CN109329064A - 一种提高楸树增殖系数的组织培养方法及专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高楸树增殖系数的组织培养方法，是通过初代培养获取初代无菌苗，再将苗切成1.5‑2.0cm的带芽茎段，接种到继代培养基中进行扩繁增殖，由愈伤组织分化得到丛生芽进而诱导生根获得楸树小植株；其中所述继代培养基的配方是：N6培养基，加入0.1～0.2mg/L的NAA，0.8～0.9mg/L的6‑BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～6.0。本发明的方法在促进腋芽增殖的基础上，同时促进愈伤诱导，在愈伤基础上促进丛生芽的分化以实现在同等的生长周期内可获得更大量的芽，为楸树良种繁育开辟了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种楸树的组织培养方法，尤其涉及一种提高楸树增殖系数的组织培养方法及专用培养基，属于林木良种繁育领域。
背景技术
楸树(Catalpa bungei C.A.Meyer.)为紫葳科，梓树属，在我国已有2000多年的栽培历史，是我国珍贵优质用材树种和名贵的园林观赏树种，已被列入国家木材战略储备树种目录。由于自花授粉的不亲和性，楸树往往开花不结实；即使不同无性系混栽在一起，经昆虫传粉能够结实，但结实很少，种子发芽率很低，实生繁殖较为困难。楸树为难生根树种，扦插繁殖成活率低，且现有的有关扦插技术因操作要求高，或需要设施条件，或费工费时成本高，不易在实际生产中推广应用。埋根繁殖虽比较容易，但埋根繁殖因其繁殖材料相对较少，客观上制约了繁育的规模。采用嫁接繁殖的方法时，首先要培育砧木，目前砧木培育多采用梓树播种育苗方式，但播种后至少需2年才能达到嫁接砧木所需粗度，存在砧木培育生产周期长的缺点。综上方法都不能更好地解决对楸树的快速繁育问题。
组织培养技术可以在人为控制范围内，以较短的周期大量繁殖种苗。其最大的特点就是速度快和产量大。
杨燕等人发表于《林业科技开发》的“楸树腋芽增殖快繁技术研究”中公开楸树初代最适培养基：N6+6-BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L；继代培养最适培养基：N6+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+Vc100mg/L+稀土2mg/L；生根培养最适培养基：N6+NAA1.0mg/L。
韩创举等人发表于《西北林学院学报》的“楸树组培技术研究”中报道，如下培养基N6+6-BA1.5mg/L+NAA0.0016mg/L是楸树的最佳增殖培养基，最高增殖系数为7.2。
傅玉兰等人发表于《林业科技开发》的“楸树试管丛生芽继代增殖影响因素的研究”中报道，楸树丛生芽继代增殖最适宜培养配方是MS+IBA0.5mg/L+BA4.0mg/L+PVP(100mg/L)+食糖30g/L+琼脂0g/L，最高增殖系数为4.8，且培养周期为35天。
中国发明专利CN104054580A“一种提高楸树增殖系数的组织培养方法”中公开的最佳腋芽诱导培养基配方为MS+BA0.8mg/l+IBA0.1mg/L；最佳腋芽增殖培养基配方为MS+BA1.5mg/L+ZT0.1mg/L+IAA0.2mg/L；最高增殖系数为15。但其增殖主要通过腋芽诱导和腋芽增殖两部分实现。
上海杉一植物科技有限公司申请的发明专利CN 104719136 A公开的“楸树组培苗生根培养方法”中提到，此发明在继代中的限定以MS为基础培养基，在生根阶段限定以MS1/2为基础培养基，控制其扩繁比例为1:3～3.5。
中国发明专利CN106818470 A“一种提高楸树增殖系数的组织培养方法”中公开以楸树成熟的种子作为外植体进行愈伤诱导40天获得愈伤组织；再将内部胚性愈伤组织继代培养20天；将再次获得的愈伤组织接种于分化培养基上，培养30天获得楸树再生芽。该方法步骤繁琐，时间跨度较长，增殖率也不高。
