CN110305894A - 一种快速高效的楸遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速高效的楸遗传转化方法。本方法利用楸子叶为外植体诱导胚性愈伤组织，然后进行农杆菌介导的遗传转化，主要步骤：遗传转化受体的获得与增殖，包括子叶愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的诱导和增殖；携带目的基因的农杆菌的制备；胚性愈伤组织的遗传转化；植株再生及生根；再生植株检测；转基因植株炼苗及移栽。采用本发明的方法对楸进行遗传转化，80‑100天获得阳性转化植株，转化效率92.23%‑97.14%。本发明周期短、操作简单、遗传转化效率高，为楸基因功能验证及分子育种提供了重要的技术支撑，加快了楸新品种的培育进程。

Description

一种快速高效的楸遗传转化方法
技术领域
本发明属于植物的遗传转化体系的构建方法领域，涉及一种快速高效的楸遗传转化方法。
背景技术
楸（Catalpa bungei）是紫葳科（Bignoniaceae）梓属（Catalpa Scop.）的珍贵的木材树种，且在园林观赏、生态防护、城市绿化等方面均有重要作用，自古以来就有“木王”美誉，具有非常高的科学价值和开发利用价值。
楸适应能力极强，生长迅速，分布于我国东起海滨，西至甘肃，南始云南，北到长城的广大区域，是可以大面积栽培的珍贵优质树种。然而，近年来楸病虫害严重，限制了其推广进程。因此，提高楸的抗病虫性，培育抗病虫优质楸新品种是目前迫切需要解决的主要问题。
自然状态下，楸树自交不亲和，不结实或结实率低，繁育多通过扦插和嫁接的方式，技术环节多，育苗周期长。长期的无性繁殖导致品种、类型和无性系单一化，加之过度的开发利用，造成楸资源匮乏。另外，楸的遗传改良主要是通过杂交育种的方式进行，但常规育种周期漫长，品种改良受到限制。利用现代分子生物学和基因工程技术，将目标基因整合到楸基因组中，获得相应的性状，快速、高效、目的性强，极大加快了育种的速度、提高了育种的效率，是解决抗病虫楸树新品种培育的有效手段。近几年来，有关楸树组织培养技术的研究开展较多，如杨燕等人发表于《林业科技开发》的“楸树腋芽增殖快繁技术研究”；韩创举等人发表于《西北林学院学报》的“楸树组培技术研究”；中国发明专利CN104054580A“一种提高楸树增殖系数的组织培养方法”等等。然而，目前，关于楸遗传转化的研究少有报道，仅中国发明专利CN107058374A “一种楸树遗转化体系的构建方法”，与之相比，本发明无需超声波处理辅助侵染转化既已达到92.23%-97.14%的高效转化率，且操作简单，周期短。
发明内容
本发明提供了一种快速高效的楸遗传转化方法，利用楸子叶为外植体诱导胚性愈伤组织发生，进而进行农杆菌介导的遗传转化和植株再生，为楸树利用转基因技术培育抗病虫的新品种提供一个成熟的技术途径，以期达到加快楸分子育种进程和生产转基因植株的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
1. 遗传转化受体的获得与增殖：
a) 子叶愈伤组织的诱导：成熟的楸种子经75%酒精表面灭菌60 s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1%氯化汞溶液18 min，无菌水冲洗5次后平铺于愈伤诱导培养基上，25-28℃，暗培养20 d，获得愈伤组织；
b) 胚性愈伤组织的诱导：将诱导出的黄绿色子叶愈伤组织转置于胚性愈伤组织诱导培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代，直至产生胚性愈伤组织；
c) 胚性愈伤组织的增殖：将诱导出的胚性愈伤组织转置于胚性愈伤组织增殖培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代，使胚性愈伤增殖，以满足后续的遗传转化需求；
2. 携带目的基因的农杆菌的制备：将含有目的基因的植物表达载体通过冻融法导入农杆菌感受态中，挑取单克隆，目的基因PCR检测确定阳性单克隆后，过夜摇菌，收集菌体，由重悬液MS0 (l)重悬；
3. 胚性愈伤组织的遗传转化：将增殖的胚性愈伤组织接入重悬的农杆菌菌液中，菌液完全浸没胚性愈伤组织，100 rpm，20-30 min，吸水纸吸干胚性愈伤组织表面的菌液后，平铺于共培养培养基MS0 (s)，25-28℃，暗培养24-48 h；
4. 植株再生及生根：将共培养后的胚性愈伤组织转置于添加抗生素的分化培养基，并将其堆积为大小合适的愈伤堆，进行转化子的选择培养，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代至植株再生，再生苗株高2.5-4 cm转置于生根培养基中进行生根培养；
5. 再生植株检测：对步骤(4)中的抗性再生植株幼苗进行报告基因的表达检测，同时，取再生植株的叶片，提取DNA，进行目的基因的PCR检测；
