CN103340180A - 一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法，通过发根农杆菌侵染大豆成熟种子培养毛状根，以转基因的毛状根来验证抗蚜基因对大豆蚜虫的效果，涉及农作物组织培养及转基因方法领域。主要步骤包括：大豆成熟种子的子叶获得培养技术；发根农杆菌的侵染转化技术；转基因毛状根除菌及继续培养技术；转基因毛状根接蚜技术；转毛状根抗蚜功能基因的鉴定技术。该方法简单，易操作，不受季节限制，能有效、快速的通过转基因毛状根来鉴定目的基因对大豆蚜虫的抗性效果，也可为其他作物的抗性鉴定提供借鉴。

Description

一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养及转基因方法，具体涉及一种通过大豆毛状根来快速鉴定目的基因对大豆蚜虫是否有抗性的方法。

背景技术

大豆在我国栽培历史悠久，一直是一种重要的经济作物，但大豆在生长过程中面临诸多病虫害的侵扰，导致其产量和品质下降。其中，大豆蚜虫就是一种对大豆生长危害较大的害虫，导致大豆叶片光合速率降低、卷曲皱缩、植株矮化、结荚数减少，其携带的其他病毒（大豆花叶病毒、矮缩病等）更加剧了大豆产量的损失，所以急需从现有大豆种质资源中挖掘抗蚜基因。Kim等通过精细定位将Rag1锁定在约115kb的区间，将其中Glyma07g06890和Glyma07g06920确认为候选基因。2010年Kim又将PI200538中的Rag2定位在54kb的区间，经比对发现：一个编码F-box/LRR结构域的基因为唯一的候选基因（基因序列号为Glyma13g26000）。虽然目前国内外已在一些抗性材料上定位到多个抗蚜基因及位点（Rag1，rag1c，Rag2，Rag3，rag4，Rag5），但由于大豆遗传转化体系的不完善，所以通过转基因获得大豆再生苗的方法来验证抗蚜基因的功能仍比较困难，也导致这些抗蚜基因虽有的已经克隆（Rag1和Rag2），但还没有一例在大豆上经过确切的功能验证，其对大豆蚜虫的抗性效果到底如何仍有待试验支持，这也限制了这些基因在大豆抗性育种方面的应用，导致大豆抗蚜虫育种工作进展缓慢。因此，急需寻找一种更为便捷和可靠的方法来验证这些抗蚜基因的功能，从而筛选出抗性更强的基因资源，并明确各个抗蚜基因的抗虫谱，使大豆的抗蚜虫育种工作更有针对性。

Bais,H等研究认为发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）具有工业化生产所需求的特点，如无需添加外源生长素、迅速自主生长、遗传稳定性高、能合成植物特有的次生代谢物而且其含量往往比植物的含量还高。Qu等在研究马铃薯粉痂病病源生物寄生特性时，首次使用由农杆菌诱导的马铃薯毛状根器官离体接种病源微生物粉痂菌，通过显微观察来了解粉痂菌生长发育的不同时期各种寄生结构与特性的变化。文献介绍，大豆蚜虫具有专化性，越冬在鼠李属的几种植物根部；大豆蚜虫抗性的鉴定和蚜虫的繁殖都是在完整植株上，完整植株繁殖蚜虫有不易控制等缺点。如何鉴定大豆抗蚜基因的抗性功能，是生物技术领域急需解决的问题。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺点和不足，提供一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法，在大豆上快速鉴定抗蚜基因功能。本发明实施简单方便，利用本发明可以便捷和可靠鉴定抗蚜虫基因的抗性功能及抗虫谱。

本发明提供的抗蚜性鉴定方法包括将大豆蚜虫接种在根癌农杆菌诱导的大豆毛状根上，观察和统计蚜虫的生长情况，以蚜虫的平均相对生长速率和平均相对繁殖速率作为抗蚜基因对大豆蚜虫抗性能力的鉴定依据。所述抗性鉴定方法包括如下步骤：

