CN115836647A - 一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，属于植物组织培养与细胞培养技术领域。该方法包括：采集楸树未成熟种子，清洗消毒后，拨出幼胚；将所得幼胚接种到初级诱导培养基进行暗培养获得幼苗，将幼苗的子叶和下胚轴分别转移到愈伤组织诱导培养基，将诱导出的愈伤组织转移到分化培养基，光下培养，诱导出不定芽；将获得的不定芽继代及生根培养；移栽炼苗。该方法具有较高的愈伤组织诱导率、不定芽再生率，且移植后的植株生长健壮。与以往楸树体细胞胚胎发生报道比，本发明以楸树幼胚为外植体，其子叶和下胚轴可通过同一培养基分化出不定芽，能够快速实现楸树优质苗木的规模化、工厂化育苗。

Description

一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养与细胞培养技术领域，具体涉及一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法。

背景技术

灰楸为紫葳科梓树属高大落叶乔木，广泛分布于长江和黄河流域，是优良园林绿化树种和珍贵的家具用材。由于灰楸自交不亲和性，结实出种率低，种子萌发率也不高，采用播种育苗比较困难。因此，灰楸繁育多采用嫩枝扦插育苗法和埋根摧芽育苗法，但扦插育苗法则存在生根率低、成活率不高的技术瓶颈；埋根育苗法存在种根较少、繁殖材料不足的问题，在实际生产中难以大量种植推广。

在生态育种理论指导下，通过杂交育种选育了一系列优良无性系，但是在自然状态下楸树实生困难，主要依赖于埋根、嫁接、组培等无性繁殖方式，而过度依赖无性繁殖育苗方式会造成楸树群体遗传多样性降低、抗性降低等生态风险和危机。通过植物组织培养的无性繁殖技术不受季节的限制，能在短时间内实现对优良品种的快速扩增，但是现有的楸树组培快繁技术多采用以茎尖、茎段为外植体进行扩繁，存在工作量大、诱导率低、分化效率不高等问题。利用幼胚或成熟胚获得的受体材料，繁殖效率高、遗传背景一致、有利于楸树优良无性系的生产和推广。虽然已有利用成熟胚的子叶获得再生植株的报道，但因为楸吊长时间在野外生长，导致成熟胚带有大量的寄生菌，有些优良无性系系号很难通过彻底消毒获得无菌培养苗，导致大量的前期的工作以失败而告终。鉴于此，本发明以幼胚材料为材料，建立了楸树子叶和下胚轴为外植体的再生技术体系。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，该方法以子叶和下胚轴为外植体，建立了无菌诱导再生植株的体系，并且可通过同一培养基分化出不定芽，能够快速实现楸树优质苗木的规模化、工厂化育苗。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，其包括如下步骤：

1）采集楸树未成熟种子，清洗消毒后，拨出幼胚；

2）将所得幼胚接种到初级诱导培养基进行暗培养获得幼苗，初级诱导培养基为基本培养基MS中加入0.05 mg/L 的6-BA，0.6 mg/L的 TDZ，0.4 mg/L的 ZT，0.4 mg/L的GA3，30g/L的蔗糖和3g/L的凝胶，pH=5.9；

3）将14天苗龄的子叶和下胚轴分别转移到愈伤组织诱导培养基进行暗培养；

4）将诱导出的愈伤组织转接到分化培养基，光下培养，诱导出不定芽；

5）将获得的不定芽继代培养及生根培养；

6）移栽炼苗。如上所述楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，优选地，在步骤1）中，未成熟种子为指5月底-7月初未成熟的楸树蒴果。

如上所述楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，优选地，消毒为将未成熟种子先用酒精中浸泡1分钟后，将种子剥出，用1%的次氯酸钠溶液消毒4分钟，用无菌水洗涤3~5次，于4℃保存过夜，次日再次使用1%浓度次氯酸钠溶液消毒3~5分钟，无菌水洗涤4次，剥去种皮，拨出幼胚。