6. 转基因植株炼苗及移栽：将根系健壮的转基因阳性苗的瓶盖拧开后放置7d炼苗，然后取出阳性苗，洗净根上滞留的培养基后移入装有营养土(泥炭土：珍珠岩=3:2)的花盆中并放置在保温棚中，一周后移出。
所述步骤1-4中的培养基均调节pH值到5.8-6.0。
所述步骤1 a)中的愈伤诱导培养基成分为MS + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L+ 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
所述步骤1 b)中的胚性愈伤组织诱导培养基成分为DKW + 6-BA 0.6 mg/L + NAA0.15 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
所述步骤1 c)中的胚性愈伤组织增殖培养基成分为MS + 6-BA 0.6 mg/L + NAA0.15 mg/L+ 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
所述步骤2中的重悬液是MS0 (l)，MS + 蔗糖30 g/L，重悬后的农杆菌菌液浓度为OD600 = 0.6-0.65。
所述步骤3中的共培养基是MS0 (s)，MS + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
所述步骤4中添加抗生素的分化培养基是DKW + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L + ZT 0.2 mg/L + 蔗糖30 g/L + 50-150 mg/L Kan + 琼脂3 g/L。转化胚性愈伤组织初次转置于含150 mg/L Kan的分化培养基，20 d后继代，转置于含100 mg/L Kan的分化培养基，20 d后，转置于含50 mg/L Kan的分化培养基。
所述步骤4中大小合适的愈伤堆直径为1-1.5 cm的胚性愈伤组织堆。
所述步骤5中的生根培养基是DKW + IBA 0.1 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 蔗糖20g/L+ 琼脂3 g/L。
本发明至少提供以下有益效果：
1. 本发明公开了一种快速高效的楸遗传转化方法。本发明提供了以楸子叶为外植体，进行胚性愈伤组织的诱导，以及增殖的方法，获得的胚性愈伤组织分化再生能力强，分化率达到100%。以此为遗传转化受体，转化受体细胞数量巨大，转化胚性细胞分化再生能力强，转化细胞产生的体细胞胚胎可以直接分化发育成为完整再生植株。
2.本发明通过农杆菌浸泡胚性愈伤组织的方法，将目的基因导入植株基因组中，无需超声波、真空液压等辅助处理，操作简单、周期短、遗传转化效率高。
3. 转化胚性愈伤组织经过3级逐级递减(150，100，50 mg/L Kan)的添加抗生素的分化培养基的筛选，大大提高了再生植株的阳性率并缩短周期。
4. 本发明以木本植物(楸)为材料，相比草本植物，木本植物体细胞胚胎再生体系建立困难，遗传转化效率低。本发明以诱导的分化再生能力强的胚性愈伤组织为受体进行楸的遗传转化，操作简单、周期短、遗传转化效率高，为转基因生产及基因功能验证提供重要的技术支撑，可用于楸的分子遗传改良，为楸种质资源创新提供新种质材料，也为其他林木树种的分子育种提供试验参考依据。
附图说明
图1 楸子叶胚性愈伤组织的诱导与增殖。A，胚性愈伤组织；B，胚性愈伤组织转置于增殖培养基10 d、30 d后的表型(C)。
图2 楸胚性愈伤组织为受体的遗传转化。A，携带目的基因的农杆菌的制备；B，转化胚性愈伤转置于添加抗生素的分化培养基上筛选及分化培养；C，转基因再生植株；D，再生植株幼苗GUS染色分析。
图3 转基因再生植株目的基因的PCR检测。M，Marker；P，质粒阳性对照；1-11，随机挑选的转基因再生植株目的基因的PCR检测。
图4 转基因植株炼苗及移栽。A，炼苗；B，移栽；C，移入保温棚；D，炼苗后的转基因阳性苗。
具体实施方式
实施方案1
以农杆菌EHA105侵染为例对本发明作进一步的说明。需要说明的是农杆菌感受态的制备、农杆菌感受态的质粒转化、阳性转化子的检测与以前的方法没有区别。
(1) 遗传转化受体的获得与增殖
a) 子叶愈伤组织的诱导：将成熟的楸种子75%酒精表面灭菌60 s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1%氯化汞溶液18 min，无菌水冲洗5次后，平铺于愈伤诱导培养基上，25-28℃，暗培养20 d，获得愈伤组织，为黄绿色，致密的愈伤组织；
b) 胚性愈伤组织的诱导：将诱导出的黄绿色子叶愈伤组织转置于胚性愈伤组织诱导培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代一次，10%愈伤褐化，经继代2-3次后在褐化愈伤上产生了胚性愈伤组织，为浅黄色、紧致、表面上呈颗粒状的愈伤组织；