1）获得大豆子叶；

2）侵染转化诱导毛状根；

3）除菌并继续培养；

4）毛状根接蚜；

5）抗蚜功能鉴定。

优选地，在第1）步中，获得大豆子叶的方法为：挑选健康无病斑的成熟感蚜虫大豆籽粒，清水漂洗干净，体积分数75%酒精消毒30～60秒，质量体积分数0.1%的Ca(ClO)₂消毒20～30分钟，期间摇晃5～7次左右，无菌水洗去Ca(ClO)₂残留，冲洗5～8次，接种在萌发培养基中，无菌萌发5～7天后得所述大豆子叶。更优选地，萌发培养条件为：光照16h/天，25±3℃；更优选地，萌发培养基的成分为：MSB+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值为5.8。

优选地，在第2）步中，诱导毛状根的方法为，采用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）K599菌株诱导大豆子叶产生毛状根。优选地，诱导毛状根的方法具体操作方法为：用无菌的手术刀片将子叶从下胚轴切下，在子叶近胚轴3mm，远轴心面切半径约4mm的伤口，伤口深至中轴（但不能穿破子叶）。将切好的子叶放在内附滤纸的培养皿中，并滴加1/4MSB5液体培养基（使滤纸完全湿润但无剩余），在子叶的伤口处滴加20μL准备好的发根农杆菌箘液，封口膜封住培养皿，暗培养3～5天后恢复光照培养，光照16h/天，25±3℃，培养1～2周，伤口处开始出现愈伤，接着有毛状根产生。

优选地，在第3）步中，除菌并继续培养的方法为：将培养至5-10cm的毛状根切下，置于无菌培养皿中，每个培养皿3-5条，用含噻孢霉素（Cef）500mg/L的无菌水冲洗3-5遍。更优选地，除菌后继续培养的培养基为1/4MSB5+Cef500mg/L，并使毛状根的根尖没入附有无菌滤纸的培养基中培养3-5天。

优选地，在第4）步中，毛状根接蚜的方法为：用毛笔将在感蚜大豆品种的离体叶片上培养的均一化的3龄大豆蚜虫接种到毛状根上，每个培养皿接蚜虫3-5头。更优选地，蚜虫的繁殖应在感蚜大豆品种的离体叶片上进行。

优选地，在第5）步中，抗蚜功能鉴定的方法为：以大豆蚜虫的平均相对生长速率和平均相对繁殖速率作为目的基因抗蚜性鉴定的依据；抗虫基因表现为：阳性毛状根上蚜虫数量很少，一般少于20头；对照组即非转抗蚜基因表现为：毛状根上密布蚜虫，单个毛状根上的蚜虫数量一般多于50头，且毛状根上布满伴随蚜虫生长的绒毛。接蚜虫14-16天统计蚜虫数量、蚜虫繁殖速率等参数。大豆受体选自感蚜虫的品种；试验对照选择具有毛状根无目的基因的植株、具有毛状根有目的基因的植株、非转基因受体，其中，

平均相对生长速率（g/d）的计算公式为：

平均相对生长速率=[LN(最终蚜虫总重量)-LN(起始蚜虫总重量)]/接蚜天数×100%

平均相对繁殖速率（No./d）的计算公式为：

平均相对繁殖速率=(最终蚜虫数量-起始蚜虫数量)/接蚜天数

与检测大豆抗蚜性的常规的方法相比，发明通过大豆毛状根鉴定转抗蚜基因功能的方法，能够快速、准确鉴定基因抗蚜功能。

本发明实施例中所用的大豆感蚜品种Williams82为大豆公开测序品种，抗蚜品种Dowling为已经公开具有Rag1抗性基因的品种，均可以在种子公司通过购买方式获得。其他生物材料均为本领域常用材料，均可通过市售渠道获得。

