CN103773784B - PLDα1基因在增加作物抗旱性及种子产量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子育种和生物技术领域，公开了PLDα1基因在增加作物抗旱性及种子产量中的应用，所述PLDα1基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示，或者与SEQ？ID？NO：1所示的核苷酸序列相似性大于或等于70%。本发明还公开了一种增加油菜抗旱性及种子产量的方法，试验表明，气孔特异性超表达AtPLDα1的油菜可以有效调控植株响应干旱胁迫过程中的气孔关闭，从而减少叶片的水分蒸腾作用，提高植株的保水能力和抗旱性，在田间自然生长条件下，转基因油菜植株在生长早期或中期遭遇干旱季节时则表现出花期推迟、营养生长较旺盛、角果数较多、主花序及株高显著高于野生型。

Description

PLDα1基因在增加作物抗旱性及种子产量中的应用

技术领域

本发明属于植物分子育种和生物技术领域，具体涉及PLDα1基因在增加作物抗旱性及种子产量中的应用和一种增加作物抗旱性及种子产量的方法。

背景技术

随着气候的变化和干旱面积的逐年增加，干旱成为制约农作物产量的主要因素之一，灌溉农业已成为提高农业生产的重要措施。据统计，现代农业灌溉用水约占淡水资源的70%，农业生产的水资源的高效利用成为了现代植物学家关注的焦点。人们希望通过增加植物的灌溉用水来提高农业产量，然而地球上的淡水资源却在逐渐减少，提高作物自身的抗旱能力及对水分的利用效率成为了解决农业产量与自然资源之间矛盾的重要举措。陆地植物体内的绝大部分水分是通过气孔的蒸腾作用而散失的，研究表明相关基因的突变引起植物气孔丧失关闭功能可导致植物流失更多水分，从而使植物的抗旱能力显著下降。因此，通过调控气孔关闭减少水分蒸腾作用是提高植物水分利用及耐旱能力的重要策略之一。

有关植物应答水分胁迫的生物过程及其调控机制已进行了大量的研究，并取得了显著进展。脱落酸（ABA）是植物应答逆境胁迫包括干旱和盐胁迫过程中产生的植物激素，其在调控植物气孔关闭中起了重要的正调控作用。植物响应水分缺失而累积的ABA可有效促进气孔的关闭，从而降低植物体内水分经气孔的流失，提高其抗旱能力。近期的研究表明，磷脂酸(PA)在参与ABA调控气孔关闭过程中起了重要作用。研究表明PA与ABA信号过程中的负调控因子ABI1（属于phosphatase2C）存在互作，并将ABI1蛋白锚定在质膜上，从而抑制ABI1对ABA信号的负调控效应，促进了ABA关闭气孔的效应。此外，PA可与NADH的氧化还原酶结合而增加植物中ROS或者NO的含量。最近研究还表明PA可直接结合并激活鞘氨醇激酶，导致鞘氨醇磷酸化而诱导气孔的关闭。

