CN111721746A - 一种快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物组织培养和转化以及基因功能鉴定领域，特别地涉及向日葵列当(Orobanche cumana)抗性基因的鉴定。本发明建立了一种基于向日葵发根转化获得复合体而在体外条件下快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法。

Description

一种快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法
技术领域
本本发明属于生物技术领域，涉及一种基于向日葵发根复合体系在体外条件下快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法。
背景技术
向日葵列当(Orobanche cumana Wallr.)又称毒根草或兔子拐棍，是一年生草本植物，其属双子叶植物中的列当科。它是向日葵特有的非光合根寄生植物，对向日葵的生长发育有负面影响(1)。受感染的植株矮小、瘦弱、花盘直径变小或不能形成花盘，最后导致全株枯死(2)。欧洲和亚洲，列当危害造成的减产超过80％(3)。
有几种方法可以或多或少地控制列当，例如可使用不同的作物管理解决方案：土壤暴晒，生物控制，和使用除草剂例如咪唑啉酮与耐除草剂向日葵杂交种组合使用。培育抗性品种控制列当是一项最经济有效，简单易行的防治措施(4)。然而，这是一项长期的工作，因为当最新的一个小种的抗性被发现时，列当会进化出一个更具毒力的小种，抗性就会随之逐步减弱或消失。因此，为了加速向日葵列当抗性品种的育种进程和提高抗列当育种效率，现代作物分子育种成为抗列当向日葵育种的关键技术之一。
许多遗传作图研究已经分析了向日葵对列当的数量抗性，并且已经证明了一些数量性状基因座对一个或多个发育阶段是特异的，或者控制了列当的萌发数量(5)。遗传抗性基因最初从野生向日葵属物种(Helianthus spp.)中鉴定并通过种间杂交导入易感品种(6)。按基因对列当生理小种的反应命名了不同的Or抗性基因，并已经在育种中应用了几十年(7)。然而，关于抗性基因座的分子遗传学定位，目前只有两篇报道。第一个是Or5基因，该基因对E小种具有抗性(8-10)。第二个报告详细描述了对F小种的抗性QTL定位，在5个连锁群(LG)上检测到了6个控制田间出现的小种数量的QTL，未克隆到任何基因，以及与抗性相关的分子机制仍然未知。因此，进一步筛选和鉴定抗性候选基因对于加快向日葵列当抗性品种的育种进程具有十分重要的意义。
转基因互补实验是基因功能验证的方法之一，即将候选基因如抗病性状转入感病的个体中进行表型鉴定来确定基因功能。最常用的植物转化方法有农杆菌介导转化和基因枪法等(11)。向日葵的转化非常具有挑战性，国内外都有许多尝试，但是转化效率都不高，并且可重复性比较低(12)。另外转化过程非常繁琐，培养时间长，成本高，限制了它们作为列当抗性基因功能研究对象的潜力。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的转化系统可以在相对较短的时间(约5-6周)来完成候选基因的功能验证。而且系统产出效率更高，因为每个转基因根代表一个独立的转化事件，在相对较短的时间内可以获得和分析大量的转化子。发根农杆菌介导的转化方法简便快捷，已成为基因功能和根生物学研究的有力工具(13)。发根转化尤其适合应用于涉及到根系生物学的基因功能研究，如那些在共生和致病相互作用、营养吸收和激素转运中起作用的基因(14)。在大豆上，菌株K599能有效地诱导多个大豆品种子叶产生毛状根，其离体培养的毛状根可用于大豆胞囊线虫的繁殖，为大豆胞囊线虫的功能研究提供了一种简便有效的工具(15)。向日葵列当根寄生的特性决定了发根转化系统非常适合列当抗性基因的验证。
