CN105010143A

CN105010143A - 一种楸树的体外培养方法

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Publication number: CN105010143A
Application number: CN201510443187.7A
Authority: CN
Inventors: 陈发菊; 王玉宇; 梁宏伟; 王玉兵; 王长兰; 张德春; 姚伟
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: China Three Gorges University CTGU
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2015-07-27
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-07-27
Also published as: CN105010143B

Abstract

一种楸树的体外培养方法包括1）愈伤组织的诱导：将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；愈伤组织诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；2）愈伤组织的增殖：将愈伤组织置于增殖培养基上增殖；增殖培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)；3）胚性愈伤组织的诱导和体细胞胚胎的分化：将增殖后的愈伤组织置于诱导分化培养基上；诱导分化培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)；4）植株再生：将分化出的体细胞胚胎置于再生培养基上诱导体胚萌发，得到楸树再生植株。本发明是为了扩大楸树的繁殖系数，为种质保存、遗传转化提供条件。

Description

一种楸树的体外培养方法

技术领域

本发明涉及植物的体外培养方法，特别是一种楸树的体外培养方法。

背景技术

楸树(Catalpa bungei C. A. Mey)属紫葳科（Bignoniaceae）梓属（Catalpa）的高大乔木，是起源我国的乡土树种，分布范围东起海滨，西至甘肃，南始云南，北到长城的广大区域内。该树种适应性强，分布广，素有“木王”之称(王文采等 1990)。树姿俊秀，高大挺拔，花多盖冠，其花形若钟，红斑点缀白色花冠，每至花期，繁花满枝，是我国历史上著名园林观赏树种，自古以来就种植于皇家庭院、古刹寺庙和风景名胜等地，同时楸树还是优良的药用和用材树种，具有很高的生态效益和经济效益。此外，楸树的环保性能较强，可消声，滞尘，有效吸收二氧化硫、氯气等有毒气体。因此提高楸树的种植面积和利用效益意义极其重大。

由于楸树木材具有诸多其它树种不可替代的优良特性，加剧了人们对它的开发利用，自然分布面积不断缩小，数量的急剧减少。又因为楸树花而不实，不同无性系经昆虫传粉，即使能结实，结实量也很少(郭从俭 1988)。实生繁殖困难，自古以来人们一直延用“取傍生者植之”的方法繁衍楸树，代代相传形成了楸树的单一无性系，使楸树的发展受到很大限制。目前楸树资源日趋减少，已濒于“临危植物”的边缘，亟待拯救。楸树资源的大量毁灭，给人们带来严重的不良后果。当前已造成材种比例结构失调，直接影响到国民经济建设和人民的生产生活。因此，迅速恢复楸树生产，大力发展楸树已成为林业生产的当务之急。

楸树传统繁殖方法主要采用播种、埋根、嫁接、扦插等方法。而采用这些方法存在实生苗生长周期长，果实收集困难, 种子发芽率低, 出苗率不稳定等缺陷, 无法满足生产和市场的需求(韩创举等 2006)。因此,探索快速繁殖楸树的有效途径成为亟待解决的问题。组织培养具有需要材料量少、繁殖快、不受季节影响等特点，是快速繁殖木本植物一个重要方法。近年来，对于楸树的组织培养研究主要侧重于用幼嫩的茎尖、带芽点的嫩茎做外植体诱导腋芽(孟永红等 2004；傅玉兰等 2009；聂琳 2011)和不定芽(王军辉等 2011)。主要研究了培养基的种类、植物生长调节剂的组合和配比、碳源、蔗糖浓度和琼脂浓度对腋芽和不定芽的诱导影响。杨燕(杨燕 2008)，Lin juan (Lin et al. 2010)等探究了不同的激素浓度和不同的外植体对楸树愈伤组织的影响。于永明(于永明等 2012)等报道基因型也是楸树腋芽诱导、增殖和生根的主要影响因素。但楸树体细胞胚胎发生的研究还未见报道，因此建立稳定高频率发生楸树体细胞胚胎再生体系，为楸树的生物技术育种、种质资源保存、快速繁殖、遗传转化、人为控制楸树的生长发育研究提供良好的实验体，具有十分重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用楸树体细胞胚胎进行体外培养的方法，其方法的培育周期在１７５天左右、再生植株成活率达到85%以上。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：楸树的体外培养方法，包括以下步骤：