植物PA可直接源自于磷脂酶D(PLD)催化的磷脂。植物PLD比动物PLD更为复杂多样，哺乳动物和人类基因组仅含有2个PLD，而拟南芥基因组含有12个PLD基因，水稻含有17个PLD。拟南芥PLD可分为PLDα(1,2,3)、PLDβ(1,2)、PLDγ(1,2,3)、PLDδ、PLDε和PLDζ(1,2)(Wangetal.,2006,QinandWang,2002)。其中，除PLDζ1和PLDζ2含动物PLD所特有的pleckstrinhomology(PH)和phoxhomology(PX)结构域(QinandWang,2002)，其它10个PLDs的N端均具Ca²⁺依赖性的磷脂结合位点C2结构域。近期对拟南芥PLD家族进行系统研究，表明不同的PLD的分子调控各不相同，包括酶激活因子的差异（如Ca²⁺、游离脂肪酸和磷脂酰肌醇等）(Wangetal.,2006)、底物的偏好性(Hongetal.,2009a)、亚细胞定位和组织表达的特异性(QinandWang,2002,ZhaoandWang,2004)。其生化特性和时空分布的差异性暗示了植物PLD的生物学的显著效应。不同种类的PA（酰基种类）具有不同的生物学效应。近来通过分子遗传操作结合多种技术已经逐步阐明了植物PLD广泛参与多种生物学过程，例如PLDα1调控气孔导度、水分胁迫、叶片衰老和激素响应过程(Fanetal.,1997,Sangetal.,2001,Zhangetal.,2004)；PLDδ参与细胞凋亡、糖代谢、低温和冻害胁迫反应(Lietal.,2004)；PLDα3正调控高渗透胁迫过程(Hongetal,2008b)；PLDε介导植物的氮信号响应和生长调控（Hongetal.,2009a)；PLDζs参与植物磷的循环利用、生长素转运和根毛发生等过程（Lietal.,2006a,Lietal.,2006b,Cruz-Ramírezetal.,2006)。植物中，PLDα1和PLDδ都可以在植株响应ABA及促进气孔关闭方面起到调节作用，然而，它们却发生在该信号途径的不同阶段(Guoetal.,2012b)。PLDδ的作用主要发生在植物对活性氧（ROS）的响应阶段(Zhangetal.,2003)，并且PLDδ的超表达植株对冻害的耐受能力增强(Lietal.,2004)；而PLDα1的作用却发生在PLDδ的上游并促进ROS的产生(Zhangetal.,2009)。

PLDα1是PA产生的主要贡献者。PLDα1大量表达于多种植物的不同组织器官中。通过分子遗传操作改变拟南芥PLDα1的表达,PLDα1基因剔除、下调表达和超表达结果表明PLDα1所产生的PA在介导ABA信号调控气孔导度中具有重要的作用。干旱或ABA处理可促进PLDα1的活性而产生PA,从而促进气孔的关闭。在应答干旱胁迫过程中，PLDα1缺失突变体pldα1所产生的PA显著低于野生型，仅为野生型PA含量的20%(Zhangetal.,2004)，由此导致植物在干旱过程中气孔闭合程度显著低于野生型而增强了水分蒸腾作用，从而明显降低了植物的抗旱性；而在烟草中超表达拟南芥PLDα1，则显著增强了干旱早期水分胁迫的耐受力(Sangetal.,2001,Hongetal.,2008a)。在其它植物中，高活性的PLD也与干旱有着密切的关系。这些证据充分表明PLDα1及其产生的PA在调控植物水分蒸腾作用中的重要性，也显示了PLDα1在改善作物的水分高效利用和抗旱性方面具有潜在的应用价值。目前有关PLDα1在改良植物抗逆性方面多局限于模式生物拟南芥中，有关PLD在作物抗旱性中的作用尚未清楚。作为膜磷脂的水解酶，PLDα1高表达量和高活性具有信号转导和膜脂分解代谢的双重生物学效应：一方面PLDα1的活性可产生信号分子PA（PLDα1-PA，在PLDα1酶作用下产生的PA），另一方面，作为膜脂水解酶，高活性的PLDα1又可导致膜的降解，导致逆境下细胞质膜透性的增加，从而降低植物的抗逆性。实验表明超表达PLDα1植株在干旱早期的抗水分胁迫能力强于对照野生型植株，而延长干旱时间则出现相反效应，即超表达植株的抗旱性显著低于野生型。

发明内容

本发明的目的是为解决PLDα1-PA介导ABA信号正调控水分胁迫和PLDα1-PA作为分解代谢的负调控抗逆性的矛盾，将克隆的PLDα1基因在气孔保卫细胞中特异性表达的启动子AtKat1_pro(Nakamuraetal.,1995)的调控下，将PLDα1基因通过农杆菌介导、遗传转化油菜春性品种和半冬性品种，获得气孔特异性超表达PLDα1基因的转化植株，并从分子、代谢、细胞学等方面分析AtPLDα1（从模式植物拟南芥中克隆的PLDα1）在油料作物应答水分胁迫过程中的生物学效应，以及对植株生长、农艺性状、田间产量和油脂品质的影响，为植物抗旱性的遗传改良和分子育种探索新途径。