如上所述楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，优选地，在步骤2）和3）中，进行暗培养的时间为14天，培养温度为25±2℃。

如上所述楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，优选地，在步骤3）中，愈伤组织诱导培养基为基本培养基MS中加入0.05 mg/L 的6-BA、0.6 mg/L的 TDZ、0.4 mg/L的 ZT、0.4mg/L的GA3、30g/L的蔗糖和3g/L的凝胶，pH=5.9。

如上所述楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，优选地，在步骤4）中，分化培养基为基本培养基DKW或WPM中加入2.0 mg/L 的6BA，3 g/L的凝胶和30g/L的蔗糖，其pH为5.9。

如上所述楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，优选地，在步骤5）中，继代培养的培养基为DKW中加入2.0 mg/L的 6BA、0.1 mg/L 的IBA、30g/L的蔗糖和3g/L的凝胶，其pH为5.8。

如上所述楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，优选地，在步骤6）中，生根培养的培养基为1/2MS中加有浓度为0.2-0.5mg/L的IBA，30g/L的蔗糖和5g/L的琼脂，pH为5.8；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500 lx，光照时间16 h/d。

本发明的有益效果在于：

与以往楸树体细胞胚胎发生报道比，本发明提供的一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法。幼胚的楸吊在野外暴露时间短，经过消毒处理更容易获得无菌材料，能够快速实现楸树优质苗木的规模化、工厂化育苗。本发明以楸树幼胚子叶和下胚轴为外植体获得再生植株，提高了愈伤组织和不定芽的诱导效率，子叶诱导不定芽的效率达到80%，下胚轴诱导效率达到60%，解决了以楸树幼胚为材料的植株再生技术难题；此外，子叶和下胚轴可通过相同的愈伤组织诱导培养基和不定芽分化培养基获得再生植株，简化了操作步骤，可以同一时间获得大量的植株材料应用于生产和科研。

附图说明

图1为幼胚初级培养诱导出幼苗；

图2 为以楸树子叶为外植体的器官再生；

图3 为以楸树下胚轴为外植体的器官再生；

图4为不定芽伸长；

图5为继代及生根培养。

实施方式

本发明提供了一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，本发明以楸树未成熟种子为材料，清洗消毒后拨出幼胚，将所得幼胚接种到初级诱导培养基进行暗培养获得幼苗；以获得无菌幼苗的子叶和下胚轴为外植体，通过愈伤间接诱导途径，建立了楸树再生体系。与以往楸树成熟胚及茎段作为外植体构建再生体系相比，本发明以楸树幼胚为材料，所获得幼苗的子叶和下胚轴在离体培养下通过优化后的愈伤诱导培养基使其获得具有更强的愈伤组织诱导能力和植株再生能力，子叶和下胚轴通过优化后的相同的愈伤诱导培养基和不定芽分化培养基获得再生植株，且移植后的植株生长健壮，能够快速实现楸树优质苗木的规模化、工厂化育苗，也可以应用于楸树的基因功能研究。

一般情况下，生长素和细胞分裂素的浓度配比，会决定愈伤组织是继续分裂还是分化。生长素/细胞分裂素比例适中有利于愈伤组织生长，细胞分裂素稍高时，则促进愈伤组织分化成芽。本发明通过大量实验，最后确定在愈伤组织诱导过程中加入了0.05 mg/L的6-BA，0.6 mg/L的 TDZ，0.4 mg/L的 ZT和0.4 mg/L的GA3，有助于愈伤向分化状态的过渡，且该阶段采用多种激素混合使用，比使用单个激素种类获得的愈伤组织状态更好，楸树组织培养中诱导出的愈伤组织状态往往直接影响后续不定芽分化。