1)愈伤组织的诱导：以经灭菌的楸树为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA）和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；

2)愈伤组织的增殖：将愈伤组织置于增殖培养基上增殖；所述增殖培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0-2.0 mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和浓度为0-0.1mg/L的α-萘乙酸（NAA）；

3)胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的分化：将增殖后的愈伤组织置于分化诱导培养基上诱导胚性愈伤组织，在诱导培养基上继代培养诱导体细胞胚胎；所述的诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0-1.0 mg/L 的6-苄基嘌呤(6-BA)和浓度为0-0.1 mg/L 的α-萘乙酸（NAA）；

4)植株再生：将分化出的体细胞胚胎置于再生培养基上诱导体胚萌发，得到楸树再生苗；所述植株再生培养基为1/2MS培养基。

进一步讲，所述步骤1）中的外植体为未成熟的子叶胚。

进一步讲，所述方法步骤1）中愈伤组织诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为0-2.0 mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度为0-2.0 mg/L。

进一步讲，所述步骤1）中愈伤组织诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为0.1mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度为1.0 mg/L。

进一步讲，所述方法步骤2）增殖培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为1.0mg/L，α-萘乙酸（NAA）的浓度为 0.01mg/L；

所述方法步骤3）分化诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为0.2mg/L，α-萘乙酸（NAA）的浓度为0.05mg /L。

进一步讲，未成熟子叶胚进行灭菌的方法为：取楸树未成熟细长蒴果，用75%酒精棉球擦拭消毒，套剥去果皮，然后用2% 的NaClO对种子进行表面消毒4min,无菌水清洗，4℃ 环境下保存10小时以上；再用2% 的NaClO浸泡3min,无菌水清洗,剥去种皮，取出子叶胚作为外植体。

进一步讲，所述步骤1）的培养条件为：温度25±2℃，光照时间12-16h／天，光照强度2000-2500lux；

步骤2）的培养条件为：温度25±2℃，光照时间12-16h／天，光照强度2000-2500lux；

步骤3）的培养条件为：温度25±2℃，光照时间12-16h／天，光照强度2000-2500lux。

进一步讲,所述步骤1）中愈伤组织的诱导时间为10-17天, 外植体成为长满浅绿色的愈伤组织；

步骤2）中的增殖时间为30-60天, 浅绿色愈伤组织逐渐转变为黑色颗粒状愈伤组织；

步骤3）中的诱导分化时间为60-90天, 黑色颗粒状愈伤组织分化生成浅黄色的胚性愈伤组织；

步骤4）中的再生培养时间为30天, 体细胞胚萌发生成再生苗。

进一步讲，对步骤4）中经再生培养后得到的完整植株进行炼苗，方法为：待再生苗长出3-5片真叶时，逐步打开组培瓶盖，使再生植苗与空气接触，在20-25℃下炼苗7-10天。

进一步讲，所述楸树的体外培养方法还包括移植，待再生苗生长至5cm左右时，将再生苗从培养瓶中移至缓冲间培养，再将再生苗移至培养室外常温培养，再取出再生苗，在流水下彻底清洗根部的培养基，最后将再生苗移至已灭菌培养基质中培养。

本发明提供了楸树的一种体外培养方法。该方法是利用未成熟子叶胚及其它类似材料作为外植体，通过胚性愈伤组织诱导途径得到再生植株。以子叶胚为外植体进行离体再生的优势在于取材方便、可提供的材料充足。用该方法可高频率地诱导出大量的楸树体细胞胚胎，再生植株成活率高，可达85％，而且具有再生植株变异小和遗传稳定性较高的优点。本发明为扩大楸树的繁殖系数、该物种的种质保存及其遗传转化奠定了良好的基础，应用前景广阔。

附图说明

图1为未成熟子叶胚诱导的愈伤组织。

图2为增殖后的黑色颗粒状愈伤组织。

图3为胚性愈伤组织。

图4为显微镜下观察到的球形胚。

图5为显微镜下观察到的心形胚。

图6为显微镜下观察到的鱼雷胚。

图7为显微镜下观察到的子叶胚。

图8为胚状体。

图9为体细胞胚萌发的小植株。

图10为炼苗成活的再生植株。

图11为本发明方法步骤。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

1/2MS基本培养基：可参照文献（Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 1962, 15: 473-497）配制，仅将大量元素减为原来的一半。

