CN103045640B

CN103045640B - 丹波黑大豆SGF14a基因的植物表达载体及其应用

Info

Publication number: CN103045640B
Application number: CN201310000464.8A
Authority: CN
Inventors: 陈丽梅; 郭传龙; 李松; 周磊; 王琳
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2013-01-04
Filing date: 2013-01-04
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2033-01-04
Also published as: CN103045640A

Abstract

本发明公开了一种丹波黑大豆SGF14a基因的植物表达载体及其应用，本发明首先发现在铝胁迫下RB根中SGF14a基因被显著诱导表达，然后从RB根中克隆得到SGF14a基因的全长序列，并通过Gateway技术构建了植物表达载体pK-35S-SGF14a，经农杆菌介导的叶盘转化法转化野生型烟草，筛选得到能够正确表达SGF14a基因的转基因烟草，最后对获得的转基因烟草进行了耐铝能力分析。实验结果表明在烟草中过量表达外源SGF14a基因能够显著提高烟草的耐铝及耐受酸性土壤能力。本发明中首次报道SGF14a基因能够参与铝胁迫应答，并且通过Gateway技术构建的植物表达载体pK-35S-SGF14a和获得的转基因烟草能够为进一步研究SGF14a基因的在铝胁迫应答中的功能奠定基础，以及为研究铝胁迫应答机制提供了新的基因资源和基因工程操作手段。

Description

丹波黑大豆SGF14a基因的植物表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种丹波黑大豆（简称RB）的14-3-3a基因（SGF14a）的植物表达载体及其在提高植物耐铝能力中的应用，属于植物分子基因工程领域。

背景技术

14-3-3蛋白最早是在动物脑组织中发现的，根据其在DEAE中的迁移率将其命名为14-3-3蛋白，起初被认识是脑组织中特异性蛋白。最近几十年的研究发现，14-3-3蛋白存在于所有真核生物中，包括动物、植物和微生物。植物14-3-3蛋白是一个大的基因家族，存在很多不同的亚型。拟南芥中存在12种不同亚型的14-3-3基因，烟草中有12种，水稻中有6种，大豆中存在18种14-3-3基因，其中有16种能够发生转录，并且不同亚型的14-3-3基因表达还存在明显的组织特异性。

植物14-3-3蛋白通常以同源或异源二聚体的形式存在，并且能够与磷酸化靶蛋白相互作用，调节一系列生物过程，如代谢、生长、发育和信号传导途径等。植物14-3-3蛋白能够参与多种生物过程的调节。14-3-3蛋白能够参与GA、ABA、BR和乙烯等植物激素信号通路来调控植物生长发育过程。植物14-3-3蛋白在调控植物体内营养物质代谢过程中也发挥着重要作用，14-3-3蛋白能够通过调节NR、SPS和GS等代谢酶的活性来调控植物体内碳氮代谢过程。并且14-3-3蛋白也能够调节质膜中的K⁺泵和H⁺-ATPase酶的活性来维持细胞内外电化学梯度，来调控植物体内的物质运输过程。同时，植物14-3-3蛋白通过调节叶片中质膜H⁺-ATPase的活性，来调控气孔的开闭，从而对渗透胁迫作出响应。

植物14-3-3蛋白也能够参与多种胁迫的应答。在逆境胁迫的条件下，植物14-3-3蛋白也能对多种生物和非生物胁迫作出应答，包括盐胁迫、磷缺乏、干旱胁迫、冷胁迫和重金属胁迫等非生物胁迫，以及损伤和病原菌侵染等生物胁迫。用盐和冷处理的水稻愈伤组织和幼苗中整个14-3-3基因（OsGF14）家族的表达上调。此外，其他的胁迫包括热、氧化和重金属对水稻OsGF14基因的表达也有不同程度的影响，OsGF14b和OsGF14g几乎可以被所有的胁迫诱导，水稻经损伤处理48h后能够降低OsGF14e基因的表达。磷饥饿使拟南芥中14-3-3y、m的转录水平下降。长期的钾缺乏导致拟南芥中14-3-3c、j的蛋白表达水平下降，14-3-3w的蛋白表达水平增加。另外，14-3-3蛋白在植物免疫响应中具有重要作用。在Cf9/Avr9介导的宿主免疫应答中10个番茄14-3-3基因中有3个能够被特异性诱导表达。最近研究表明，拟南芥14-3-3蛋白能够与RPW8.2蛋白相互作用，在R蛋白介导的宿主免疫应答中发挥着重要作用。