综合分析上述方法，所述的组培增殖大多是主要集中在促进腋芽增殖。经检索，有关在促进腋芽增殖的基础上，同时促进愈伤诱导，在愈伤基础上促进丛生芽的分化以实现在同等的生长周期内可获得更大量的芽的提高楸树增殖系数的组织培养方法及专利还未见报道。
发明内容
为了解决楸树生产中的存在的步骤繁琐、生长周期过长、增殖率不高等问题，本发明要解决的问题是提供一种提高楸树增殖系数的组织培养方法及专用培养基。
本发明所述提高楸树增殖系数的组织培养方法，步骤是：
(1)选取剪成长10±5cm的当年生楸树带腋芽的茎段或顶芽，剪去叶片保留1～2cm的叶柄，用洗洁精清液浸泡5～10min后再置于流水下冲洗20～30min；在超净工作台上，用75％的酒精浸泡30s，然后用0.1％的升汞处理5～8min，用无菌水冲洗3-4次后再次将叶柄剪短至3～5mm以免有残留，接种至初代培养基中，每瓶培养基接种2-3株茎段，初代培养至少28天，获取初代无菌苗；
(2)待初代无菌苗长成后，将苗子取出，切成1.5-2.0cm的带芽茎段，再接种到继代培养基中，每瓶培养基接种1-2株，进行扩繁增殖；7-10天后，在继代培养基中开始出现愈伤组织以及丛生芽萌发，28天后由愈伤组织分化得到高度5±0.5cm的丛生芽5-10棵，进一步诱导生根即可获得楸树小植株；
其特征在于；
所述初代培养基的配方是：MS培养基+6-BA 0.5±0.1mg/L+IAA 0.15±0.02mg/L，初代培养的条件是温度25±1℃无菌培养，光照时间为16±1h/d，光照强度为1800±100lx；
所述继代培养基的配方是：N6培养基，加入0.1～0.2mg/L的NAA，0.8～0.9mg/L的6-BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～6.0；继代培养的条件是温度25±1℃无菌培养，光照时间为16±1h/d，光照强度为1800±100lx。
上述提高楸树增殖系数的组织培养方法中：所述初代培养基的配方优选是：MS培养基+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.15mg/L，初代培养的条件优选是温度25℃无菌培养，光照时间为16h/d，光照强度为1800lx。
上述提高楸树增殖系数的组织培养方法中：所述继代培养基的配方优选是：N6培养基，加入0.1mg/L的NAA，0.8mg/L的6-BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～5.9；继代培养的条件优选是温度25℃无菌培养，光照时间为16h/d，光照强度为1800lx。
本发明所述提高楸树增殖系数的组织培养方法的专用培养基，其特征在于：所述培养基是初代培养基和继代培养基，其中初代培养基的配方是：MS培养基+6-BA 0.5±0.1mg/L+IAA 0.15±0.02mg/L；继代培养基的配方是：N6培养基，加入0.1～0.2mg/L的NAA，0.8～0.9mg/L的6-BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～6.0。
进一步优选的实施方式是：所述初代培养基的配方是：MS培养基+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.15mg/L；所述继代培养基的配方是：N6培养基，加入0.1mg/L的NAA，0.8mg/L的6-BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～5.9。
本发明公开的提高楸树增殖系数的组织培养方法在继代组培苗的增殖中，获得初代无菌组培苗后将原有愈伤清理干净，转接至增殖培养基中，愈伤组织分化十分明显，由愈伤组织分化得到的丛生芽数量可观。相对于只对腋芽进行增殖，在此基础上确保在短期的时间内获得更多的继代组培苗，步骤简单，实现了组培快繁的特点和实用性。