所述PLDα1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，或者与SEQIDNO：1所示的核苷酸序列相似性大于或等于70%。

所述在气孔保卫细胞中特异表达的启动子AtKat1_pro，其基因的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。

一种增加油菜抗旱性及种子产量的方法，包括以下步骤：

1）种子的灭菌及萌发：将油菜种子灭菌消毒后播种到M₀培养基中，25℃下暗光培养5天得幼苗；

2）农杆菌的培养：挑取含有从模式植物拟南芥中克隆的PLDα1基因质粒的农杆菌单菌落，将农杆菌单菌落放到含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中培养1-2天，离心，倒掉上清，用等体积的DM溶液重悬菌体并将菌液稀释10倍；

3）外植体的制备和侵染：切取步骤1）的幼苗的下胚轴，将其在步骤2）配制好的菌液中侵染30min，使切口充分和菌液接触；

4）愈伤组织的培养：将侵染后的外植体转到已灭菌的吸水纸上，待残留的菌液吸干后将外植体转到M₁培养基中，25℃下暗光培养2天；然后转移到M₂培养基中，在25℃下光照培养3周；再转移到M₃培养基中，以后每2-3周继代一次，直至长出绿芽；将绿芽切下并转入到M₄培养基中，生根2-4周，得转基因油菜幼苗并将其移栽到大田，

其中，各培养基和DM溶液的配方及PH值如下：

M₀培养基：2.2g/LMS粉末，10g/L琼脂粉，pH值为5.8-6.0；

M₁培养基：4.4g/LMS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激动素，100μM乙酰丁香酮，6g/L琼脂糖，pH值为5.8；

M₂培养基：4.4g/LMS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激动素，30μM硫代硫酸银，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8；

M₃培养基：4.4g/LMS粉末，10g/L葡萄糖，0.25g/L木糖，0.6g/L2-（N-吗啉代）乙磺酸，2mg/L玉米素，0.1mg/L吲哚乙酸，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8；

M₄培养基：4.4g/LMS粉末，10g/L蔗糖，300mg/L羧苄青霉素，9g/L琼脂粉，pH值为5.8；

DM溶液：4.4g/LMS粉末，30g/L蔗糖，100μM乙酰丁香酮，pH值为5.8。

本发明的积极效果：

1.气孔特异性超表达AtPLDα1的油菜可以有效调控植株响应干旱胁迫过程中的气孔关闭，从而减少叶片的水分蒸腾作用，提高植株的保水能力和抗旱性。

2.气孔特异性超表达AtPLDα1的油菜植株在高渗透胁迫条件下（NaCl、PEG6000）显著增强生物产量的积累。

3.在干旱胁迫下OE植株（overexpression，超表达植株）质膜通透性显著小于野生型，且OE植株受干旱诱导的相关基因如ABI1、ABI2和RD29B等表达量均显著低于野生型（wildtype，WT），表明OE植株对高渗透胁迫的敏感性明显小于野生型。

4.在田间自然生长条件下，转基因油菜植株在生长早期或中期遭遇干旱季节时则表现出花期推迟、营养生长较旺盛、角果数较多、主花序及株高显著高于野生型，从而使其单株产量高于WT。此外，超表达AtPLDa1也促进油菜种子的活力及其幼苗对盐胁迫的耐受性。

5.干旱条件下转AtPLDα1的油菜种子油脂含量显著高于野生型、且油脂成分发生变化。

附图说明

图1是pCAMBIA1300载体上AtPLDα1超表达构建模式图。

图2是60天大小的中双9号品种在连续失水5天后所出现的表型照片。

图3是ABA对Westar品种中AtPLDα1-OE和WT植物气孔的开度的影响曲线图。*和**分别表示与WT比较时，t值显示具有显著性（p＜0.05）和极显著性（p＜0.01）。

图4是中双9号材料中OE及WT材料种子的单株产量对比图。n=6-9,r=3。英文字母表示用Duncan’s多因素方差分析时（P<0.05）的显著性差异。

具体实施方式

实施例1：油菜遗传转化(油菜转基因手段-暗光培养法)