具体实施方式

以下是通过大豆毛状根鉴定转抗蚜基因抗性功能优化后的一个实施例：

实施例1

大豆受体选自感蚜虫的品种Williams82，采用大豆毛状根鉴定Rag1抗蚜基因功能的方法，步骤如下：

1）获得大豆子叶：挑选健康无病斑的成熟大豆籽粒，清水漂洗干净，75%酒精消毒30秒，0.1%的Ca(ClO)₂消毒20分钟，期间摇晃5次左右，无菌水洗去Ca(ClO)₂残留，冲洗5次，接种在萌发培养基中，光照16h/天，25±3℃；萌发培养基的成分为：MSB+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值为5.8；其中，所述子叶为大豆成熟种子无菌萌发5天后形成的子叶。

2）发根农杆菌侵染转化诱导毛状根：用无菌的手术刀片将子叶从下胚轴切下，在子叶近胚轴3mm，远轴心面切半径约4mm的伤口，伤口深至中轴（但不能穿破子叶）。将切好的子叶放在内附滤纸的培养皿中，并滴加1/4MSB5液体培养基（使滤纸完全湿润但无剩余），在子叶的伤口处滴加20μL的三种菌液，分别是：带有目的基因Rag1的发根农杆菌K599（Rag1-pHB-K599）、含有空载体pHB的K599菌株（pHB-K599）和不含pHB载体的K599菌株（K599），封口膜封住培养皿，暗培养3天后恢复光照培养，光照16h/天，28℃，培养1周，伤口处开始出现愈伤，接着有毛状根产生。

诱导毛状根所用的携带抗性基因Rag1的菌株Rag1-pHB-K599的构建方法为：通过特异引物RT-PCR扩增目的基因片段，转化大肠杆菌DH5α，经测序验证后提取质粒进行双酶切，将酶切目的基因片段连接到经相同酶切回收的载体pHB上，之后将重组质粒Rag1-pHB转化农杆菌K599，在含有链霉素（Str）和卡那霉素（Kan）的YEB平板上进行筛选和PCR验证，之后扩大培养至OD₆₀₀=0.6～0.8，侵染子叶伤口进行遗传转化，暗培养诱导毛状根的产生（实验中所涉及的相关操作，如感受态制备、凝胶回收、转化连接等均严格按照《分子克隆实验指南》第三版及相关试剂盒说明书进行）。

3）毛状根的除菌和继续培养：将培养至5cm的毛状根切下，置于无菌培养瓶中，用含Cef500mg/L的无菌水冲洗3遍。更优选地，除菌后继续培养的培养基为1/4MSB5+Cef500mg/L，并使毛状根的根尖没入附有无菌滤纸的培养基中培养3天。

4）毛状根上接蚜虫：挑选生长基本一致的三组毛状根（Rag1-pHB-K599、pHB-K599、K599），用毛笔将在感蚜大豆品种的离体叶片上培养的均一化的3龄大豆蚜虫接种到各组毛状根上，每个培养皿接蚜虫3头。

5）转基因毛状根中目的基因的抗蚜功能鉴定：接蚜虫14天后统计蚜虫数量、蚜虫繁殖速率等参数。以大豆蚜虫的平均相对生长速率和平均相对繁殖速率作为目的基因抗蚜性鉴定的依据，其中，

