.balcooa)小穗诱导出愈伤组织并建立了高效再生体系(参考文献11)。
2008年，吴涛等以金丝慈竹(B.affinis‘viridiflavus’)的秆芽诱导出愈伤组织并获得再生植株(参考文献12)。
2009年，袁金玲等利用孝顺竹种胚和花序诱导出愈伤组织并实现植株再生(参考文献13)；同年，Ojha等利用马来麻竹(D.asper)的根、叶片、茎段诱导出愈伤组织并获得再生植株(参考文献14)。
2011年，裴海燕利用雷竹(Ph.violascens)种胚诱导出愈伤组织并实现植株再生(参考文献15)；同年，Cheah等报道利用佛肚竹(B.ventricosa)秆芽诱导出愈伤组织并建立再生体系(参考文献16)。
2012年，Hu等培养大叶慈竹(D.farinosus)的种胚和幼笋获得愈伤组织并实现植株再生(参考文献17)。
2013年，Yuan等报道了毛竹(Ph.heterocycla var.pubescens)经体细胞胚胎发生实现植株再生(参考文献18)。
红竹是特产我国的刚竹属竹种，在竹笋及竹材的利用、园林观赏和生态维护等方面具有广泛的应用价值和显著的经济效益。迄今未见红竹愈伤组织诱导或植株再生方面的研究报道，再生体系的缺乏阻碍了红竹生物技术育种的研究。
本发明提供了红竹体细胞胚胎发生的方法，将为红竹的遗传转化、原生质体再生等生物技术育种的研究提供技术支撑。
主要参考文献
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本发明的特点
纵观国内外竹类植物再生体系的研究现状，可以发现：迄今实现植株再生的方式以器官再生为主，有效的体细胞胚胎发生体系匮乏；和体细胞胚胎发生相比，器官再生体系往往存在稳定性差、效率低、重复性不好等缺点，难以应用于进一步的转基因实验和原生质体再生研究。并且，实现植株再生的报道多数是丛生竹种，获得散生竹再生植株的例子较少，迄今未见我国特产重要经济竹种红竹植株再生的报道。散生竹种由于生理习性与丛生竹不同，培养难度大，尽管已有多家单位开展了研究，但鲜有进展。经过开展大量研究和试验，并对同类研究进行了重要改良和革新，发明人掌握了红竹胚性愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生的关键技术，在国际上首次公开红竹体细胞胚胎发生的方法。
发明内容
红竹Phyllostachys iridescens体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，包括：外植体消毒，胚性愈伤组织诱导与增殖，胚状体诱导与萌发，以及壮苗、炼苗和移栽的过程，具体步骤如下：
(1)外植体消毒：选择健康饱满的种实，先用75％体积比的乙醇浸泡消毒1min；再用每升加5-6滴吐温-80的0.2％次氯酸钠浸泡消毒15-20min，期间振荡3-4次；然后用无菌水冲洗5-6次；最后用无菌纸吸干表面水分，接种备用；
(2)胚性愈伤组织诱导与增殖：将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，暗培养30-50d使愈伤组织形成，愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，添加1.0-6.0mg/L的2，4-D、0.01-1.0mg/L的picloram、0.1-5.0mg/L的ZT、8.0g/L的卡拉胶、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白；然后将淡黄色致密的胚性愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上，暗培养60-90d使胚性愈伤组织增殖，每30d转接一次，增殖培养基是以MS培养基为基础，添加1.0-6.0mg/L的2，4-D、0.01-1.0mg/L的picloram、8.0g/L的卡拉胶、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白；
(3)胚状体诱导与萌发：将增殖培养后的胚性愈伤组织接种到胚状体诱导培养基上，暗培养10-20d，使胚状体形成，胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础，添加1.0-8.0mg/L的ZT、0.1-5.0mg/L的NAA、0.1-5.0mg/L的GA、30g/L的蔗糖、8g/L的卡拉胶；然后将胚状体接种到萌发培养基上，光照培养20-30d，胚状体逐渐萌发形成再生植株，萌发培养是以MS培养基为基础，添加0.1-5.0mg/L的NAA、0.1-5.0mg/L的GA、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白、8g/L的卡拉胶；光照时间12h/d，光照强度1000-2000lux；
(4)壮苗、炼苗和移栽：将体细胞胚胎再生的小植株接种到壮苗培养基上培养20-30d，开瓶炼苗5-7d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1％的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加1.0-4.0mg/L的NAA、0.2-0.5mg/L的TDZ、8g/L的卡拉胶。
具体实施方式
下面结合红竹Phyllostachys iridescens实例对本发明进行详细说明。