种子的灭菌及萌发：用75%酒精浸泡种子1min后,用无菌水将种子冲洗一遍。然后用0.15%的HgCl₂（含0.1%（v/v）Tween20）消毒15min,再用无菌水冲洗3-5次；然后将种子播种到M₀培养基中，每皿（直径为3cm）均匀播种18粒种子。将培养皿放到无菌的塑料培养盒中，暗光条件下25℃培养5天。

农杆菌的培养：挑取农杆菌（GV3101，含有AtPLDα1基因质粒的菌株，通过商业途径购买）单菌落放到LB液体培养基（含50mg/L卡那霉素）中培养1-2天，最佳的侵染OD值为0.6-0.8。通过分光光度计检测菌液在600nM吸收光条件下的浓度，当OD值为0.6-0.8时将培养好的菌株在离心机中6000rpm离心10min，倒掉上清；用等体积的DM（DilutionMediμm）液体重悬，再在同样的条件下离心一次；弃上清，再用等体积的DM溶液悬浮。取2ml菌液，用20ml的DM溶液稀释（1:10）（在灭菌的培养皿中进行）。

外植体的制备和侵染：用无菌的镊子和解剖刀切取暗光培养的幼苗的下胚轴，每个外植体的长度均匀为0.8cm左右，保持外植体的切口整齐。将切好的外植体浸泡在已经配制好的菌液中，侵染30min,期间用移液器吸打4-5次，使切口充分和菌液接触。

愈伤组织的培养：将侵染后的外植体转到已灭菌的吸水纸上，待残留的菌液被吸干后将外植体转到M₁培养基中，每皿40-50个外植体，在同样的暗光条件下共培养2天；将共培养后的外植体转移到M₂培养基中，在25℃、光照条件下进行培养。以后的培养均在光照条件下进行（25℃）；3周后的外植体的愈伤组织基本上脱分化，将其转到M₃培养基中，以后每2-3周继代一次，直至长出绿芽；将生长有明显基节的绿芽切下并转入到生根培养基中，生根2-4周；从根生长良好的幼苗上取少量叶片，用shortybuffer法提取叶片DNA，并用PCR检测植株中是否有PLDα1的插入；选择少量未转化成功的幼苗作为野生型（WT），和PLDα1超表达的苗一起移栽到大田并自交留种，以便为后续试验提供材料来源。

其中，各培养基和DM溶液的配方及PH值如下：

M₀培养基：2.2g/LMS粉末，10g/L琼脂粉，pH值为5.8-6.0；

M₁培养基：4.4g/LMS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激动素，100μM乙酰丁香酮，6g/L琼脂糖，pH值为5.8；

M₂培养基：4.4g/LMS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激动素，30μM硫代硫酸银，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8；

M₃培养基：4.4g/LMS粉末，10g/L葡萄糖，0.25g/L木糖，0.6g/L2-（N-吗啉代）乙磺酸，2mg/L玉米素，0.1mg/L吲哚乙酸，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8；

M₄培养基：4.4g/LMS粉末，10g/L蔗糖，300mg/L羧苄青霉素，9g/L琼脂粉，pH值为5.8；

DM溶液：4.4g/LMS粉末，30g/L蔗糖，100μM乙酰丁香酮，pH值为5.8。

实施例2：PLDα1转基因植株的鉴定及表达

（1）PLDα1转基因植株的鉴定

经过农杆菌转化的植株在M₄培养基中长出根后，取适量的叶片（最好是新长出的离培养基较远的叶片，防止农杆菌的污染）提取DNA，用引物KatI-p/PLDα1-A对叶片DNA进行PCR检测，同时以质粒作为正对照，WT植株的DNA为负对照，鉴定抗卡那霉素的再生植株基因组中是否成功转入AtPLDα1基因。从结果中可以看出大部分植株都可以扩增出与质粒为模板的PCR产物大小一致的片段，而少数几个株系及对照野生型WT没有扩增出目前片段，说明了以暗光培养法的遗传转化手段可以成功地将以农杆菌GV3101介导的PLDα1质粒转化到油菜基因组中，且转化效率比较高。