目前向日葵抗性鉴定主要采用田间测试、营养钵法和体外实验法。盆栽法和离体法比田间筛选法更快、成本更低，防止了由于种子在土壤中分布不均而造成的逃逸，减少了对环境的影响(16)。营养钵法的缺点是该方法需要大量列当种子和土壤按一定比例进行混合；在后期列当数量统计前的洗涤工作，需要大量的人力和时间；该体系不利于观察列当的各个发育阶段。由于向日葵转化技术的局限性，目前上述方法仅仅局限于鉴定野生型向日葵抗列当水平，而没有离体检测技术对列当抗性基因进行验证的报道。为解决以上技术问题，本发明提供了建立一种快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法。这种方法结合优化的发根农杆菌介导转化获得向日葵复合植物系统和体外鉴定实验法，能够快速鉴定和筛选向日葵抗列当基因。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种室内条件下快速鉴定和验证向日葵列当抗性基因的方法。旨在解决目前向日葵抗性基因不能快速鉴定、列当萌发及寄生过程难以观察、实验周期长、重复性差等的问题。向日葵复合植物指的是由转基因的发根和非转基因的地上部分组成的嵌合植物。
总体而言，本发明涉及一种快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法，其包括以下步骤：
(1)向日葵复合植物的获得：
(1.1)种子消毒与萌发
选择饱满的向日葵种子用于进行消毒；
将消毒后的种子播种于含有培养基的培养皿中，并置于适宜于种子萌发的环境中萌发培养；
(1.2)外植体分离
选取萌发好的种子，切除接近根一端的一段下胚轴，剩下的种子部分作为外植体用于侵染；
(1.3)侵染与共培养
将外植体浸入农杆菌悬浮液中浸染，然后将外植体转移到培养皿中进行共培养；
(1.4)筛选培养与根诱导培养
共培养完后，将外植体转移到筛选培养基上培养，并诱导生根，直到获得复合植物；
(2)向日葵列当抗性鉴定：
(2.1)向日葵列当种子的消毒和预培养
对向日葵列当种子进行消毒；
对向日葵列当种子进行预培养，其包括在培养皿底部放置灭菌的滤纸，用无菌水完全湿润滤纸，将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀地平铺在滤纸上一段时间，然后用于接种向日葵复合植物和野生型向日葵植物；
(2.2)向日葵复合植物的处理
选取具有健康生长点及具有至少3cm健壮发根的植物，小心地将复合植物从培养基中取出，用清水洗掉残留在根上的培养基，直接用于列当接种；
(2.3)野生型对照向日葵种子的消毒和萌发
挑选饱满的向日葵种子用于进行消毒，然后放在发芽纸中萌发7-10天后用于接种；
(2.4)向日葵列当种子接种
取方形培养皿，然后在底盖中填充混合好的基质，在基质上面覆盖灭菌的方形玻璃纤维滤纸，并用蒸馏水将玻璃纤维滤纸润湿；再将含有预培养的列当的滤纸片覆盖在玻璃纤维滤纸上；最后将向日葵或者向日葵复合植物的根放置在上面，地上部分朝向平皿开口一侧，将上盖盖上并用医用胶带将培养皿封好后放置在培养箱中培养；
(2.5)GFP表达检测和寄生瘤数量统计
接种一段时间例如3周后，用肉眼观察和统计向日葵列当寄生瘤的数量，并在荧光显微镜下检查向日葵复合植物的发根以确认含有寄生瘤的发根均有GFP蛋白表达。
在一个进一步的实施方案中，在步骤(1.1)中，所述消毒通过下述方式来进行：用75％的酒精进行表面消毒，然后用次氯酸钠溶液浸泡15分钟，最后用超纯水润洗多次。
在一个进一步的实施方案中，在步骤(1.1)中，所述适宜于种子萌发的环境为处于室温且光照/黑暗替换周期为16/8小时的环境。
在一个进一步的实施方案中，在步骤(1.3)中，所述共培养进行2到3天，在培养皿中铺有滤纸，且滤纸上含有液体共培养基。
