CN106755084A

CN106755084A - 一种茶树快速转基因方法

Info

Publication number: CN106755084A
Application number: CN201710010263.4A
Authority: CN
Inventors: 郭玉琼; 常笑君; 程春振; 赖钟雄; 周子维; 朱晨; 林玉玲; 陈裕坤
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明提供了一种茶树快速转基因方法，属于转基因植物制备领域。本发明包括茶树实生幼苗的准备，转化载体根癌农杆菌侵染菌液的制备，实生茶树幼苗去顶芽或腋芽、根癌农杆菌侵染和共培养，抗性芽的筛选与培养，再生抗性芽的分子生物学鉴定，转基因植株的扦插扩繁等步骤。该方法完全不依赖植物组织培养，对直播的实生茶树幼苗的去顶芽或腋芽材料进行侵染，获得转基因植株；无需培育无菌试管苗，转基因抗性芽无需继代转接，在温室中进行不受气候与环境影响，周年可进行转化。具有操作简单、转基因效果显著、成本低、试验周期短等优点，为茶树转基因研究奠定了重要基础。

Description

一种茶树快速转基因方法

技术领域

本发明涉及一种茶树快速转基因方法，属于转基因植物制备领域，主要应用于茶树种质资源创新。

背景技术

转基因是一种定向改造植物遗传性状和创造新变异的手段，目前，茶树转基因成功的报道较少，主要是采用农杆菌转化法和基因枪转化法。茶树因富含儿茶素等多酚类物质被认为是一种较难被农杆菌侵染的植物，转化频率较低。茶树中的多酚类物质一方面作为一种抑菌剂，直接杀死农杆菌而影响转化率；另一方面作为蛋白质的沉淀剂，拮抗Vir基因产物（一种结合在膜上的受体蛋白），阻塞发根农杆菌的T-DNA向茶树细胞运转的通道，从而间接影响茶树的遗传转化。

以农杆菌介导的茶树转基因所用的外植体主要为体细胞胚，但是茶树的离体再生难度较大，且体胚的诱导、成熟和萌发需要较长的时间，周期长，成本高，最终转基因成功的报道仅1例：Mondal等建立的转化体系通过嫁接转基因嫩梢获得了转基因植株，迄今为止国内外尚未有一套稳定完善的农杆菌介导的茶树遗传转化培养体系。不受基因型影响的基因枪技术在茶树遗传转化方面的工作起步迟，缺乏全面系统的研究，还有不少问题有待解决，如仪器的可控性、准确性、精确性以及基因枪轰击后进入受体细胞DNA的生物学变化及其调控机理等。研究发现农杆菌与基因枪结合使用可以进一步提高茶树遗传转化效率，但尚未得到茶树转基因植株。

发明内容

本发明针对目前茶树转基因研究的技术空白，提供了一种茶树快速转基因的方法，完全不依赖植物组织培养，对直播的实生茶树幼苗的去顶芽/侧芽/腋芽材料进行侵染，获得转基因植株；无需培育无菌试管苗，转基因抗性芽无需继代转接，在温室中进行不受气候与环境影响，周年可进行转化。本方法操作步骤简便、转基因效果显著、成本降低、试验周期短。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种茶树快速转基因方法，包括以下步骤：

（1）茶树直播实生幼苗的准备；

（2）根癌农杆菌侵染液的制备；

（3）实生茶树幼苗去顶芽或腋芽、根癌农杆菌侵染和共培养；

（4）抗性芽的筛选与培养；

（5）再生抗性芽的分子生物学鉴定；

（6）转基因植株的扦插扩繁。

其中，步骤（1）所述的茶树直播实生幼苗的准备方法为：选取成熟的健康饱满的茶树种子，用单蒸水清洗后直播于营养土中， 25℃温室中暗培养至4片真叶期。

步骤（2）所述的转化载体根癌农杆菌侵染液的制备方法为：将携带pCAMBIA1301载体的根癌农杆菌菌液接种至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的25mL YEB液体培养基中，28℃、200rpm/min黑暗条件下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，4000 rpm离心5min收集菌体，并重悬于无抗生素、含100μM乙酰丁香酮和10 mmol/L MgCl₂的25 mL MS液体培养基中，28℃振荡培养2 h后调OD₆₀₀至0.6-0.8用于侵染。