在上述方法中，所用引物对的核苷酸序列如下所示：

引物对KatI-p/PLDα1-A：

正向引物KatI-p5′-CCATAAAGGTCCCAACAGA-3′，

反向引物PLDα1-A5′-GTCATCCCAAACAAGCAAA-3′。

（2）转PLDα1基因植株RNA的表达

为了在植物叶片气孔保卫细胞中特异性超表达AtPLDα1基因，将拟南芥基因PLDα1连接到控制气孔保卫细胞的特异性启动子AtKat1_pro之后，并将AtPLDα1基因通过农杆菌介导的转基因手段导入2个油菜品种Westar（春性材料）和中双9号（半冬性材料）基因组中。用AtPLDα1特异性引物RTAtPLDα1-F/R及油菜Actin引物对转基因及WT材料的RNA进行Real-timePCR分析，发现OE3-3及OE7-1这两个材料有均有AtPLDα1的表达，而对照WT中基本上检测不到AtPLDα1的表达。实验结果说明了基因AtPLDα1已成功在油菜中表达。

在上述方法中，所用分子标记引物对的核苷酸序列如下所示：

引物对BnRT-actin-F/R：

正向引物BnRT-actin-F5′-TGTTCCCTGGAATTGCTGACCGTA-3′，

反向引物BnRT-actin-R5′-TGCGACCACCTTGATCTTCATGCT-3′。

引物对RTAtPLDα1-F/R：

正向引物RTAtPLDα1-F5′-GCCCAGGGTCTTGAGGAAGATCCAAGAAACTA-3′，

反向引物RTAtPLDα1-R5′-GCTCATACTCTCCATCTTTCTTGACCTCACGG-3′。

（3）转基因植株蛋白质的表达

为分析AtPLDα1蛋白是否在油菜中表达，用拟南芥PLDα1蛋白的抗体（与拟南芥PLDα1蛋白N端有高度的结合能力）检测了叶片下表皮中的PLDα1蛋白的表达情况，发现Westar品种中OE3-3、OE5-4、OE7-1株系和对照WT都有含有PLDα1，中双9号中OE11-20、OE13-6、OE13-24及其对照WT也出现相同结果。然而，当用相同体积、相同质量的OE和对照WT材料的蛋白进行westernblotting分析时，OE材料中PLDα1蛋白的表达量明显高于对照WT。为了检测保卫细胞中AtPLDα1蛋白的表达情况，利用PLDα1特异性抗体对植株叶片下表皮进行原位杂交试验。对比底物在WT的气孔保卫细胞中显现出的颜色，发现OE材料中的颜色要深很多。WT中仍然出现颜色是因为油菜本身的PLDα1所产生的对抗体的交叉反应，而且气孔周围的颜色也是由于油菜叶肉细胞内自身的PLDα1所产生的对PLDα1抗体的交叉反应。以上结果表明，AtPLDα1基因成功在油菜中表达，且AtPLDα1在油菜叶片气孔保卫细胞中的表达明显高于对照WT。

实施例3：AtPLDα1-OE植株增强干旱的耐受能力及种子产量

（1）AtPLDα1-OE植株的气孔对ABA更敏感

为了检测AtPLDα1-OE植株对水分利用的效果，将Westar及中双9号的转基因植株种植在土壤中，置于生长室内生长。用打孔器从23天叶年的完全展开叶上取下约0.5cm²的叶圆盘，并将其放置在诱导气孔开放的buffer中（光照条件下）孵育1h，显微镜下观察气孔开放的情况。待90%左右的气孔都打开时，向buffer中加入50μM的ABA继续孵育30min，在显微镜下观察气孔导度的变化。结果表明在气孔被光诱导张开时，AtPLDα1-OE植株的气孔孔径与WT植株的气孔大小没有明显差别。然而，加入ABA30min后，AtPLDα1-OE植株的气孔开度显著小于WT植株的气孔开度（图3）。结果表明PLDα1参与ABA信号调控气孔关闭，即AtPLDα1在油菜气孔保卫细胞中超表达可增强其对ABA信号的响应，促进气孔的关闭。