在不定芽分化阶段，一般认为6-BA与GA3、NAA、TDZ等配合使用时，较单独使用6-BA增殖系数更高。但是本发明只添加了6-BA即可以很好地诱导分化，可能是因为前期诱导幼苗和诱导愈伤阶段，加入添加了一定浓度质量的GA3、NAA和TDZ，长时间的诱导使得激素在植物体内有微量积累。一般认为，较低浓度的TDZ有助于芽的分化，微量的GA3可以促进不定芽增殖和伸长。本发明发现添加低剂量的NAA有助于维持愈伤组织的淡绿色状态。虽然6-BA和NAA的组合也可以诱导出不定芽，但是NAA对不定芽分化有一定负面影响，而6-BA对芽分化作用明显，因此优选含6BA的基本培养基DKW或WPM作为分化培养基。

本发明诱导愈伤所用的培养基优选为：MS培养基中加入0.5 mg/L 6-BA（6-苄氨基腺嘌呤），0.4mg/L NAA（萘乙酸）、0.5-2.0 mg/LTDZ（噻苯隆）和0.4mg/LGA3（赤霉素3），分化培养基为DKW或WPM基本培养基中加入2.0 mg/L 6-BA。采用该成分配比组合的培养基，具有不定芽诱导效率高、数量多、不定芽长且无玻璃化现象等优点，该方法所需的培养条件简单、增殖系数高、再生周期短，具有良好的推广前景。

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中所用的培养基、试剂均可采用市购产品，培养基具体采用Phytotech常用植物培养基，实施例中生根培养基中所用到的1/2MS基础培养基是在常用的MS培养基基础上，减半使用大量和微量元素，培养基中含有30g/L蔗糖和5%的琼脂，pH=5.8。

实施例

一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，包括以下步骤：

1）材料消毒处理：采集5月底-7月初未成熟的楸树蒴果，用报纸包好，胶带封后带回实验室。用纱布沾取75%酒精消毒擦拭整个蒴果表面，除去蒴果表面杂质后，在酒精中浸泡1分钟后放入超净台。在无菌环境下将种子剥出，使用1%的次氯酸钠溶液消毒4分钟，用无菌水洗涤4次，锡箔纸封瓶口，于冰箱中4℃保存过夜，次日再次使用1%浓度次氯酸钠溶液消毒4分钟，无菌水洗涤4次。剥去种皮，取幼胚作为外植体材料。

2）外植体的获得：将幼胚平铺在不同的愈伤诱导培养基上进行初级诱导培养，其中，愈伤诱导培养基的组分见表1。将培养基置于25±2℃，黑暗条件下培养14天诱导出无菌幼苗，结果见图1所示，从图中可看出，大多数培养基均可诱导出苗。

3）将诱导出的幼苗继续生长14天后，将无菌苗的子叶和下胚轴为外植体继续放在原来的培养基诱导愈伤组织（表1）。黑暗条件下培养14天，按分化出芽的愈伤块/总的愈伤组织块进行统计愈伤组织诱导率，结果见表1，并将诱导出愈伤组织后转移到不定芽诱导培养基。尽管所有的初级培养基都可以诱导出苗和愈伤组织，但是只有使用编号为N27的培养基进行初级培养和愈伤组织诱导，后期分化阶段诱导出来不定芽的效率最高。初级培养及最适愈伤组织诱导培养基为基本培养基MS中加入0.05 mg/L 6-BA，0.6 mg/L TDZ，0.4 mg/L ZT，0.4 mg/L GA3，30g/L的蔗糖和3g/L的凝胶，pH=5.9。培养基置于25±2℃，光照强度2500 lx，光照时间16 h/d。

表1诱导无菌幼苗和以幼苗子叶和下胚轴为外植体诱导愈伤组织的培养基

4）不定芽的诱导：将2）中获得子叶和下胚轴愈伤组织，按照随机分配的方式，分别放在配方如表2所示的1-24号培养基上进行诱导分化。诱导10-15天后，编号为N27培养基诱导的子叶和下胚轴，在分化培养基编号为W02和D02通过愈伤组织间接途径产生不定芽（图2和图3）不定芽分化效率达到80%左右。分化效率为诱导丛生芽数/愈伤组织块数×100%，具体结果如表3所示，其他培养基组合的不定芽再生率均低于该组合。由此可见，诱导分化的最适培养基为基本培养基DKW或WPM中加入2.0 mg/L 6BA，3 g/L凝胶，pH为5.9。