平均相对生长速率（g/d）的计算公式为：

平均相对生长速率=[LN(最终蚜虫总重量)-LN(起始蚜虫总重量)]/14×100%

转抗蚜基因平均相对生长速率（Rag1-pHB-K599）

=[LN（0.0034）-LN（0.0008）]/14×100%=10.34%

非转抗蚜基因平均相对生长速率（pHB-K599）

=[LN（0.0219）-LN（0.0008）]/14×100%=23.64%

对照组平均相对生长速率（K599）

=[LN（0.0227）-LN（0.0008）]/14×100%=23.89%

平均相对繁殖速率（No./d）的计算公式为：

平均相对繁殖速率=(最终蚜虫数量-起始蚜虫数量)/14

转抗蚜基因平均相对繁殖速率（Rag1-pHB-K599）=(13-3)/14=0.714

非转抗蚜基因平均相对繁殖速率（pHB-K599）=(84-3)/14=5.78

对照组平均相对繁殖速率（K599）=(87-3)/14=6.00

功能基因鉴定结果：蚜虫的平均相对生长速率和平均相对繁殖速率在非转抗蚜基因组和对照组都相差不大。筛选得到的具有抗蚜基因功能的毛状根上蚜虫数量是原来的4.3倍，而非转抗蚜基因的毛状根的蚜虫数量是原来的28倍；非转抗蚜基因的毛状根的蚜虫的平均相对生长速率和平均相对繁殖速率分别是转抗蚜基因的2.3倍和8.1倍，抗蚜基因在毛状根上的抗性功能具有显著差异。通过大豆毛状根鉴定抗蚜基因功能的方法，能够快速、准确鉴定基因抗蚜功能。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种鉴定大豆抗蚜基因的方法，包括如下步骤：

1）获得大豆子叶；

2）侵染转化诱导毛状根

3）除菌并继续培养；

4）毛状根接蚜；

5）抗蚜功能鉴定；

所述步骤1）中，所述大豆子叶为感蚜虫大豆种子萌发5～7天后形成的子叶。

所述步骤2）中，所述“侵染转化诱导毛状根”，是指采用携带有待鉴定基因的发根农杆菌侵染所述大豆子叶，并诱导毛状根长出。

2.如权利要求1所述的鉴定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步骤1）中，获得大豆子叶的方法为：挑选健康无病斑的成熟大豆籽粒，清水漂洗干净，体积分数75%酒精消毒30～60秒，质量体积分数0.1%的Ca(ClO)₂消毒20～30分钟，期间摇晃5～7次左右，无菌水洗去Ca(ClO)₂残留，冲洗5～8次，接种在萌发培养基中，进行萌发培养，无菌萌发5～7天后得所述大豆子叶。

3.如权利要求2所述的鉴定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述萌发培养，培养条件为，光照16h/天，25±3℃；萌发培养基的成分为，MSB+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值为5.8。

4.如权利要求1所述的鉴定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步骤2）中，发根农杆菌侵染转化诱导毛状根的方法为：将子叶从下胚轴切下，在子叶近胚轴处，远轴心面切一伤口，伤口深至中轴，但不穿破子叶，将切好的子叶放在内附滤纸的培养皿中，并滴加1/4MSB5液体培养基，使滤纸完全湿润但无剩余，在子叶的伤口处滴加20μL发根农杆菌箘液，封口膜封住培养皿，暗培养3～5天后恢复光照培养，光照16h/天，25±3℃，培养1～2周，产生毛状根。

5.如权利要求1所述的鉴定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步骤3）中，除菌并继续培养的方法为：将毛状根切下，置于无菌培养皿中，用含噻孢霉素的无菌水冲洗3～5遍，除菌后继续培养。

6.如权利要求1所述的鉴定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步骤3）中，所述除菌后继续培养的培养基为1/4MSB5+Cef500mg/L，继续培养时间为3～5天。

7.如权利要求1所述的鉴定大豆抗蚜基因的方法，其中

步骤4）中，毛状根接蚜的方法为：将大豆蚜虫接种到毛状根上，每个培养皿接蚜虫3-5头。

8.如权利要求7所述的鉴定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步骤4）中，所述大豆蚜虫为在感蚜大豆品种的离体叶片上培养的均一化的3龄大豆蚜虫，所述大豆蚜虫的繁殖是在感蚜大豆品种的离体叶片上进行的。

9.如权利要求1所述的鉴定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述步骤5）中，抗蚜功能鉴定的方法为：以大豆蚜虫的平均相对生长速率和平均相对繁殖速率作为待检基因抗蚜性鉴定的依据，

平均相对生长速率（g/d）=[LN(最终蚜虫总重量)-LN(起始蚜虫总重量)]/接蚜天数×100%

平均相对繁殖速率（No./d）=(最终蚜虫数量-起始蚜虫数量)/接蚜天数。

10.如权利要求1所述的鉴定大豆抗蚜基因的方法，其中

所述大豆为感蚜虫大豆品种Williams82。