c) 胚性愈伤组织的增殖：将诱导出的胚性愈伤组织转置于胚性愈伤组织增殖培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代一次，使胚性愈伤增殖，以满足后续的遗传转化需求。
(2) 携带目的基因的农杆菌的制备
将植物表达载体pCambia2300 ( Kan抗性、GUS报告基因) 通过冻融法导入农杆菌感受态中，挑取单克隆，GUS基因PCR检测确定阳性单克隆后，过夜摇菌，收集菌体，重悬液重悬至OD600=0.6。
(3) 胚性愈伤组织的遗传转化
将增殖的胚性愈伤组织接入重悬的农杆菌菌液中，菌液完全浸没胚性愈伤组织，100rpm，20 min，吸水纸吸干胚性愈伤组织表面的菌液后，平铺于共培养培养基，25-28℃，暗培养48 h。
(4) 植株再生及生根
将共培养后的胚性愈伤组织转置于含150 mg/L Kan的分化培养基上，并将其堆积为大小合适的愈伤堆，进行转化子的选择培养，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养；20 d后，将存活的抗性胚性愈伤组织转置于含100 mg/L Kan的分化培养基上，培养20 d后，再将存活的抗性胚性愈伤组织转置于含50 mg/L Kan的分化培养基上，逐级筛选，存活的抗性胚性愈伤组织和再生植株可进行后续的GUS染色鉴定阳性；2-3个月即可获得再生苗，再生苗株高2.5-4 cm后，剪切再生苗，将其茎秆插入生根培养基中，生根培养。
实施方案2-11是在实施方案1步骤(1) 遗传转化受体的获得与增殖的基础上进行，其遗传转化方法中所涉及的步骤与实施方案1类似，不同之处仅在于其中所涉及的技术参数的差别，具体如表1-3所示。
表1实施方案2-7中不同技术参数设置
表2实施方案8-10中不同技术参数设置
表3实施方案11-16中不同技术参数设置
结果显示，随着侵染农杆菌菌液浓度的提高，转化效率先增加后降低，最适浓度为OD600 = 0.60-0.65；而对于最佳侵染时间，不同的农杆菌菌株类型最佳侵染时间不同，EHA105为20 min，而GV3101为30 min；最佳的暗培养时间为48 h。
将实施方案1-16中获得的再生植株，按照本发明“一种快速高效的楸遗传转化方法”的步骤(5) 和(6)进行操作。
(5) 再生植株检测：对步骤(4)中的再生植株幼苗进行GUS染色检测，取再生植株的叶片，提取DNA，进行GUS基因的PCR检测。
GUS基因的特异性引物序列如下：GUS forward sequence：5’-TGAATCCGCACCTCTGG-3’，GUS reverse sequence：5’-TTCATTGTTTGCCTCCCT-3’。
结果表明抗性再生植株样本PCR获得约1100bp长度特异性片段，将该片段切胶、回收、测序，测序结果与GUS序列比对，序列一致性为100%。分批次检测了共计173株再生植株，阳性植株161株，阳性率达92.53%-97.14%。可见，经过了本发明“一种快速高效的楸遗传转化方法”中各个优化步骤的层层筛选，既可在最短时间内获得最多的转化胚性愈伤组织堆，又可高效获得遗传转化效率较高的转基因阳性植株。
(6) 转基因植株炼苗及移栽：将根系健壮的转基因阳性苗的瓶盖拧开后放置7d炼苗，然后取出阳性苗，洗净根上滞留的培养基后移入装有营养土(泥炭土：珍珠岩=3:2)的花盆中并放置在保温棚中，一周后移出。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种快速高效的楸遗传转化方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaatccgca cctctgg 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcattgttt gcctccct 18

Claims (10)

1.一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 遗传转化受体的获得与增殖：
a) 子叶愈伤组织的诱导：成熟的楸种子经75%酒精表面灭菌60 s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1%氯化汞溶液18 min，无菌水冲洗5次后平铺于愈伤诱导培养基上，25-28℃，暗培养20 d，获得愈伤组织；
b) 胚性愈伤组织的诱导：将诱导出的黄绿色子叶愈伤组织转置于胚性愈伤组织诱导培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代，直至产生胚性愈伤组织；