（2）AtPLDα1-OE植株的离体叶片水分流失减少

从6叶期的OE及WT植株上取下相同部位、相同叶龄及相似大小的完全展开叶，并将其置于植物生长的条件下，每10min称量一次其重量并计算离体叶片的相对失水率。结果表明OE植株的相对失水率要小于WT植株的相对失水率，并且当植物的叶片离体160min时，OE植物离体叶片的相对失水率比WT植株离体叶片的相对失水率要小30%以上。此结果表明OE材料离体叶片水分散失的速度要远低于WT材料离体叶片水分散失的速度。

（3）AtPLDα1-OE植株叶片的相对含水率增加、相对离子电导率降低

为观察活体植物叶片对水分的利用效果，将Westar及中双9号材料种植在生长室内并保持正常生长状态，当植物生长到60天左右时停止浇水，5天后发现Westar及中双9号的野生型WT对照植株的叶片出现了严重萎蔫的现象，而OE材料基本上仍然处于未失水的状态（图2）。该结果表明当植物遇到干旱时，相对于WT材料而言，OE材料的叶片可以明显地减少水分的蒸腾作用，使植株在干旱条件下保持更多水分，增强其抗旱能力。与此同时，检测了Westar材料叶片的相对含水量及相对电导率。结果表明植物在干旱胁迫过程中OE材料叶片相对含水量比WT增加约3%，而正常浇水的OE植株叶片相对含水量与WT之间没有显著差异。电导率高低是衡量植物细胞质膜透性即细胞膜完整性的重要指标之一，分析发现在正常浇水条件下OE与野生型WT间的电导率没有显著差异，而在干旱条件下，OE材料叶片的相对电导率也显著低于对照野生型。这些实验数据表明，超表达PLDα1使植株在应答水分胁迫过程中减少水分散失，减低植株因干旱缺水导致细胞膜的伤害，提高植物抗旱性。

（4）干旱条件下AtPLDα1-OE植株中相关基因的表达量

从干旱处理5天和未经过干旱处理的WestarOE及WT材料的叶片中提取RNA并用RealtimePCR检测其干旱相关基因的表达量。RealtimePCR结果显示未经干旱处理的植株中，OE及WT材料自身的基因BnPLDα1表达量没有差别，其它受干旱诱导的相关基因ABI1，ABI2，RAB18，RD29B及ERA1在OE植株中表达量均显著高于WT中相对应基因的表达量；然而，经干旱处理5天后，OE材料自身基因BnPLDα1表达量比相应的野生型WT降低50%，而OE材料中干旱诱导的相关基因ABI1，ABI2，RAB18，RD29B及ERA1的表达量与其对应的WT中的相比几乎下降了20-90%。实验数据表明了在同等干旱条件下OE材料受到的旱胁迫显著低于对照WT，暗示着OE植物的抗旱能力比其对应的WT植株要强。

（5）田间干旱条件下的PLDα1-OE材料加速气孔关闭

按照随机区组设计，分别将Westar及中双9号的OE及共分离的WT材料种植田间，3个重复。由于受到干旱天气的影响，植物生长土壤含水量下降到12.8%（田间土壤为粘土，土壤饱和含水量为58%），测定了田间Westar材料植株叶片的相对含水量及相对离子电导率。发现PLDα1-OE材料叶片含水量均高于WT，并且此时OE材料叶片的相对离子电导率也略低于WT材料。当植株长到第58天时，用光合仪测定了植物叶片的水分蒸腾速率及气孔导度。结果表明OE材料中的气孔导度显著低于WT材料，且差异达到极显著。OE植株叶片的失水速率也显著性小于WT材料。此数据表明植物受到干旱胁迫影响时，OE材料可以通过快速减小气孔开度而减少水分的蒸腾作用，进而有效地保持了植株体内水分。