(1)挑选饱满健康种实，先用75％体积比的乙醇浸泡消毒1min；再用每升加5-6滴吐温-80的0.2％的次氯酸钠浸泡消毒15-20min，期间振荡3-4次；然后用无菌水冲洗5-6次；最后用无菌纸吸干表面水分，接种备用；
(2)将消毒后的外植体接种到愈伤组织诱导培养基上，26℃暗培养40-50d，外植体形成米粒大小的愈伤组织，诱导培养基是以MS培养基为基础，添加3mg/L的2，4-D、0.1mg/L的picloram、0.5mg/L的ZT、8g/L的卡拉胶、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白；然后将淡黄色致密的胚性愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上，暗培养60-90d，每30d转接一次，增殖培养基是以MS培养基为基础，添加1.0mg/L的2，4-D、0.1mg/L的picloram、0.5mg/L的ZT、8g/L的卡拉胶、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白；
(3)将增殖后的胚性愈伤组织接种到胚状体诱导培养基上，26℃暗培养10-20d，胚状体形成，胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础，添加3.0mg/L的ZT、1.0mg/L的NAA、1.0mg/L的GA、30g/L的蔗糖、8g/L的卡拉胶；然后将胚状体接种到萌发培养基上，光照培养20-30d，光照时间12h/d，光照强度1000-2000lux，胚状体逐渐萌发形成再生植株，萌发培养基是以MS培养基为基础，添加1.0mg/L的NAA、1.0mg/L的GA、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白、8g/L的卡拉胶；
(4)壮苗、炼苗和移栽：将体细胞胚胎再生的小植株接种到壮苗培养基中，培养20-30d，开瓶炼苗5-7d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1％的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质(山地黄壤土∶蛭石∶泥炭土＝1∶1∶1)中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加2mg/L的NAA、0.2mg/L的TDZ、8g/L的卡拉胶。

Claims (1)

1.红竹Phyllostachys iridescens体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，包括：外植体消毒，胚性愈伤组织诱导与增殖，胚状体诱导与萌发，以及壮苗、炼苗和移栽的过程，具体步骤如下：
(1)外植体消毒：选择健康饱满的种实，先用75％体积比的乙醇浸泡消毒1min；再用每升加5-6滴吐温-80的0.2％次氯酸钠浸泡消毒15-20min，期间振荡3-4次；然后用无菌水冲洗5-6次；最后用无菌纸吸干表面水分，接种备用；
(2)胚性愈伤组织诱导与增殖：将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，暗培养30-50d使愈伤组织形成，愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，添加1.0-6.0mg/L的2，4-D、0.01-1.0mg/L的picloram、0.1-5.0mg/L的ZT、8.0g/L的卡拉胶、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白；然后将淡黄色致密的胚性愈伤组织分离出来，接种到增殖培养基上，暗培养60-90d使胚性愈伤组织增殖，每30d转接一次，增殖培养基是以MS培养基为基础，添加1.0-6.0mg/L的2，4-D、0.01-1.0mg/L的picloram、8.0g/L的卡拉胶、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白；
(3)胚状体诱导与萌发：将增殖后的胚性愈伤组织接种到胚状体诱导培养基上，暗培养10-20d，使胚状体形成，胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础，添加1.0-8.0mg/L的ZT、0.1-5.0mg/L的NAA、0.1-5.0mg/L的GA、30g/L的蔗糖、8g/L的卡拉胶；然后将胚状体接种到萌发培养基上，光照培养20-30d，胚状体逐渐萌发形成再生植株，萌发培养是以MS培养基为基础，添加0.1-5.0mg/L的NAA、0.1-5.0mg/L的GA、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白、8g/L的卡拉胶；光照时间12h/d，光照强度1000-2000lux
(4)壮苗、炼苗和移栽：将体细胞胚胎再生的小植株接种到壮苗培养基上培养20-30d，开瓶炼苗5-7d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1％的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加1.0-4.0mg/L的NAA、0.2-0.5mg/L的TDZ、8g/L的卡拉胶。
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