最近，许多研究者通过基因工程的手段增强或抑制植物14-3-3蛋白的表达来研究其功能。在马铃薯中过量表达14-3-3蛋白能够改变脂类、氨基酸和矿物质的组成，并且提高抗氧化能力提高，而抑制14-3-3蛋白的表达则出现相反的结果。在水稻中过量表达玉米的ZmGF14-6基因后能够增强水稻的抗旱能力，并且在棉花中过量表达拟南芥的GF14 λ基因后能够使棉花保持“常青”及增强了棉花对干旱胁迫的耐受。通过反义技术抑制拟南芥14-3-3蛋白的表达，促进了叶片中淀粉的积累及增加了植物的生长。

全世界大约有50%的可耕地属于酸性土壤，而铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一。铝毒早期最明显的症状是抑制根尖细胞生长和细胞分裂，从而抑制根生长，导致根系损伤，影响水分和养分的吸收，限制了植物的生长。近年来许多研究者都致力于植物耐铝机制的研究，目前的研究的结果表明能适应酸性土壤生长的植物有两种耐铝机制：外部排斥机制和内部耐受机制。外部排斥机制是根尖对铝的排斥，将铝阻止在细胞外；主要包括铝诱导有机酸分泌、根际pH的升高和细胞壁对铝离子的固定等。内部耐受机制主要是利用有机酸在共质体中螯合铝离子从而赋予植物对铝的耐受能力，减小铝的毒害。因此无论是外部排斥机制还是内部耐受机制都涉及到有机酸的参与，可见有机酸在缓解铝毒方面具有重要的作用。在铝胁迫下，许多铝耐受型的植物能够分泌不同的有机酸，从而抵御铝的毒害。例如，在铝胁迫后，大豆和玉米能够分泌柠檬酸、荞麦能够分泌草酸、铝耐受型小麦能够分泌苹果酸。

植物质膜 H⁺-ATPase是细胞膜上含量最丰富的蛋白，是植物生长所必须的，能够参与多种胁迫响应的调节，包括对铝毒和磷缺乏的调节等。并且，质膜 H⁺-ATPase主要是通过调节有机酸的分泌来调控植物对铝胁迫的应答。Shen等(2005)研究表明大豆能够通过增加质膜H⁺-ATPase基因表达、促进质膜H⁺-ATPase翻译后磷酸化，最终增强了大豆根尖柠檬酸的分泌，从而赋予了大豆对铝的高度耐受。而多年来的研究结果表明14-3-3蛋白在调节质膜H⁺-ATPase的活性中发挥着重要作用。质膜H⁺-ATPase是14-3-3蛋白在质膜上的主要结合靶点，14-3-3蛋白能够通过与质膜H⁺-ATPase的C末端结合而维持其磷酸化的稳定性并增加其活性。

然而目前有关14-3-3蛋白能否参与铝胁迫应答的研究报道非常少，还缺少具体可信的实验数据来确信14-3-3蛋白在铝胁迫应答中的作用。并且关于铝胁迫下14-3-3蛋白能否参与调节质膜 H⁺-ATPase活性的研究还未见报道。本发明技术是通过Gateway技术构建植物表达载体pK-35S-SGF14a，为研究大豆SGF14a基因在植物耐铝机制中的作用提供了有效的分子基因工程技术工具，方便了利用分子生物学的手段研究大豆SGF14a基因的功能。以及通过该载体转染野生型烟草所获得的转SGF14a基因的烟草在提高烟草耐铝能力中的应用，为通过基因工程的方法提高植物耐铝能力奠定了理论基础。同时，本发明中所获得的结果能够为我们通过基因工程手段提高植物耐铝能力提高了更多的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于通过Gateway技术构建丹波黑大豆（RB）的14-3-3a基因(SGF14a)的植物表达载体pK-35S-SGF14a，该载体中SGF14a基因在35S组成型启动子的控制下表达，通过农杆菌介导的叶盘转化法将该植物表达载体转入野生型烟草中后，外源SGF14a基因在35S组成型启动子控制下能够准确高效表达，同时获得的转基因烟草的耐铝能力及耐受酸性土壤的能力也明显提高。为了实现本发明的目的，本发明提供如下的技术方法：