在一个进一步的实施方案中，在步骤(1.4)中，在筛选培养阶段，所使用的筛选剂为草铵膦，并且其浓度范围为4-8mg/L。
在一个进一步的实施方案中，在步骤(1.4)中，在筛选培养阶段，在筛选培养一周以后，降低或去除筛选剂，从而短期内增殖发根。
在一个进一步的实施方案中，在步骤(2.1)中，所述消毒通过下述方式来进行：向日葵列当种子用75％酒精溶液表面消毒2分钟，再用0.25％次氯酸钠浸泡消毒，最后用蒸馏水冲洗。
在一个进一步的实施方案中，在步骤(2.1)中，所述向日葵列当种子的预培养包括：在培养皿底部放置两张灭菌的玻璃纤维滤纸，用无菌水完全湿润滤纸，将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀地平铺在滤纸上，培养皿用医用胶带密封，在22℃下于黑暗中放置7天，然后用于接种向日葵复合植物和野生型向日葵植物。
在一个进一步的实施方案中，在步骤(2.3)中，所述消毒通过下述方式来进行：用酒精表面消毒，再用纯的次氯酸钠消毒，然后用无菌水冲洗并浸泡在无菌水中2小时后取出。
在一个进一步的实施方案中，在步骤(2.4)中，向日葵列当种子接种的操作程序如下：取12cm×12cm的塑料方形培养皿，将底盖和上盖的一个边去掉，然后在底盖中填充混合好的基质，在基质上面覆盖12cm×12cm的灭菌的方形玻璃纤维滤纸，并用蒸馏水将玻璃纤维滤纸润湿；再将含有预培养的列当的滤纸片覆盖在玻璃纤维滤纸上；最后将向日葵或者向日葵复合植物的根放置在上面，地上部分朝向平皿开口一侧，将上盖盖上并用医用胶带将培养皿封好后放置在培养箱中培养。
在一个进一步的实施方案中，在步骤(2.4)中，所述基质包括蛭石、草炭、河沙或其组合。
在一个进一步的实施方案中，所述基质包括蛭石和草炭的组合或者蛭石和河沙的组合。
在一个进一步的实施方案中，所述基质包括以1:1的蛭石和草炭的组合或者蛭石和河沙的组合。
在一个进一步的实施方案中，所述向日葵复合植物包括转基因发根和非转基因地上部分。
特别地，本发明涉及一种发根农杆菌介导的获得向日葵复合植物的遗传转化方法，该方法包括以下几个步骤：
(1)向日葵种子消毒与萌发：
选择饱满的向日葵种子，用75％的酒精进行表面消毒，然后用次氯酸钠溶液浸泡15分钟，最后用超纯水润洗多次，将消毒后的种子播种于含有培养基的培养皿中，并置于室温且光照/黑暗替换周期为16/8小时的环境中萌发培养；
(2)外植体分离：
选取萌发好的种子，切除接近根一端的一段下胚轴，剩下的种子部分作为外植体用于侵染；
(3)侵染与共培养：
将外植体浸入农杆菌悬浮液中侵染，然后将外植体移到培养皿中共培养2到3天；
(4)筛选培养与根诱导培养：
共培养完后，将外植体转移到筛选培养基上培养，并诱导生根，直到获得复合植物。
通过本发明方法获得的转化产物为复合植物，其不仅包括发根，而且还包括植物完整的地上部分。非转基因的地上部分保证发根可以离开培养基，并在体外列当侵染实验中正常生长。
特别地，本发明涉及一种体外鉴定向日葵抗列当基因的方法，该方法包括以下步骤：
(1)向日葵列当种子的消毒和预培养：
向日葵列当种子用75％酒精溶液消毒2分钟，再用含有0.25％次氯酸钠和0.2％吐温-20的消毒液消毒10分钟，最后用蒸馏水冲洗；培养皿底部放置两张灭菌的玻璃纤维滤纸，用无菌水完全湿润滤纸，将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀的平铺在滤纸上，培养皿用医用胶带密封，在22℃下于黑暗中放置7天，然后用于接种向日葵复合植物和野生型向日葵植物；
(2)向日葵复合植物的处理：
选取具有健康生长点及具有至少3cm健壮发根的植物，小心地将复合植物从培养基中取出，用清水洗掉残留在根上的培养基，直接用于列当接种。
(3)野生型对照向日葵种子的消毒和萌发：