c) 胚性愈伤组织的增殖：将诱导出的胚性愈伤组织转置于胚性愈伤组织增殖培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代，使胚性愈伤增殖，以满足后续的遗传转化需求；
(2) 携带目的基因的农杆菌的制备：将含有目的基因的植物表达载体通过冻融法导入农杆菌感受态中，挑取单克隆，目的基因PCR检测确定阳性单克隆后，过夜摇菌，收集菌体，由重悬液MS0 (l)重悬；
(3) 胚性愈伤组织的遗传转化：将增殖的胚性愈伤组织接入重悬的农杆菌菌液中，菌液完全浸没胚性愈伤组织，100 rpm，20-30 min，吸水纸吸干胚性愈伤组织表面的菌液后，平铺于共培养培养基MS0 (s)，25-28℃，暗培养24-48 h；
(4) 植株再生及生根：将共培养后的胚性愈伤组织转置于添加抗生素的分化培养基，并将其堆积为大小合适的愈伤堆，进行转化子的选择培养，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代至植株再生，再生苗株高2.5-4 cm转置于生根培养基中进行生根培养；
(5) 再生植株检测：对步骤(4)中的抗性再生植株幼苗进行报告基因的表达检测，同时，取再生植株的叶片，提取DNA，进行目的基因的PCR检测；
(6) 转基因植株炼苗及移栽：将根系健壮的转基因阳性苗的瓶盖拧开后放置7d炼苗，然后取出阳性苗，洗净根上滞留的培养基后移入装有营养土(泥炭土：珍珠岩=3:2)的花盆中并放置在保温棚中，一周后移出。
2.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：所有培养基均调节pH值到5.8-6.0。
3.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：愈伤诱导培养基是MS + 6-BA (6-Benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤) 0.5 mg/L + NAA (1-Naphthylacetic aci，萘乙酸) 0.2 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
4.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：胚性愈伤组织诱导培养基是DKW + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
5.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：胚性愈伤组织增殖培养基是MS + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L+ 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
6.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：重悬液是MS0 (l)，MS + 蔗糖30 g/L，重悬后的农杆菌菌液浓度为OD600 = 0.6-0.65。
7.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：共培养培养基是MS0 (s)，MS + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
8.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：添加抗生素的分化培养基是DKW + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L + ZT (Zeatin，玉米素) 0.2 mg/L +蔗糖30 g/L + 50-150 mg/L Kan (Kanamycin，卡那霉素) + 琼脂3 g/L；转化胚性愈伤组织初次转置于含150 mg/L Kan的分化培养基，20 d后继代，转置于含100 mg/L Kan的分化培养基，20 d后，转置于含50 mg/L Kan的分化培养基。
9.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：生根培养基是DKW + IBA (Indole-3-Butytric acid，吲哚乙酸) 0.1 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 蔗糖20g/L+ 琼脂3 g/L。
10.如权利要求1所述的一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于：所述步骤(4)中大小合适的愈伤堆直径为1-1.5 cm的胚性愈伤组织堆。
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