步骤（3）所述的实生茶树幼苗去顶芽或腋芽、根癌农杆菌侵染和共培养的方法为：挑选生长良好的4片真叶期茶树幼苗，将其顶芽和腋芽去掉并保留真叶，用封口膜在其周围缠成漏斗状，用移液枪吸取OD₆₀₀为0.6-0.8的根癌农杆菌菌液打入漏斗至浸没切口，侵染40min后，弃盛有菌液的漏斗状封口膜，用封口膜封住切口保湿，在28℃下暗培养2天。

步骤（4）所述的抗性芽的筛选与培养方法为：暗培养2天后，将封口膜打开，用蘸有60 mg/L的潮霉素溶液的棉花擦拭切口处2次，并在切口处留有潮霉素溶液，再将封口膜包紧以筛选抗性芽，25℃下暗培养2-3周，当切口处长出抗性芽时转移到25℃下光照培养。

步骤（5）所述的再生抗性芽的分子生物学鉴定方法为：抗性芽长有2片叶以上时，取0.1g叶片，采用CTAB法提取基因组DNA；以pCAMBIA1301 载体GUS标记基因引物GUS-F/GUS-R进行PCR检测；同时以HYG标记基因引物HYG-F/HYG-R进行进一步PCR的检测验证，以未转化的再生植株DNA为阴性对照，将扩增产物回收、TA克隆和测序验证；所用到的引物序列为：

GUS-F/GUS-R：扩增片段大小为375 bp，

GUS-F：ACGTCCTGAAGAAACCCCAACC，

GUS-R：TCCCGGCAATAACATACGGCGT；

HYG-F/GUS-R：扩增片断大小为675 bp，

HYG-F：CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAG，

HYG-R：GAATCGGTCAATACACTACATGGC。

步骤（6）所述的转基因植株的扦插扩繁方法为：抗性芽长至10 cm左右有2/3木质化时即可剪取穂条，长度2.5-3.5 cm，带有一片成熟叶和一个饱满的腋芽，保证剪口平滑，稍有一定倾斜度，保持与母叶呈平行的斜面，为提高插穗的成活率，将剪口在62.5 g/L的生根粉溶液中浸泡1 min，然后斜插于被水浸润了的穴盘的营养土中，深度为插入插穗的2/3长度至叶柄与土层表面平齐，边插边将插穗附近的土稍压实，使插穗与土壤密接，以利于发根，插完立即浇水，使土壤保持湿润，25℃温室中遮光培养。

本发明经过多次重复试验发现，采用本方法可以在不依赖植物组织培养的情况下，以直播的实生茶树幼苗的去顶芽和腋芽为材料快速获得转基因植株。

本发明无需准备茶树无菌试管苗，无需诱导胚状体，无需继代转接抗性芽，直接在穴盘直播实生幼苗伤口处再生出抗性芽，扦插后的转基因插穗的生长和发育状况正常，每一个阳性的抗性芽即为一个转基因株系，在温室中不受气候与环境影响，可周年进行转化，所以本方法操作步骤简便、成本低、时间更短。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1. 本发明在茶树实生幼苗的培育上，筛选健康饱满的种子，经单蒸水清洗后，直播到穴盘的营养土中，出苗快、成本低、可周年进行。

2. 本发明选用在黑暗条件下生长约3周的去顶芽/腋芽的实生幼苗为侵染材料，茶树幼苗还未木质化，在去腋芽的伤口处生长代谢旺盛，芽的再分化能力强，容易诱导不定芽，有利于转化。

3. 本发明在转化过程中，切口处用可拉伸的封口膜缠绕成漏斗形，并注入根癌农杆菌侵染液，使其既不外漏又可与伤口充分接触，可提高转化效率；筛选剂擦拭切口处后，用封口膜将其封住，可起到保湿作用，防止抗性芽失水导致死亡。

4. 本发明为了提高不定芽的生长速度，对侵染后的幼苗进行暗培养2周，可使不定芽再生率达90%以上。

5. 经分子生物学鉴定，本发明所述的茶树快速转基因方法转化率在铁观音茶树中为7/86，在安吉白茶中为4/134，在龙井茶树中为2/79；且本发明将转基因枝条扦插到穴盘的营养土中，可得到独立的转移因植株。