挑选饱满的向日葵种子用75％的酒精表面消毒3分钟，再用纯的次氯酸钠消毒15分钟，然后用无菌水冲洗3次并浸泡在无菌水中2小时后取出，放在发芽纸中萌发7-10天后用于接种；
(4)向日葵列当种子接种：
取12cm×12cm的塑料方形培养皿，将底盖和上盖的一个边去掉，然后在底盖中填充混合好的基质，在基质上面覆盖12cm×12cm的灭菌的方形玻璃纤维滤纸，并用蒸馏水将玻璃纤维滤纸润湿，再将含有预培养列当的滤纸片覆盖在玻璃纤维滤纸上，最后将向日葵或者向日葵复合植物的根放置在上面，地上部分朝向平皿开口一侧，将上盖盖上，并用医用胶带将培养皿封好后放置在光照培养箱中培养；
(5)GFP表达检测和寄生瘤数量统计：
接种3周后，用肉眼观察和统计向日葵列当寄生瘤的数量，并在荧光显微镜下检查向日葵复合植物的发根，以确认含有寄生瘤的发根均有GFP蛋白表达。
本发明提供了在室内条件下快速鉴定和验证向日葵列当抗性基因的方法。能够通过发根转化体系将外源基因导入，并保留非转基因的地上部保证发根可以离开培养基并在体外列当侵染实验中正常生长。侵染后的根无需清洗即可在镜下或肉眼观察萌发过程和寄生结构，同时可以直接在荧光显微镜下观察GFP的表达。本发明实用性强、具有很强的推广与应用价值。
附图说明
图1.本发明所提供的快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法的流程图。
图2.通过发根农杆菌介导的向日葵转化而获得的复合植物。
图3.植物双元表达载体15312和25244的示意图。
图4.在方形培养皿中鉴定向日葵植株：A.在一个培养皿中鉴定一个植株；B.在一个培养皿中同时鉴定两个植株。
图5.向日葵复合体发根GFP检测及寄生瘤的形成：A.向日葵复合体发根成瘤；B.转基因发根在白光下；C.转基因发根在绿色荧光下。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。本领域技术人员基于本申请中的实施例而获得的所有其他实施方案都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
图1展示了本发明提供的一种快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法的流程。该方法具体步骤的操作方法如下述。
1.通过发根农杆菌介导的向日葵转化获得向日葵复合植物(图2)。
1.1.转化载体构建
实验中用到的外源基因表达盒的各个元件均在金斯瑞(GenScript)进行合成，本实验转化用到的载体结构图如图3所示，载体的构建方法采用标准的酶切连接的方法。所有的载体均含有PET基因作为植物中的筛选标记，用草铵膦作为筛选剂。最终构建形成的双元载体15312(作为空白对照)和外源基因表达载体25244用于遗传转化。
1.2.向日葵根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化
实验中所用的向日葵品种为先正达公司的列当易感自交系1、列当易感自交系2、列当抗性自交系3。具体的转化方法包括以下几个步骤。
1.2.1.向日葵种子的消毒与萌发
选取列当抗性敏感材料作为转化受体。在进行种子消毒前，需要将种皮小心地剥掉，避免伤害种子。接着，用75％的酒精对种子表面消毒2分钟。然后，在纯的次氯酸钠(Sigma-Aldrich,Vienna,Austria)中滴入一滴吐温20，将种子浸泡其中消毒15分钟。最后，用超纯水清洗种子四至五遍。种子消毒后，将种子播种于含有培养基的培养皿中，培养基成分包含Gamborg B5基本盐和维生素、20g/L蔗糖、8g/L琼脂，且pH＝5.6。将培养皿放置在处于室温下且光照/黑暗替换周期为16/8小时的环境中培养一天。
1.2.2.农杆菌的制备