申请人从多次实验筛选比较的结果来看，本发明公开的专用培养基特别是继代增殖培养基(N6+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L)对楸树的芽增殖有较好的效果，有效的解决了在扩繁过程中的增殖问题。增殖数量可达5-10棵，愈伤组织分化的出芽率为5-8，而已有的其它配方增殖效果仅在0-3棵之间，效果不佳。
本发明提供的提高楸树增殖系数的组织培养方法在促进腋芽增殖的基础上，同时促进愈伤诱导，在愈伤基础上促进丛生芽的分化以实现在同等的生长周期内可获得更大量的芽，为楸树良种繁育开辟了新的途径，具有很大的应用前景。
附图说明
图1楸树初代无菌苗。
图2楸树初代无菌苗继代培养扩繁增殖后，在继代培养基中出现的愈伤组织及萌发的丛生芽。
图3楸树初代无菌苗继代培养扩繁增殖后萌发的丛生芽。
具体实施方式
一般性说明：
实施例所用楸树供试材料为“鲁楸1号”，取自山东省林科院试验苗圃。
实施例所用试剂，琼脂等均为市售产品，所述组培方法均为常规方法。
实施例1提高楸树增殖系数的组织培养方法
(1)选取剪成长10cm的当年生楸树带腋芽的茎段或顶芽，剪去叶片保留1.5cm的叶柄，用洗洁精清液浸泡10min后再置于流水下冲洗20min；在超净工作台上，用75％的酒精浸泡30s，然后用0.1％的升汞处理5min，用无菌水冲洗4次后再次将叶柄剪短至3mm以免有残留，接种至初代培养基中，每瓶培养基接种2-3株茎段，初代培养至少28天，获取初代无菌苗；
其中，所述初代培养基的配方是：MS培养基+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.15mg/L，初代培养的条件是温度25℃无菌培养，光照时间为16h/d，光照强度为1800lx。
(2)待初代无菌苗长成后，将苗子取出，切成1.5cm的带芽茎段，再接种到继代培养基中，每瓶培养基接种1-2株，进行扩繁增殖；7-10天后，在继代培养基中开始出现愈伤组织以及丛生芽萌发，28天后由愈伤组织分化得到高度5±0.5cm的丛生芽5-10棵，进一步诱导生根即可获得楸树小植株；
其中，所述继代培养基的配方是：N6培养基，加入0.1mg/L的NAA，0.8mg/L的6-BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～5.9；继代培养的条件是温度25℃无菌培养，光照时间为16h/d，光照强度为1800lx。
实施例2
供试材料为“鲁楸1号”。
(1)外植体的选取：在山东省林科院试验苗圃，剪取当年生楸树(鲁楸1号)新发嫩梢长约10-15cm，去掉叶片，带回实验室备用，采枝工作要在晴天进行。
(2)外植体的灭菌：剪去嫩茎上的叶片保留1～2cm的叶柄，用洗洁精浸泡清洗茎段5～10min后，再放在流水下冲洗干净。在超净工作台上，先用75％的酒精浸泡30s，再放入0.1％的升汞中浸泡5～8min，然后用无菌水清洗3-4次。再次将叶柄剪短至3～5mm以免有残留。
(3)无菌苗的培养：将灭菌过的外植体剪成1.5cm左右长的带腋芽茎段，接入MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.15mg/L的初代培养基中，每瓶接种2-3个茎段，初代培养的条件是温度25℃无菌培养，光照时间为16h/d，光照强度为1800lx。初代培养至少28天，获取初代无菌苗。
(4)继代组培苗的增殖：待初代无菌苗长成后，将苗子取出，切成1.5-2.0cm的带芽茎段，再接种到继代培养基中，每瓶培养基接种1-2株，进行扩繁增殖；7-10天后，在继代培养基中开始出现愈伤组织以及丛生芽萌发，28天后由愈伤组织分化得到高度5±0.5cm的丛生芽5-10棵，进一步诱导生根即可获得楸树小植株；其中，所述继代培养基的配方是：N6培养基，加入0.1mg/L的NAA，0.8mg/L的6-BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～5.9；继代培养的条件是温度25℃无菌培养，光照时间为16h/d，光照强度为1800lx。