附图说明

图1：转基因植株的GUS（375bp）检测：M：DL2000 Marker，CK：未转化茶树，H₂O：空白对照，1-12：转化1301的茶树植株。

图2：转基因植株的HYG（675bp）检测：M：DL2000 Marker，CK：未转化茶树，H₂O：空白对照，1-12：转化1301的茶树植株。

图3：营养土中播种的茶树实生幼苗。

图4：去顶芽和腋芽幼苗的侵染。

图5：茶树幼苗的再生抗性芽。

图6：转基因植株的扦插。

具体实施方式

实施例

1、茶树直播实生幼苗的准备

成熟的铁观音、安吉白茶和龙井茶树种子，筛选出健康饱满的种子，经单蒸水清洗后，直播于花盆的营养土中，与田间普通播种育苗基本相同。

本例用的营养土为泥炭土:蛭石:珍珠岩=2:1:1，播种后再盖上1 cm厚的营养土和沙土，然后浇水保湿促进发芽，25 ℃温室中暗培养至4片真叶期，备用。

2、根癌农杆菌侵染液的制备

于超净工作台上，将10 μL的pCAMBIA1301质粒加入到100 μL根癌农杆菌感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰浴30 min；液氮中冻存5 min，立即置于37 ℃温浴5 min，重复一次；冰浴2 min；于超净工作台上，加入400 μL无抗生素的YEB液体培养基，28 ℃，200 r/min振荡培养3~5 h；3000 r/min离心4 min；无菌条件下弃上清，加50 μL YEB液体培养基，混匀后均匀涂布在固体YEB（含50 mg/L Rif和50 mg/L Kan）平板上，静置5 min，28 ℃倒置暗培养48h，挑选单个菌落克隆，进行菌落PCR鉴定，阳性菌落备用。

挑选阳性克隆子至25 mL YEB液体培养基（含50 mg/L Rif和50 mg/L Kan）中28℃，200 r/min暗培养至OD₆₀₀为0.6~0.8，4000 rpm离心10 min，收集菌体，并重悬于无抗生素、含100 μM乙酰丁香酮和10 mmol/L MgCl₂的25 mL MS 液体培养基中，28 ℃振荡培养2h 后，调节OD₆₀₀至0.6~0.8用于侵染。

3、实生茶树幼苗去顶芽和腋芽材料的制备、侵染和共培养

挑选生长良好的4片真叶期铁观音、安吉白茶和龙井茶树幼苗，将其顶芽和腋芽去掉并保留真叶，用封口膜在其周围缠成漏斗状，用移液枪吸取OD₆₀₀为0.6~0.8的根癌农杆菌菌液，注入漏斗状封口膜浸没侵染切口，侵染40 min后，弃盛有菌液的漏斗状封口膜，将封口膜封住切口保湿，在28 ℃下暗培养2天。

4、抗性芽的筛选与培养

暗培养2天后，将封口膜打开，用蘸有60 mg/L的潮霉素溶液的棉花擦拭切口处2次，并在切口处留下一滴潮霉素溶液，再将封口膜包紧以筛选抗性芽，25 ℃下暗培养2~3周，当切口处长出抗性芽时转移到25 ℃下光照培养。

5、再生抗性芽的分子生物学鉴定

抗性芽长有2片叶片以上时，取0.1 g叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，以pCAMBIA1301载体GUS标记基因引物（GUS-F：ACGTCCTGAAGAAACCCCAACC；GUS-R：TCCCGGCAATAACATACGGCGT，扩增片断375 bp）进行PCR检测（PCR反应程序：94 ℃预变性4min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存），再以HYG标记基因（引物HYG-F：CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAG；HYG-R：GAATCGGTCAATACACTACATGGC，扩增片断650 bp）进行PCR进一步的检测验证（PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存），以未转化的再生植株DNA为阴性对照，再进行抗性芽扩增产物的回收、TA克隆和测序验证。

经分子生物学鉴定，本发明所述的茶树快速转基因方法获得的转化芽中GUS基因和HYG基因经多次PCR检测仍为阳性，转化率在铁观音茶树中为8.14%（7/86），在安吉白茶中为2.98%（4/134），在龙井茶树中为2.53%（2/79），经测序验证，PCR扩增产物序列特异片段序列相似度为100%，说明PCR检测结果稳定、可靠。

6. 转基因植株的扦插

抗性芽长至10 cm左右有2/3木质化时即可剪取穂条，所剪长度约3 cm，带有一片成熟叶和一个饱满的腋芽，保证剪口平滑，稍有一定倾斜度，保持与母叶呈平行的斜面，为提高插穗的成活率，将剪口在62.5 g/L的生根粉溶液中浸泡1 min，然后斜插于被水浸润了的穴盘营养土中，深度为插入插穗的2/3长度至叶柄与土层表面平齐。边扦插边将插穗附近的土稍压实，使插穗与土壤充分接触，以利于发根。扦插后立即浇水，25 ℃温室中遮光培养。在转基因插条生长过程中，还可多次进行分子生物学鉴定。