将农杆菌菌株从-80℃冰箱中取出，挑取含有15312质粒的农杆菌菌落，在加有抗生素抗性的YP培养基上划线，在28℃且黑暗条件下培养2-3天。在侵染前一天，刮取YP培养基上的菌斑，在新的YP培养基上过夜培养。刮取菌落，放入包含20ml侵染培养基的50ml离心管中，震荡，使得农杆菌完全稀释在侵染液中，将农杆菌稀释到OD660＝0.5-1.0，待用。
1.2.3.外植体的分离
在接近生长点的子叶节部分，切除下胚轴，并在切口处用刀片划出伤口，保留子叶。
1.2.4.侵染与共培养
将外植体至于农杆菌菌液中，每10毫升菌液放置30个外植体，在600-1000rpm的速度下离心5分钟，然后静置约一到两小时。
侵染完后，收集外植体于培养皿中，并用医用胶带缠绕培养皿四周，保持湿度。培养皿里预先放置一张滤纸，再加入液体共培养基。
1.2.5.筛选培养和根诱导培养
共培养两至三天后，将外植体转移至筛选培养基培养3周。筛选培养基主要成分包括：MS基本盐、蔗糖、B5维生素、250mg/L头孢霉素、8g/L琼脂以及筛选剂。在筛选培养阶段，所使用的筛选剂为草铵膦，并且其浓度范围为4-8mg/L。
在筛选培养一周之后，在外植体侵染部位会萌发生成发根。在筛选培养三周之后，发根长度能达到5-6厘米长，同时地上部分的幼苗部分正常生长，形成茎和叶。由此，获得的转化体为复合植株并可用于列当抗性鉴定，其地上部分的茎和叶是非转基因的，其地下部分的发根是转基因的。
2.列当抗性基因体外检测
2.1.实验材料的准备
在开始列当抗性基因体外检测实验前需要准备如下实验材料，包括：
i.转化了目标基因的复合植株以及作为对照的转化了空载体的复合植株，每株发根长度不短于3cm；
ii.萌发7天的野生型抗性品种以及敏感品种植株作为系统对照；
iii.预培养7天的列当种子。
2.2.向日葵种子消毒与萌发
挑选饱满的向日葵种，放于50ml离心管中，用75％的酒精对种子表面消毒2分钟。然后，在纯的次氯酸钠(Sigma-Aldrich,Vienna,Austria)中滴入一滴吐温20，将种子浸泡并充分震荡15分钟。最后，用超纯水清洗种子四至五遍。将消毒处理的向日葵种子浸泡在无菌水中2小时后，把种子放在萌发纸中，在16小时光照及28℃(日)/18℃(夜)条件下培养7天。
2.3.列当种子的消毒
将向日葵列当种子放入茶叶袋中，然后放在含有75％酒精溶液的平皿中消毒2分钟，期间不断将茶叶袋在溶液中拖动，之后换成0.25％次氯酸钠和0.2％吐温-20等体积混合的消毒液消毒10分钟，最后用蒸馏水冲洗。最后在超净台中吹干干后进行预处理。
2.4.向日葵列当的预培养
培养皿底部放置两张灭菌的9c m圆形玻璃纤维滤纸，用2ml无菌水完全湿润滤纸，将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀地平铺在滤纸上，培养皿用医用胶带密封，在22℃的黑暗中将平皿竖直放置7天，然后用于接种向日葵复合植株和野生型向日葵植株。
2.5.向日葵列当种子接种
取12cm×12cm方形培养皿，将培养皿的盖子和底盘各去掉一个边。将灭菌的蛭石和草炭或者蛭石和河沙1:1混合后用少量水润湿。将上述混合好的基质装在培养皿中，将基质表面抚平后盖上一张12cm×12cm灭菌的方形玻璃纤维滤纸。用无菌水将玻璃纤维滤纸润湿，将含有预培养列当种子的圆形玻璃纤维滤纸放在方形玻璃纤维表面上。将待接种的向日葵植株(复合体)的根平铺在圆形玻璃纤维滤纸上，地上部分朝向平皿去掉边的一侧。盖上盖子，并用封口膜将除去掉边一侧外的三侧封好。将封好平皿直立并小心填充基质以保证滤纸和根充分接触。小心避免将基质弄到滤纸表面影响观察。当选用5cm圆形玻璃纤维滤纸预培养列当时，可以在同一个平皿可以同时接种两个复合体(一个含有外源待筛选的基因，一个为空载体对照)(图4)。在16小时光照和22℃下恒温培养20天后，统计出瘤情况。在培养期间每两天浇水一次。