基于上述实验基础，为了解决楸树难生根带来的无法快速繁殖问题，在对“鲁楸1号”新品种无菌体系建立的同时，本试验进行了楸树增殖最适宜培养基配方的筛选，利用N6培养基为基础培养基，选择添加6-BA(细胞分裂素)、IAA(生长素)、NAA(生长素)激素来进行筛选，试图找到快速扩繁的新方法。继代增殖培养基配方具体如下：见表1。
表1：继代增殖培养基配方列表
以实施例2所述方法为基础，经过多次实验筛选比较，实验结果显示，表1中配方9即培养基N6+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L对楸树的芽增殖有较好的效果，有效的解决了在扩繁过程中的增殖问题。增殖数量可达5-10棵，而其它配方增殖效果在0-3棵之间，效果不佳。因此配方9为最佳增殖培养基配方，是本发明所述提高楸树增殖系数的组织培养方法的专用培养基配方。
Claims (5)
1.一种提高楸树增殖系数的组织培养方法，步骤是：
(1)选取剪成长10±5cm的当年生楸树带腋芽的茎段或顶芽，剪去叶片保留1～2cm的叶柄，用洗洁精清液浸泡5～10min后再置于流水下冲洗20～30min；在超净工作台上，用75％的酒精浸泡30s，然后用0.1％的升汞处理5～8min，用无菌水冲洗3-4次后再次将叶柄剪短至3～5mm以免有残留，接种至初代培养基中，每瓶培养基接种2-3株茎段，初代培养至少28天，获取初代无菌苗；
(2)待初代无菌苗长成后，将苗子取出，切成1.5-2.0cm的带芽茎段，再接种到继代培养基中，每瓶培养基接种1-2株，进行扩繁增殖；7-10天后，在继代培养基中开始出现愈伤组织以及丛生芽萌发，28天后由愈伤组织分化得到高度5±0.5cm的丛生芽5-10棵，进一步诱导生根即可获得楸树小植株；
其特征在于；
所述初代培养基的配方是：MS培养基+6-BA 0.5±0.1mg/L+IAA 0.15±0.02mg/L，初代培养的条件是温度25±1℃无菌培养，光照时间为16±1h/d，光照强度为1800±100lx；
所述继代培养基的配方是：N6培养基，加入0.1～0.2mg/L的NAA，0.8～0.9mg/L的6-BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～6.0；继代培养的条件是温度25±1℃无菌培养，光照时间为16±1h/d，光照强度为1800±100lx。
2.根据权利要求1所述提高楸树增殖系数的组织培养方法，其特征在于：所述初代培养基的配方是：MS培养基+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.15mg/L，初代培养的条件是温度25℃无菌培养，光照时间为16h/d，光照强度为1800lx。
3.根据权利要求1所述提高楸树增殖系数的组织培养方法，其特征在于：所述继代培养基的配方是：N6培养基，加入0.1mg/L的NAA，0.8mg/L的6-BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～5.9；继代培养的条件是温度25℃无菌培养，光照时间为16h/d，光照强度为1800lx。
4.权利要求1所述提高楸树增殖系数的组织培养方法的专用培养基，其特征在于：所述培养基是初代培养基和继代培养基，其中初代培养基的配方是：MS培养基+6-BA 0.5±0.1mg/L+IAA 0.15±0.02mg/L；继代培养基的配方是：N6培养基，加入0.1～0.2mg/L的NAA，0.8～0.9mg/L的6-BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～6.0。
5.根据权利要求4所述的专用培养基，其特征在于：所述初代培养基的配方是：MS培养基+6-BA 0.5mg/L+IAA0.15mg/L；所述继代培养基的配方是：N6培养基，加入0.1mg/L的NAA，0.8mg/L的6-BA以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值到5.8～5.9。
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