1 、外源 SGF14a 基因的获得

根据GenBank上发表的大豆14-3-3a(SGF14a)基因全长序列，设计如下特异性引物：

SGF14a上游：5’- AAGCTT ATGTCGGATTCTTCTCGGGAGGAG-3’（含HindIII酶切位点）

SGF14a下游： 5’- CTCGAG CTATTCACCTGGTTGTTGCTTAGAT-3’（含有XhoI酶切位点）

2 、植物表达载体 pK-35S-SGF14a 的构建

Gateway（通路克隆）技术的LR反应构建目的基因的表达载体时，通过重组过程将外源基因连入植物表达载体pK2GW7.0中，不需要经过复杂的限制性内切酶的酶切和连接酶的连接过程，只需要把入门克隆载体和目的载体的质粒DNA混合并加入DNA整合或切离所需要的酶就能够完成目的基因表达载体的构建，因此用Gateway技术构建目的基因的表达载体不仅成功几率高，而且可以节省很多时间。因此，本文利用该技术来构建目的基因SGF14a的植物表达载体。构建策略如图3所示，以大豆cDNA为模板，用SGF14a基因的特异性引物，通过RT-PCR的方法扩增获得SGF14a基因的全长。然后通过T/A克隆获得pMD18T-SGF14a载体，对获得的阳性克隆进行测序检测外源基因SGF14a是否发生突变，再经过HindIII和XhoI双酶切pMD18T-SGF14a和pENTR载体，将SGF14a基因片段亚克隆到pENTR载体上，形成入门克隆载体pENTR-SGF14a。最后，在LR Mix Enzyme的作用下，入门克隆载体pENTR-SGF14a和植物载体pK2GW7.0进行LR反应，形成植物表达载体简称pK-35S-SGF14a。

、植物表达载体 pK-35S-SGF14a 转化农杆菌及转基因烟草筛选

通过电转化法将植物表达载体pK-35S-SGF14a转入农杆菌pMP105菌中，经壮观霉素（Spe）筛选得到阳性克隆，经菌液PCR检测阳性克隆中是否含有外源植物表达载体pK-35S-SGF14a质粒。然后通过农杆菌介导的叶盘转化法转染野生型烟草，将转染后的叶片在含有筛选因子Km（卡那抗生素）和Cef（头孢噻肟钠抗生素）的芽诱导培养基MS4固体上诱导外植体发芽，约15天继代一次。待有芽生成后，将芽从外植体上切下转入含Km和Cef的生根培养基MS上，进行根诱导生长，得到的能够抗Km的烟草幼苗还需进一步在基因和蛋白水平上检测外源基因是否正确表达。

、转基因烟草的检测

经Km筛选得到的能够抗Km的烟草植株，用CTAB法提取其基因组，分别以野生型烟草和转基因型烟草基因组为模板，用外源基因SGF14a的特异性引物，经过PCR分析检测，外源基因是否插入到野生型烟草基因组中。用TRIzoL Reagent（Invitrogen）提取野生型烟草和转基因烟草的RNA，在反转录为cDNA，以cDNA为模板，以SGF14a基因的特异性引物，经过RT-PCR法检测外源基因SGF14a能够正确转录。最后通过Western-blotting法从蛋白水平上分析外源基因在烟草中的表达情况。

、转基因烟草耐铝能力分析

由于我们的研究结果发现铝胁迫能够诱导RB根中SGF14a基因的表达，因此我们在野生型烟草中过量表达来自RB的SGF14a基因后，考察转基因烟草对铝胁迫的响应情况。将生长一致的野生型和转基因烟草在水培条件下培养2周后，再用50µM的AlCl₃(pH4.3)处理24h后，检测烟草根相对生长量的变化，以及铝胁迫后野生型烟草和转基因烟草的可溶性总蛋白、MDA和H₂O₂含量的变化。最后，由于铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一，因此为了模拟在实际生产中本发明的应用，我们将野生型烟草和转基因烟草在酸性土壤中培养，观察其在酸性土壤中的生长情况，考察本发明在实际生长条件下是否具有潜在的利用价值。