2.6.GFP表达检测和向日葵抗列当基因抗性评价(图5)
2.6.1.GFP表达检测
通过荧光显微镜观察发根的GFP表达效果，确定发根为转基因阳性的2.6.2.向日葵列当抗性评价：
i.表现为质量性状的基因：直接观察成瘤情况。
ii.表现为数量性状的基因：接种1周后在20X解剖镜下观察向日葵列当种子的萌发数量，接种20天后用肉眼观察向日葵列当寄生瘤状结构的形成，并利用下面的公式计算列当种子的寄生率：
寄生率(％)＝[寄生瘤形成的数量(个)/接种列当种子数量(粒)]x100向日葵列当抗性评价实例
按照2.1-2.6的步骤进行向日葵列当抗性基因筛选实验，得到鉴定结果如下表1所示。其中，载体15312为空对照载体；载体25244为目标鉴定载体，携带向日葵列当抗性候选基因。用于转化的向日葵品种分别是易感自交系1和易感自交系2。同时，用野生型的易感自交系1和交系2以及抗性自交系3作为系统对照，用向日葵列当进行侵染实验，得到的结果如表1所示。
表1.向日葵列当抗性鉴定寄生瘤数目统计结果
Figure BDA0002562712210000121
从以上结果可以看出，对照载体不具有列当抗性；同时，包含向日葵列当抗性候选基因的鉴定载体，也没有明显抗性。而以野生型向日葵品种作为对照，易感品种获得了列当寄生瘤，而抗性品种没有，对比明显，说明系统可以正常工作。因此，该体系可以应用于向日葵列当抗性鉴定。
参考文献
1.陈永峰.向日葵列当的综合防治[J].北京农业,2015,000(022):67-69,70.
2.刘颖,齐艳春,任丽梅.向日葵列当发生特点及防除对策[J].上海农业科技,2007(1):102-102.
3.Alcántara E,Morales-García,Marién,Díaz-Sánchez,Jorge.Effects ofBroomrape Parasitism on Sunflower Plants:Growth,Development,and MineralNutrition.Journal of Plant Nutrition.2006,29(7).
4.Louarn J,Boniface MC,Pouilly N,Velasco L,Perez-Vich B,Vincourt P,and
Figure BDA0002562712210000131
S.Sunflower Resistance to Broomrape(Orobanche cumana)Is Controlledby Specific QTLs for Different Parasitism Stages.Front Plant Sci.2016,7:590.
5.Duriez P,Vautrin S,Auriac MC,Bazerque J,Boniface MC,Callot C,etal.A receptor-like kinase enhances sunflower resistance to Orobanchecumana.Nat Plants.2019,5(12):1211-5.
6.Jan CC,and Fernandez-Martínez,J.M.Interspecific hybridization,genetransfer,and the development of resistance to the broomrape race f inSpain.Helia.2002,25:123-36.
7.Fernández-Martínez JMD,J.Pérez-Vich,B.Velasco,L.Update on breedingfor resistance to sunflower broomrape.Helia 2008,33(52):73-84.
