CN112544440A - 块根植物的转基因或基因编辑新苗的培育方法 - Google Patents

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Abstract

块根植物的转基因或基因编辑新苗的培育方法，包括：用携带质粒的发根农杆菌侵染块根植物的茎部，培养侵染后的块根植物茎部至萌发出毛状根；继续培养侵染后的块根植物茎部使毛状根发育成块根得转基因或基因编辑的块根；培养获得的块根至萌发出新苗即得转基因或基因编辑新苗。本发明的方法操作简便，成本低，周期短，转化效率高，可大大缩短甘薯基因功能研究和基因工程育种的周期；此外许多农作物品种能够靠块根进行繁育，比如木薯、山药等，该转基因技术也能够应用于此类作物。

Description

块根植物的转基因或基因编辑新苗的培育方法
技术领域
本发明属于遗传工程领域，具体地说，涉及一种新型的块根植物的转基因或基因编辑新苗的培育方法。
背景技术
中国是世界上最大的甘薯生产国，甘薯不单是重要的粮食作物，具有很高的食用价值，还可以作为工业原料、能源物质应用于生产的方方面面。随着人民生活水平的提高，培育优质高产的甘薯品种是现在育种学家面临的共同课题。在甘薯的科学研究中遗传转化一般运用侵染愈伤组织的方法，此类方法存在技术要求高、成本高、周期长等缺点，所以目前只有极少数研究机构掌握了甘薯的转化技术，这也极大制约了甘薯科学研究的进展。所以新型转基因技术的发明将推动甘薯基因工程育种和基因功能科学研究的进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作方便、效率高、成本低、周期短的块根植物转基因或基因编辑新苗的培育方法以缩短甘薯基因功能研究和基因工程中的育种周期。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：
块根植物的转基因或基因编辑新苗的培育方法，包括以下步骤：
S1：用携带质粒的发根农杆菌侵染块根植物的茎部，培养侵染后的块根植物茎部至萌发出毛状根；
S2：继续培养侵染后的块根植物茎部使毛状根发育成块根得转基因或基因编辑的块根；
S3：培养步骤S2获得的块根至萌发出新苗即得转基因或基因编辑新苗。
作为优选的技术方案，所述步骤S2包括：检查毛状根判断是否成功侵染；若侵染成功则继续培养侵染后的块根植物茎部使毛状根发育成块根得转基因或基因编辑的块根；若侵染不成功则重复步骤S1。
作为优选的技术方案，所述步骤S3包括：培养步骤S2获得的块根至萌发出新苗，对新苗进行检测，筛选出转基因或基因编辑新苗，若筛选不成功则重复步骤S1。
作为优选的技术方案，所述质粒是带外源DNA的质粒。
作为优选的技术方案，所述块根植物是木薯。
作为优选的技术方案，所述块根植物是山药。
作为优选的技术方案，所述块根植物是甘薯。
作为优选的技术方案，所述步骤S1包括：所述步骤S1包括：将甘薯苗的茎部的地上部分切下，之后将甘薯苗的茎部切面涂抹上或注射携带质粒的发根农杆菌，将幼苗基部插入新的基质或营养土或保湿棉中，温室条件下培养至萌发出毛状根；
所述步骤S2包括：取出幼苗，切下部分毛状根段进行检测，筛选出侵染成功的幼苗，继续培养侵染成功的幼苗使毛状根发育成甘薯块；
所述步骤S3包括：培养步骤S2获得的甘薯块，至萌发出甘薯苗，对甘薯苗进行检测，筛选出转基因或基因编辑甘薯苗，若无转基因或基因编辑甘薯苗则重复步骤S2。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的方法操作方便、转化率高、成本低、周期短；可大大缩短甘薯基因功能研究和基因工程育种的周期；此外许多农作物品种能够靠块根进行繁育，比如木薯、山药等，该转基因技术也能够应用于此类作物。
附图说明
图1为本发明步骤1中35S::GFP载体部分序列图谱；
图2为本发明步骤2中转基因毛状根绿色荧光筛选图片，左侧为明视野图片，右侧为绿色荧光图片，A、B为对照组，C、D为阳性组；比例尺为100μm。
图3为本发明步骤3中转基因甘薯块和萌发的甘薯苗，A、C为野生型甘薯，B、D为转基因甘薯；比例尺为2.5cm。
具体实施方式：
本发明提供的项目实施方案用于说明本发明，但是不局限于本发明的研究范围。如果没有特别指出，本发明实施中的技术手段为本研究领域的常用技术，所用原料为市场所购。
步骤1构建含有35S::GFP的质粒发根农杆菌。
(1)用本实验室保存的含有35S::GFP的质粒(图1)转化发根农杆菌K599感受态，用含有卡那霉素抗生素的LB细菌培养基筛选阳性农杆菌。用PCR扩增GFP序列进一步确定阳性农杆菌外源质粒转入。
(2)对阳性发根农杆菌进行保存、备用。
步骤2通过发根农杆菌侵染获得转基因甘薯毛状根
(1)将薯块洗净播种于装有营养土的花盆中，盆中营养土为自然吸水，保证甘薯生长环境湿度适中。盆栽在温室条件下培养，至甘薯长出真叶获得甘薯苗或茎段组织。温室温度为22℃，每日光照时长为16小时。本专利中用的甘薯品种为烟薯25和南京92。
(2)取步骤(1)最终获得的农杆菌平板待用。
(3)沿甘薯苗的茎部位置用锋利的刀片将地上部分切下，之后将苗的茎部切面在发根农杆菌平板上在涂抹至粘上菌液或直接注射发根农杆菌，将幼苗直接插入新的基质或营养土中，温室条件下培养。刚刚完成侵染的甘薯苗要进行保湿处理，例如，在盆栽上罩上透光的塑料薄膜。
(4)侵染幼苗培养两周之后即可对新萌发出的毛状根进行荧光筛选，从盆栽中将侵染小苗轻轻取出，将小苗的根部置于在荧光显微镜下观察是否有绿色荧光(图2)。保留荧光信号阳性的毛状根对应植株继续培养。若没有荧光信号阳性的毛状根对应植株则继续重复步骤(3)重复侵染一次农杆菌，两周后再观察筛选。
步骤3毛状根培育获得转基因薯块和薯苗(图3)
(1)阳性植株继续培养2-4个月，毛状根即可膨大成甘薯块根，此甘薯块即为含有绿色荧光的转基因甘薯材料。收获的转基因甘薯在干燥低温环境下存储备用。
(2)在温室条件下播种步骤(1)收获的甘薯块，即可萌发长出甘薯苗，对甘薯苗进行荧光检测筛选，荧光信号呈阳性植株即是转基因甘薯苗，若无，则重复培养步骤2获得的甘薯快继续进行筛选。