（6）田间生长的PLDα1-OE材料花期推迟及生长加快

以WT植株作参考，田间Westar材料生长到第145天时进入盛花期，中双9号植株则生长到160天时进入盛花期。此时，调查所有材料的开花率，发现WestarOE材料的开花植株数比其WT少了近20-70%，且OE材料进入盛花期的时间与WT植株相比推迟了3-6天；而在中双9号中，OE材料的开花植株数则比其WT少了10-20%，OE材料进入盛花期的时间比其对应的WT植株推迟了2-4天。由此表明超表达PLDα1导致油菜植株花期延迟，增加了植株的营养生长时期。

当Westar材料在田间生长到第145天时，每隔1天测量一次株高并计算植株生长速率，发现Westar材料的OE植株生长速率明显高于WT材料。当中双9号材料在田间生长到第157时，同样每隔1天测量一次株高并计算其生长速率，数据表明PLDα1在中双9号和Westar品种中超表达均可促进植物生长

（7）田间PLDα1-OE材料农艺性状的变化

当植物成熟后，将收获的植株放置于挂藏室内后熟2个星期后，调查植株的各项农艺性状。结果表明：在Westar材料中，OE3-3、OE5-4及OE7-1的植物株高分别比其对应的WT材料的植物增加了5%、21%及39%，但比较其主花序长度，发现只有OE5-4表现出比对应的WT的主花序有显著性生长外，其它OE材料与WT相比均无显著性差异。而在有效分枝方面，OE3-3和OE7-1植株出比其对应的WT植株拥有更多的有效分枝；在中双9号材料中，2个OE株系的株高均比其对应WT增长5%，主花序长度也要比其WT增加7%，且中双9号的OE材料的有效分枝数比其对应的WT提高10%。然而，对OE及WT材料植株主花序的角果总数及角果长度进行统计后，发现在Westar及中双9号两个品种中，OE材料与其对应的WT材料均无显著性差别或者OE材料不同的株系表现出的差异较大。

（8）田间PLDα1-OE材料种子产量提高

种子产量是油菜育种生产中最重要的目标之一，植株收割并后熟后，考察植株种子产量相关的农艺性状，其中包括千粒重、单株种子产量及角果数等。结果发现两个品种中OE材料植株的每角果种子数及种子的千粒重与其对应的WT材料均无显著差别。但Westar材料中的PLDα1-OE植株的总角果数却比其对应的WT材料增长约15%；而中双9号材料中的PLDα1-OE植株的总角果数比其对应的WT植株的总角果数增加20-50%。经分析，Westar材料的OE单株种子产量比其对应的WT植株提高20-50%，而中双9号材料OE种子产量则比其对应的WT植株增产50%（图4）。结果表明油菜超表达PLDα1可促进主花序生长、并显著提高角果数，从而增加了种子产量，某些OE植株也表现出有效分枝数增加，进而促进种子产量的提高。

（9）田间PLDα1-OE材料种子油分的改变

油脂组分是油菜种子的重要经济性状之一，通过气相色谱GC技术分析油菜种子的油脂含量和组分。分析结果显示中双9号的OE材料中，2个OE株系的含油量与对应的WT相比均没有显著差异，而OE13-24的含油量却显著低于对应的WT。然而，在Westar材料中，2个OE株系的种子含油量比其对应的WT提高约9%，而OE7-1材料的种子含油量与WT相比没有差别。而在油分的组成方面，两个油菜品种Westar及中双9号中，PLDα1-OE材料种子均比野生型积累更多的油酸（C18:1）。Westar材料中油酸的积累促进了种子总含油量的提高，但是中双9号材料中，油酸积累的同时伴随着亚麻酸（C18:3）含量的降低，因而种子总含油量保持不变或降低。