如图11中，楸树的体外培养方法主要内容如下，灭菌——愈伤组织的诱导——愈伤组织的增殖——胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的分化——植株再生——移植，并以未成熟的子叶胚为外植体具体实施如下：

1)子叶胚的灭菌

取楸树未成熟细长蒴果，用75%酒精棉球擦拭消毒2-3遍，进入无菌操作台用75%的酒精棉球再擦拭消毒2-3遍，戴上无菌手套剥去果皮，然后用2% 的NaClO对种子进行表面消毒4min,无菌水清洗5次，4℃ 过夜(时间不少于10小时)；再用2% 的NaClO浸泡3min,无菌水清洗5次。戴上无菌手套剥去种皮，取出子叶胚作为外植体。

2）愈伤组织的诱导及含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的愈伤组织诱导培养基的诱导效果比较。

愈伤组织诱导培养基：在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0-2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 0-2.0mg/L。

以步骤1）获得的经灭菌的未成熟子叶胚为外植体，将其置于上述含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的愈伤组织诱导培养基（每个培养瓶中接种20粒，每个组合接种5瓶，重复3次）上，在温度25±2℃，光照时间12-16h／天，光照强度2000-2500lux下诱导愈伤组织，并对含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的愈伤组织诱导培养基的诱导效果进行比较。

结果在含不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的MS培养基上的子叶胚外植体均能产生愈伤，接种后第5天，未成熟子叶胚中部膨胀，子叶胚中部膨胀，表面开始变得模糊，有少量浅绿色的愈伤组织出现，接种8天后，外植体长满浅绿色愈伤组织，整体变大[图1]。培养15 d后各组合培养基上愈伤组织的诱导率均较高，其中在2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 1.0mg/L, 6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0.1mg/L培养基上，诱导率最高达到90%；在只含6-苄基腺嘌呤(6-BA) (0-2.0mg/L)的培养基上诱导率最低，接近于0，在只含有2,4-二氯苯氧乙酸(0-2.0mg/L)的培养基上诱导率也偏低，最高只达到 78%，表明在楸树的愈伤组织诱导过程中2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)是必须的，只有在2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)达到一定的比例时能提高愈伤组织的诱导率。因此将愈伤组织诱导培养基定为：在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0-2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 0-2.0mg/L。

3)愈伤组织的增殖及含有不同浓度的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸（NAA），6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的培养基对愈伤组织增殖的效果比较。

将在不同浓度的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)的组合培养基上诱导的部分愈伤组织转置添加6-苄基腺嘌呤(6-BA)（0-1.0mg/L）和α-萘乙酸（NAA）(0-0.1mg/L)的培养基上进行增殖。部分愈伤组织会大量增殖，形态没有发生明显变化，但颜色会逐渐加深呈棕色，另外部分的愈伤组织生长较慢，颜色逐渐褐化。45天之后，只有在6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸（NAA）的组合培养基上有黑色颗粒状的愈伤出现(图2)，在6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0mg/L和α-萘乙酸（NAA）0.01mg/L的培养基中黑色颗粒状愈伤(褐化愈伤组织生成黑色颗粒状愈伤)最多, 在6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.9mg/L和α-萘乙酸（NAA）0.07mg/L的培养基中黑色颗粒状愈伤(褐化愈伤组织生成黑色颗粒状愈伤)次之，在只有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的培养基无黑色颗粒状愈伤产生。

4）体细胞胚的分化及含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸（NAA）组合的分化培养基的诱导分化效果比较

分化培养基：在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0-1.0mg/L和α-萘乙酸（NAA）0-0.1mg/L。

将步骤3)获得的愈伤组织转置不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸（NAA）组合的培养基，在温度25±2℃，光照时间12-16h／天，光照强度2000-2500lux下诱导分化，并对含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸（NAA）组合的分化培养基的诱导分化效果进行比较。