本发明相对于现有技术的优点和技术效果如下：

本发明提供的植物表达载体为进一步研究SGF14a对铝胁迫的应答提供了更好的基因工程操作手段和工具，以及通过该载体转染野生型烟草所获得的转SGF14a基因的烟草扩大了在增强作物对酸性土壤耐受性及在提高烟草耐铝能力中的应用，为通过基因工程的方法提高植物耐铝能力奠定了理论基础。同时，本发明中所获得的结果能够为我们通过基因工程手段提高植物耐铝能力奠定理论基础以及提供更多的基因资源。

附图说明

图1为本发明中铝胁迫下SGF14a基因转录水平变化电泳示意图；

图2为本发明中外源SGF14a基因的获得电泳示意图；其中A：SGF14a基因PCR产物；B：SGF14a基因PCR胶回收，图中M：Maker III；

图3为本发明中植物表达载体pK-35S-SGF14a的构建策略示意图；

图4为本发明中TA克隆载体pMD-18T-SGF14a的检测电泳示意图；其中A：pMD18T-SGF14a酶切检测，图中1-4表示不同质粒的编号，对照是没有经过酶切；B：pMD18T-SGF14a质粒和菌液PCR检测，图中M为Maker III；

图5 为本发明中入门克隆载体pENTR-SGF14a的检测电泳示意图，其中A是2B（pENTR）和pMD18T-SGF14a的HindIII和XhoI双酶切后胶回收产物；B是入门克隆载体pENTR-SGF14a双酶切检测，图中1-4表示不同质粒的编号，对照是没有经过酶切；C是入门克隆载体pENTR-SGF14a菌液和质粒PCR检测，图中M为Maker III；

图6为本发明中植物表达载体pK-35S-SGF14a的检测电泳示意图，其中A是植物表达载体pK-35S-SGF14a的HindIII和XhoI双酶切以及HindIII单酶切检测，图中A-D表示不同编号质粒经过HindIII和XhoI双酶切，a-d表示不同编号质粒经HindIII单酶切；B是植物表达载体pK-35S-SGF14a的质粒和菌液PCR检测，图中M：Maker III；

图7为本发明中植物表达载体pK-35S-SGF14a电转农杆菌pMP105后的菌液PCR检测电泳示意图；其中：1-6是获得的不同农杆菌单菌落编号，图中对照为没有加农杆菌单菌落；M为Maker III；

图8 是本发明转基因烟草的筛选流程示意图；

图9 是本发明转基因烟草的鉴定电泳示意图，其中A是基因组PCR检测示意图，图中负对照是没有加基因组；CK是以pK-35S-SGF14a的质粒为模板，作为正对照；WT：野生型烟草；4、9、11、12、13、19和23是获得的不同的转基因柱系；M：Maker III；B是转基因植物的RT-PCR检测示意图，图中WT：野生型烟草；4、9、11、12、13、19和23是获得的不同的转基因柱系；M：Maker III；C是转基因烟草Western-blotting检测示意图，图中WT：野生型烟草；S11、S19和S23是最终获得的转SGF14a基因烟草植株；

图10 是本发明铝胁迫处理后转基因烟草和野生型烟草相对根生长量和根中可溶性总蛋白含量的变化示意图，其中A是野生型烟草（WT）和转基因烟草（S11、S19和S23）经50µM的AlCl3溶液处理24h后根相对生长量（RRG）的变化示意图；B是野生型烟草（WT）和转基因烟草（S11、S19和S23）经50µM的AlCl3溶液处理24h后可溶性总蛋白含量变化示意图；

图11 是本发明铝胁迫处理后转基因烟草和野生型烟草根中丙二醛和H₂O₂含量的变化，其中A是野生型烟草（WT）和转基因烟草（S11、S19和S23）经50µM的AlCl₃溶液处理24h后MDA变化示意图；B是野生型烟草（WT）和转基因烟草（S11、S19和S23）经50µM的AlCl₃溶液处理24h后H₂O₂的变化示意图；