（10）PLDα1-OE种子和幼苗对ABA、NaCl及干旱的响应

由于种子油分发生了改变，所以对种子的发芽及其在不同胁迫条件下的萌芽率进行了统计。将OE材料及其对应的WT材料的种子表面灭菌后播种到含有或不含胁迫因子（不同浓度的ABA、NaCl或者PEG6000）的1/2MS固体培养基上，每2天统计一次种子的发芽数目，待8天或10天后，种子的发芽率维持稳定后，计算种子在不同浓度胁迫因子下的发芽率。结果表明随着ABA、NaCl及PEG6000的浓度的提高，Westar材料中的OE及其对应的WT材料的种子萌芽率随之降低，且OE材料种子萌芽率降低的幅度高于其对应的WT材料，特别是在高盐浓度（150mMNaCl）条件下，OE材料种子萌芽率比WT降低了50%。同时，中双9号材料中OE植株的种子也表现出萌芽率降低的幅度大于其对应的WT，且与Westar材料相比，中双9号的OE材料只需少量ABA即可抑制种子萌发。此数据表明了OE材料的种子比其对应的WT材料的种子对外界环境的胁迫更加敏感，且不同品种之间的敏感性也存在差异。

将中双9号材料的种子播种到用水润湿的纱布上13天后，将幼苗转移到含有100mMNaCl、10%PEG6000和50μMABA的MS液体培养液中，每周更换一次含有相同浓度胁迫因子的培养基，待植物生长30天后，称取植物各部分的鲜重及干重。结果表明在所有的对植物生长不利的胁迫因子中，与未加胁迫因子的培养液中的WT相比，NaCl对WT植物生物产量的积累影响最大，含NaCl的培养液中的WT植株生物积累比其在对照培养液中的减少了近85%，而生长在含ABA及PEG6000培养液中的WT植株生物积累比其在正常培养液中的只减少了大约45%。然而，所有的OE材料在正常及含ABA、NaCl及PEG6000的胁迫因子的培养液中均表现出比其对应的WT材料积累更多的生物产量。特别是在100mMNaCl中，OE材料的生物产量积累比对应的WT要多出2倍，并且此时的OE材料的叶片面积明显大于其对应的WT材料，而在正常生长条件下OE与WT材料之间没有明显差异。实验数据表明超表达PLDa1亦可显著提高幼苗的抗高渗透胁迫，在盐胁迫方面尤为明显。

Claims (1)

1.一种增加油菜抗旱性及种子产量的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)种子的灭菌及萌发：将油菜种子灭菌消毒后播种到M₀培养基中，25℃下暗光培养5天得幼苗；

2)农杆菌的培养：挑取含有从模式植物拟南芥中克隆的PLDα1基因质粒的农杆菌单菌落，将农杆菌单菌落放到含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中培养1-2天，离心，倒掉上清，用等体积的DM溶液重悬菌体并将菌液稀释10倍；

3)外植体的制备和侵染：切取步骤1)的幼苗的下胚轴，将其在步骤2)配制好的菌液中侵染30min，使切口充分和菌液接触；

4)愈伤组织的培养：将侵染后的外植体转到已灭菌的吸水纸上，待残留的菌液吸干后将外植体转到M₁培养基中，25℃下暗光培养2天；然后转移到M₂培养基中，在25℃下光照培养3周；再转移到M₃培养基中，以后每2-3周继代一次，直至长出绿芽；将绿芽切下并转入到M₄培养基中，生根2-4周，得转基因油菜幼苗并将其移栽到大田，

其中，各培养基和DM溶液的配方及PH值如下：

M₀培养基：2.2g/LMS粉末，10g/L琼脂粉，pH值为5.8-6.0；

M₁培养基：4.4g/LMS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激动素，100μM乙酰丁香酮，6g/L琼脂糖，pH值为5.8；

M₂培养基：4.4g/LMS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激动素，30μM硫代硫酸银，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8；

M₃培养基：4.4g/LMS粉末，10g/L葡萄糖，0.25g/L木糖，0.6g/L2-(N-吗啉代)乙磺酸，2mg/L玉米素，0.1mg/L吲哚乙酸，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8；

M₄培养基：4.4g/LMS粉末，10g/L蔗糖，300mg/L羧苄青霉素，9g/L琼脂粉，pH值为5.8；

DM溶液：4.4g/LMS粉末，30g/L蔗糖，100μM乙酰丁香酮，pH值为5.8。