Claims (8)

1.块根植物的转基因或基因编辑新苗的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：用携带质粒的发根农杆菌侵染块根植物的茎部，培养侵染后的块根植物茎部至萌发出毛状根；
S2：继续培养侵染后的块根植物茎部使毛状根发育成块根得转基因或基因编辑的块根；
S3：培养步骤S2获得的块根至萌发出新苗即得转基因或基因编辑新苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2包括：检测发根农杆菌诱导茎部长出的毛状根是否成功转基因或基因编辑；若毛状根转基因阳性或基因编辑阳性则继续培养侵染后的块根植物茎部使毛状根发育成块根得转基因或基因编辑的块根；若侵染不成功则重复步骤S1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3包括：培养步骤S2获得的块根至萌发出新苗，对新苗进行检测，若侵染成功，则得转基因或基因编辑新苗，若侵染不成功则重复步骤S2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒是带外源DNA的质粒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述块根植物是木薯。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述块根植物是山药。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述块根植物是甘薯。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：将甘薯苗的茎部的地上部分切下，之后将甘薯苗的茎部切面涂抹或注射携带质粒的发根农杆菌，将幼苗茎部插入新的基质或营养土中或保湿面中，温室光照条件下培养至萌发出毛状根；
所述步骤S2包括：取出幼苗，直接通过荧光报告基因筛选或切下部分毛状根段进行分子检测，筛选和保留转基因阳性或基因编辑阳性的毛状根，继续培养侵染成功的幼苗使毛状根发育成甘薯块；
所述步骤S3包括：培养步骤S2获得的甘薯块，至萌发出甘薯苗，对甘薯苗进行检测，筛选出转基因或基因编辑甘薯苗，若无转基因或基因编辑甘薯苗则重复步骤S2。
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