8.Y.H.Lu JMM-V,J.A.García-Tejada and P.Blanchard.Development of SCARmarkers linked to the gene Or5 conferring resistance to broomrape(Orobanchecumana Wallr.)in sunflower.Theoretical and Applied Genetics.2000,100:625-32.
9.Tang S.,Heesacker,A.,Kishore,V.K.,Fernandez,A.,Sadik,E.S.,Cole,G.,and Knapp,S.J.Genetic Mapping of the Or5 Gene for Resistance to OrobancheRace E in Sunflower.Crop Science.2003,43(3):1021-8.
10.Perez-Vich B,Akhtouch B,Knapp SJ,Leon AJ,Velasco L,Fernandez-Martinez JM,and Berry ST.Quantitative trait loci for broomrape(Orobanchecumana Wallr.)resistance in sunflower.Theor Appl Genet.2004,109(1):92-102.
11.耿立召,刘传亮,李付广.农杆菌介导法与基因枪轰击法结合在植物遗传转化上的应用.西北植物学报.2005,01:210-5.
12.郝彦玲,罗云波.向日葵遗传转化研究进展.中国生物工程杂志.2005,01:30-3.
13.Cao D,Hou W,Song S,Sun H,Wu C,Gao Y,and Han T.Assessment ofconditions affecting Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation ofsoybean.Plant Cell Tissue and Organ Culture.2009,96:45-52.
14.Kereszt A,Li D,Indrasumunar A,Nguyen CD,Nontachaiyapoom S,KinkemaM,and Gresshoff PM.Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation ofsoybean to study root biology.Nat Protoc.2007,2(4):948-52.
15.Savka MA,Ravillion,B.,Noel,G.R.&Farrand,S.K.Induction of hairyroots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybeancyst nematode.Phytopathology.1990,80:503-8.
16.Diego Rubiales APe-d-L,M′onica Fern′andez-Aparico,JosefinaC.Sillero2,Bel′en Rom′an,Mohamed Kharrat,Shaban Khalil,Daniel M.Joel&CharlieRiches.Screening techniques and sources of resistance against parasitic weedsin grain legumes.Euphytica.2006,147:187-99.

Claims (14)

1.一种快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法，其包括以下步骤：
(1)向日葵复合植物的获得：
(1.1)种子消毒与萌发
选择饱满的向日葵种子用于进行消毒；
将消毒后的种子播种于含有培养基的培养皿中，并置于适宜于种子萌发的环境中萌发培养；
(1.2)外植体分离
选取萌发好的种子，切除接近根一端的一段下胚轴，剩下的种子部分作为外植体用于侵染；
(1.3)侵染与共培养
将外植体浸入农杆菌悬浮液中浸染，然后将外植体转移到培养皿中进行共培养；
(1.4)筛选培养与根诱导培养
共培养完后，将外植体转移到筛选培养基上培养，并诱导生根，直到获得复合植物；
(2)向日葵列当抗性鉴定：
(2.1)向日葵列当种子的消毒和预培养
对向日葵列当种子进行消毒；
对向日葵列当种子进行预培养，其包括在培养皿底部放置灭菌的滤纸，用无菌水完全湿润滤纸，将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀地平铺在滤纸上一段时间，然后用于接种向日葵复合植物和野生型向日葵植物；
(2.2)向日葵复合植物的处理
选取具有健康生长点及具有至少3cm健壮发根的植物，小心地将复合植物从培养基中取出，用清水洗掉残留在根上的培养基，直接用于列当接种；
(2.3)野生型对照向日葵种子的消毒和萌发
挑选饱满的向日葵种子用于进行消毒，然后放在发芽纸中萌发7-10天后用于接种；
(2.4)向日葵列当种子接种
取方形培养皿，然后在底盖中填充混合好的基质，在基质上面覆盖灭菌的方形玻璃纤维滤纸，并用蒸馏水将玻璃纤维滤纸润湿；再将含有预培养的列当的滤纸片覆盖在玻璃纤维滤纸上；最后将向日葵或者向日葵复合植物的根放置在上面，地上部分朝向平皿开口一侧，将上盖盖上并用医用胶带将培养皿封好后放置在培养箱中培养；
(2.5)GFP表达检测和寄生瘤数量统计