图12 是本发明酸性土壤中转基因烟草和野生型烟草的生长30天的状况示意图，图中WT是是野生型烟草；S11、S19和S23是获得的不同转基因柱系；

图13 是本发明酸性土壤中转基因烟草和野生型烟草的生长90天的状况示意图，图中WT是是野生型烟草；S11、S19和S23是获得的不同转基因柱系。

具体实施方式

本实施中采用的试剂主要分为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例 1 ：外源 SGF14a 基因的获得

（ 1 ）铝胁迫下 SGF14a 基因的表达水平检测

选取水培2周的生长一致的丹波黑大豆（RB）幼苗，先用pH4.3的0.5mM CaCl₂预处理过夜后，然后置于 50µM的AlCl₃溶液（含有0.5mM CaCl₂，pH 4.3）分别处理0(CK)、2、4、8、12和24 h后，收集的0.3g的1-2 cm根尖样品，速用液氮冻存，使用Trolz 试剂盒提取根尖总RNA，用DNase消化RNA中可能残留的DNA，经苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提纯化。从各RNA样品中取5µg，用M-MLV Reverse Transcriptase (Promega公司)反转录合成cDNA，以反转录合成的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，以28s rRNA为内参进行RT-PCR分析。根据SGF14a基因序列设计引物为：5-AGGTTGAGGAGTTGACGGTGGA-3，下游：5-GCGGATGGGATGAGGTTGGAC-3；28S rRNA的引物序列上游：5-CCCGTCTCAGATTGGTGTCATT-3，下游5-ATAGCGAGCAAGTCGGTGGATT-3。结果如图1所示，从图中可以看出，随着铝处理时间的延长，SGF14a呈现出逐渐上升的表达的趋势，这说明在铝胁迫下，能够显著诱导SGF14a基因的表达。

（ 2 ）外源 SGF14a 基因的克隆

提取RB根中总RNA，反转录为cDNA后，以反转录的cDNA为模板，用带有合适酶切位点的SGF14a基因引物扩增获得SGF14a的基因片段。引物序列上游为：5-AAGCTTATGTCGGATTCTTCTCGGGAGGAG-3（含HindIII酶切位点），下游为：5-CTCGAGCTATTCACCTGGTTGTTGCTTAGAT-3（含XhoI酶切位点）。实验结果如图2显示，从图中可以看出PCR产物大小大约在0.8Kb（图2A），与目的基因SGF14a的大小（774）类似。然后将PCR产物切胶，用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物（图2B），以便后续的T/A克隆。

实施例 2 ：植物表达载体 pK-35S-SGF14a 的构建

（ 1 ） T/A 克隆载体的构建

植物表达载体的构建策略如图3所示，将经胶回收得到的PCR产物（两端带有HindIII和XhoI酶切位点），在T4-DNA连接酶的作用下与pMD-18T载体进行连接，得到重组载体pMD18T-SGF14a。然后通过酶切和PCR来检测重组载体pMD18T-SGF14a是否连接正确。由于SGF14a基因两端含有HindIII和XhoI酶切位点，用这两个酶酶切重组载体的质粒，如果连接正确能够酶切出与目的基因大小类似的片段0.8Kb（图4A）。同时，经过菌液和质粒PCR检测发现都能够扩增出与目的基因大小类似的片段0.8Kb（图4B），而负对照并不能扩增出目的基因大小的片段。

（ 2 ）入门克隆载体 pENTR-SGF14a 载体的构建

用HindIII和XhoI双酶切pMD18T-SGF14a载体和原始入门克隆载体pENTR-2B，经过胶回收试剂盒分别回收酶切后的SGF14a和2B片段，结果如图5A所示。然后在T4-DNA连接酶的作用下将这两个回收的片段连接，得到入门克隆载体pENTR-SGF14a，最后在经过HindIII和XhoI双酶切和PCR检测该入门克隆载体pENTR-SGF14a连接是否正确。双酶切结果显示入门克隆载体酶切后能够切出与目的基因大小类似的片段0.8Kb（图5B），并且质粒和菌液PCR检测都能够扩增出目的基因大小的片段（图5C），这与预期结果是一致的。