7、转基因所用各类材料的回收处理

对转基因过程中所使用的各类材料包括穴盘、封口膜、镊子、侵染液和营养土等进行回收与灭菌处理，防止转化的质粒向环境释放。

本发明创建的以直播实生茶树幼苗为外植体的根癌农杆菌介导法是在温室下进行的，避免了茶树组织培养大量的繁琐过程，避免了试管苗的无菌培养及不定芽继代转接过程，成本低、操作简便、可周年进行。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种茶树快速转基因方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> GUS-F

<400> 1

acgtcctgaa gaaaccccaa cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> GUS-R

<400> 2

tcccggcaat aacatacggc gt 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> HYG-F

<400> 3

ctatttcttt gccctcggac gag 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> HYG-R

<400> 4

gaatcggtca atacactaca tggc 24

Claims

1.一种茶树快速转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）茶树直播实生幼苗的准备；

（2）根癌农杆菌侵染液的制备；

（4）抗性芽的筛选与培养；

（5）再生抗性芽的分子生物学鉴定；

（6）转基因植株的扦插扩繁。

2. 根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（1）所述的茶树直播实生幼苗的准备方法为：选取成熟的健康饱满的茶树种子，用单蒸水清洗后直播于营养土中， 25℃温室中暗培养至4片真叶期。

3. 根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（2）所述的转化载体根癌农杆菌侵染液的制备方法为：将携带pCAMBIA1301载体的根癌农杆菌菌液接种至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的25mL YEB液体培养基中，28℃、200rpm/min黑暗条件下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，4000 rpm离心5min收集菌体，并重悬于无抗生素、含100μM乙酰丁香酮和10 mmol/L MgCl₂的25 mL MS液体培养基中，28℃振荡培养2 h后调OD₆₀₀至0.6-0.8用于侵染。

4.根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（3）所述的实生茶树幼苗去顶芽或腋芽、根癌农杆菌侵染和共培养的方法为：挑选生长良好的4片真叶期茶树幼苗，将其顶芽和腋芽去掉并保留真叶，用封口膜在其周围缠成漏斗状，用移液枪吸取OD₆₀₀为0.6-0.8的根癌农杆菌菌液打入漏斗至浸没切口，侵染40min后，弃盛有菌液的漏斗状封口膜，用封口膜封住切口保湿，在28℃下暗培养2天。

5. 根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（4）所述的抗性芽的筛选与培养方法为：暗培养2天后，将封口膜打开，用蘸有60 mg/L的潮霉素溶液的棉花擦拭切口处2次，并在切口处留有潮霉素溶液，再将封口膜包紧以筛选抗性芽，25℃下暗培养2-3周，当切口处长出抗性芽时转移到25℃下光照培养。

6. 根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（5）所述的再生抗性芽的分子生物学鉴定方法为：抗性芽长有2片叶以上时，取0.1g叶片，采用CTAB法提取基因组DNA；以pCAMBIA1301 载体GUS标记基因引物GUS-F/GUS-R进行PCR检测；同时以HYG标记基因引物HYG-F/ HYG-R进行进一步PCR的检测验证，以未转化的再生植株DNA为阴性对照，将扩增产物回收、TA克隆和测序验证；所用到的引物序列为：

GUS-F/GUS-R：扩增片段大小为375 bp，

GUS-F：ACGTCCTGAAGAAACCCCAACC，

GUS-R：TCCCGGCAATAACATACGGCGT；

HYG-F/GUS-R：扩增片断大小为675 bp，

HYG-F：CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAG，

HYG-R：GAATCGGTCAATACACTACATGGC。

7. 根据权利要求1所述的一种茶树快速转基因方法，其特征在于步骤（6）所述的转基因植株的扦插扩繁方法为：抗性芽长至9-11 cm有2/3木质化时即可剪取穂条，长度2.5-3.5cm，带有一片成熟叶和一个饱满的腋芽，保证剪口平滑，稍有一定倾斜度，保持与母叶呈平行的斜面，为提高插穗的成活率，将剪口在62.5 g/L的生根粉溶液中浸泡1 min，然后斜插于被水浸润了的穴盘的营养土中，深度为插入插穗的2/3长度至叶柄与土层表面平齐，边插边将插穗附近的土稍压实，使插穗与土壤密接，以利于发根，插完立即浇水，使土壤保持湿润，25℃温室中遮光培养。