接种一段时间例如3周后，用肉眼观察和统计向日葵列当寄生瘤的数量，并在荧光显微镜下检查向日葵复合植物的发根以确认含有寄生瘤的发根均有GFP蛋白表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1.1)中，所述消毒通过下述方式来进行：用75％的酒精进行表面消毒，然后用次氯酸钠溶液浸泡15分钟，最后用超纯水润洗多次。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1.1)中，所述适宜于种子萌发的环境为处于室温且光照/黑暗替换周期为16/8小时的环境。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1.3)中，所述共培养进行2到3天，在培养皿中铺有滤纸，且滤纸上含有液体共培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1.4)中，在筛选培养阶段，所使用的筛选剂为草铵膦，并且其浓度范围为4-8mg/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1.4)中，在筛选培养阶段，在筛选培养一周以后，降低或去除筛选剂，从而短期内增殖发根。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(2.1)中，所述消毒通过下述方式来进行：向日葵列当种子用75％酒精溶液表面消毒2分钟，再用0.25％次氯酸钠浸泡消毒，最后用蒸馏水冲洗。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(2.1)中，所述向日葵列当种子的预培养包括：在培养皿底部放置两张灭菌的玻璃纤维滤纸，用无菌水完全湿润滤纸，将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀地平铺在滤纸上，培养皿用医用胶带密封，在22℃下于黑暗中放置7天，然后用于接种向日葵复合植物和野生型向日葵植物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(2.3)中，所述消毒通过下述方式来进行：用酒精表面消毒，再用纯的次氯酸钠消毒，然后用无菌水冲洗并浸泡在无菌水中2小时后取出。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(2.4)中，向日葵列当种子接种的操作程序如下：取12cm×12cm的塑料方形培养皿，将底盖和上盖的一个边去掉，然后在底盖中填充混合好的基质，在基质上面覆盖12cm×12cm的灭菌的方形玻璃纤维滤纸，并用蒸馏水将玻璃纤维滤纸润湿；再将含有预培养的列当的滤纸片覆盖在玻璃纤维滤纸上；最后将向日葵或者向日葵复合植物的根放置在上面，地上部分朝向平皿开口一侧，将上盖盖上并用医用胶带将培养皿封好后放置在培养箱中培养。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(2.4)中，所述基质包括蛭石、草炭、河沙或其组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述基质包括蛭石和草炭的组合或者蛭石和河沙的组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述基质包括以1:1的蛭石和草炭的组合或者蛭石和河沙的组合。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述向日葵复合植物包括转基因发根和非转基因地上部分。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2179187C1 (ru) * 2000-12-28 2002-02-10 Гапоненко Александр Константинович Способ получения трансгенных растений подсолнечника
US20120144519A1 (en) * 2010-12-03 2012-06-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method of plant regeneration and transformation
CN103340180A (zh) * 2013-07-12 2013-10-09 上海交通大学 一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法
CN106508460A (zh) * 2016-12-30 2017-03-22 内蒙古农业大学 一种快速室内鉴定向日葵抗列当水平的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2179187C1 (ru) * 2000-12-28 2002-02-10 Гапоненко Александр Константинович Способ получения трансгенных растений подсолнечника
US20120144519A1 (en) * 2010-12-03 2012-06-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method of plant regeneration and transformation
CN103340180A (zh) * 2013-07-12 2013-10-09 上海交通大学 一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法
CN106508460A (zh) * 2016-12-30 2017-03-22 内蒙古农业大学 一种快速室内鉴定向日葵抗列当水平的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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TYLER PARKS等: "Composite plants for a composite plant: an efficient protocol for root studies in the sunflower using composite plants approach", 《PLANT CELL，TISSUE AND ORGAN CULTURE》 *

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