结果45天之后只有黑色的颗粒状愈伤组织在上述含有不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸（NAA）组合的培养基上有浅黄色的胚性愈伤组织的产生(图3)，说明在愈伤组织的增殖阶段合适的培养基为6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1.0mg/L，α-萘乙酸（NAA） 0.01mg/L，愈伤长期在含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的培养基上培养对胚性愈伤组织的诱导有阻碍作用。其中，颗粒状的黑色愈伤组织在含6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0.2mg/L和α-萘乙酸(NAA) 0.05mg/L的1/2MS培养基上，诱导率最高，在含6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0.23mg/L和α-萘乙酸(NAA) 0.06mg/L的1/2MS培养基上，诱导率次之,继代30天后，浅黄色胚性愈伤组织的体积是转接时的100倍以上，随后，进一步发育成球形胚(图4)、心形胚(图5)、鱼雷胚(图6)和子叶胚(图7)，据统计，每0.5g的胚性愈伤组织中含有1000个以上的胚状体(图8)，继续培养，产生大量体细胞胚。

5）植株再生

再生培养基：1/2 MS培养基（大量元素为MS基本培养基全量的1/2）

将步骤3）获得的已经长出两片子叶的子叶期胚转接到1/2 MS培养基上在温度25±2℃，光照时间12-16h／天，光照强度2000-2500lux下诱导萌发，茎端和根端同时发育，最后发育成完整植株(图9)。

6）炼苗和移栽

先将步骤5）中经生根培养后得到的再生植株进行炼苗，移植。炼苗方法为：待再生苗长出3-5片真叶时，将再生苗从培养瓶中移至缓冲间培养，逐步打开组培瓶盖，使再生植苗与空气接触，在20-25℃下炼苗7天；再将再生苗从缓冲间中移至培养室外常温下炼苗培养7天左右。

再取出再生苗，在流水下彻底清洗根部的培养基，最后将幼苗移至装有已灭菌培养基质(腐殖土：珍珠岩=1：1)的花盆中，浇透水置于温棚中培养(图10)。

Claims

1.一种楸树的体外培养方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法，其特征在于：所述步骤1）中的外植体为未成熟的子叶胚。

3.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法，其特征在于：所述方法步骤1）中愈伤组织诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为0-2.0mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度为0-2.0 mg/L。

4.根据权利要求3所述的一种楸树的体外培养方法，其特征在于：所述步骤1）中愈伤组织诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为0.1mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度为1.0 mg/L。

5.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法，其特征在于: 所述方法步骤2）增殖培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为1.0mg/L, α-萘乙酸（NAA）的浓度为 0.01mg/L；

所述方法步骤3）化诱导培养基中6-苄基嘌呤(6-BA)的浓度为0.2mg/L，α-萘乙酸（NAA）的浓度为0.05mg/L。

6.根据权利要求2所述的一种楸树的体外培养方法，其特征在于：子叶胚进行灭菌的方法为：取楸树未成熟细长蒴果，用75%酒精棉球擦拭消毒，套剥去果皮，然后用2% 的NaClO对种子进行表面消毒4min,无菌水清洗，4℃ 环境下保存10小时以上；再用2% 的NaClO浸泡3min,无菌水清洗，剥去种皮，取出子叶胚作为外植体。

7.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法，其特征在于：

所述步骤1）的培养条件为：温度25±2℃，光照时间12-16h／天，光照强度2000-2500lux；

8.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法，其特征在于：

所述步骤1）中愈伤组织的诱导时间为10-17天, 外植体成为长满浅绿色的愈伤组织；

步骤2）中的增殖时间为30-60天, 浅绿色愈伤组织转变为黑色颗粒状愈伤组织；

步骤3）中的诱导分化时间为60-90天, 黑色颗粒状愈伤组织分化产生浅黄色的胚性愈伤组织；

步骤4）中的植株再生培养时间为30天, 体细胞胚萌发生成再生苗。

9.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法，其特征在于：对步骤4）中经再生培养后得到的完整植株进行炼苗，方法为：待再生苗长出3-5片真叶时，打开组培瓶盖，使再生植苗与空气接触，在20-25℃下炼苗7-10天。

10.根据权利要求1所述的一种楸树的体外培养方法，其特征在于：所述楸树的体外培养方法还包括移植，待再生苗生长至5cm左右时，将再生苗从培养瓶中移至缓冲间培养，再将再生苗移至培养室外常温培养，再取出再生苗，在流水下彻底清洗根部的培养基，最后将再生苗移至已灭菌培养基质中培养。