表2不定芽分化培养基

表3 子叶诱导出不定芽的愈伤诱导培养基及分化培养基组合

5） 继代及生根培养：当不定芽长至1-1.5 cm长时，将不定芽转到继代培养基培养，如图4所示，继代培养基为DKW中加入2.0 mg/L 6BA，0.1 mg/L IBA，30g/L蔗糖，3g/L凝胶，pH为5.8。待不定芽伸长到3 cm左右，将不定芽接种在生根培养基诱导生根如图5所示。培养条件为温度25±2℃，光照强度2500 lx，光照时间16 h/d；所述生根培养基为1/2MS+0.3 mg/L的IBA，30g/L蔗糖，5 g/L的琼脂，pH为5.8。

6） 炼苗移栽：继代培养30天后，将生根苗从培养瓶取出，洗净根上培养基，移栽到泥炭土：蛭石(体积比)=4：1的基质上，浇透水遮荫一周后，在林科院气候控制室栽培管理，得到完整的楸树植株。

本发明的方法采用楸树幼胚子叶和下胚轴为外植体获得再生植株，通过优化后的培养基，提高了愈伤组织和不定芽的诱导效率，解决了以楸树幼胚为材料的植株再生技术难题；此外，子叶和下胚轴可通过相同的愈伤组织诱导培养基和不定芽分化培养基获得再生植株，简化了操作步骤，可以同一时间获得大量的植株材料应用于生产和科研。

Claims (8)

1.一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1）采集楸树未成熟种子，清洗消毒后，拨出幼胚；

2）将所得幼胚接种到初级诱导培养基进行暗培养获得幼苗，初级诱导培养基为基本培养基MS中加入0.05 mg/L 的6-BA，0.6 mg/L的 TDZ，0.4 mg/L的 ZT，0.4 mg/L的GA3，30g/L的蔗糖和3g/L的凝胶，pH=5.9；

3）将14天苗龄的子叶和下胚轴分别转移到愈伤诱导培养基进行暗培养；

4）将诱导出的愈伤组织转接到分化培养基，光下培养，诱导出不定芽；

5）将获得的不定芽继代培养及生根培养；

6）移栽炼苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1）中，未成熟种子为指5月底-7月初未成熟的楸树蒴果。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，消毒为将未成熟种子先用酒精中浸泡1分钟后，将种子剥出，用1%的次氯酸钠溶液消毒4分钟，用无菌水洗涤3~5次，于4℃保存过夜，次日再次使用1%浓度次氯酸钠溶液消毒3~5分钟，无菌水洗涤4次，剥去种皮，拨出幼胚。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2）和3）中，进行暗培养的时间为14天，培养温度为25±2℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3）中，愈伤组织诱导培养基为基本培养基MS中加入0.05 mg/L 的6-BA、0.6 mg/L TDZ，0.4 mg/L ZT、0.4 mg/L的GA3，30g/L蔗糖，3 g/L的凝胶，其pH为5.9。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4）中，分化培养基为基本培养基DKW或WPM中加入2.0 mg/L 的6BA，30g/L蔗糖，3 g/L的凝胶，其pH为5.9。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤5）中，继代培养的培养基为DKW中加入2.0 mg/L的 6BA、0.1 mg/L 的IBA、3g/L的凝胶和30g/L的蔗糖，其pH为5.8。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤6）中，生根培养的培养基为1/2MS中加有浓度为0.2-0.5mg/L的IBA， 30g/L的蔗糖和5 g/L的琼脂，pH为5.8；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500 lx，光照时间16 h/d。

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