（ 3 ）最终植物表达载体 pK-35S-SGF14a 的构建

在LR mix enzyme的作用下，将入门克隆载体pENTR-SGF14a与植物表达载体pK2WG7.0进行LR重组反应。然后对获得的重组反应后的最终植物表达载体进行酶切和PCR检测。LR反应步骤为在Gateway的LR反应体系中加入pENTR-SGF14a和Gateway的目的载体pK2GW7.0各150 ng，1μL LR Clonase II Enzyme Mix （Invitrogen），混均匀于25℃反应过夜，通过整合酶的作用把SGF14a基因整合到pK2GW7中，获得SGF14a的植物表达载体pK-35S-SGF14a。由于在pK2WG7.0载体上含有HindIII酶切位点，如果外源目的基因SGF14a（两端带有HindIII和XhoI酶切位点）正确重组进入pK2WG7.0中，则经过HindIII和XhoI双酶切后能够得到0.8Kb和0.4Kb（片段太短酶切后不易观察到）片段，以及经过HindIII单酶切后能够得到1.2Kb的片段，酶切后的结果与预期都一致（图6A）。菌液和质粒PCR后也扩增到了与目的基因大小一致的0.8Kb片段（图6B）。

实施例 3 ：植物表达载体 pK-35S-SGF14a 的转化农杆菌及转基因烟草筛选

取少量检测正确的植物表达载体pK-35S-SGF14a质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液至杯底；将电转化杯置于电转化仪滑槽中，电击后，立即取出电转化杯迅速加入0.5mL SOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃ 200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃其上清至100μl将细胞悬浮；将细菌涂布带有抗生素的LB固体培养基上，28℃培养2天；挑选阳性克隆，进行菌液PCR检测，菌液PCR扩增结果中可以看到能够得到0.8Kb的大小片段（见图7，表1）。

表1：电转农杆菌参数

参数	数值
		Voloage (V)	2400
Capacitation(μF)	25
		Resistance(Ώ)	200
Cvette(mm)	1

将检测正确的农杆菌在28℃大量培养，当菌液OD值达到1.0左右时，收集菌液，并用MS液体培养基清洗菌体2-3次，最后用MS悬菌使菌液浓度达到0.5左右，用该菌液侵染野生型烟草。将野生型烟草种子消毒后播种于普通MS培养基中，获得烟草无菌幼苗，选取无菌野生型烟草叶片，剪去叶边缘以及叶脉，然后用剪刀将叶片剪至合适大小，放入制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，期间不停的摇动菌液；接着取出叶片并用无菌吸水纸吸干，再将叶片正面朝下平铺于MS1固体培养基上25℃黑暗共培养2天；最后将暗培养后的叶片转移至含筛选因子Km（卡那抗生素）及Cef（头孢噻肟钠抗生素）的芽诱导培养基MS4固体上诱导外植体发芽，约15天继代一次；待有芽生成后，将芽从外植体上切下转入含Km及Cef的生根培养基MS上，进行根诱导生长。外植体在继代培养基中光照培养20-25天即可观察到叶片边缘长出愈伤或丛生再生芽，一个月左右可长至1-2cm，转入新的再生培养基中，待其长到3-4cm时，用解剖刀将再幼苗切下，并转入含筛选因子的生根培养基中继续培养。待根充分发育后，挑选生根的幼苗去叶片提取基因组及RNA进行检测。筛选过程中愈伤组织诱导、愈伤再生以及转基因烟草在Km抗性培养基中筛选如图8所示。

实施例 4 ：转基因烟草的检测

（ 1 ）转基因烟草基因组提取和 PCR 分析

采用CTAB法提取烟草根的基因组。称取烟草的根0.1 g左右置于1.5 mL EP中，加液氮冷冻后用特制研棒研磨至粉末状之后，加入0.9 mL预热到65℃的2×CTAB缓冲液（100 mMTris-HCl (pH 7.5)，20 mM EDTA，1.4 M NaCl，2% CTAB）继续研磨，65℃度水浴并摇动EP管，20 min后将其取出冷却。加入0.5 mL氯仿－异戊醇混合液（24：1）摇匀，12000rpm，室温离心10 min后将其上清转移至1.5 mL EP管。再次加入0.5 mL氯仿/异戊醇混合液（24：1）摇匀，12000rpm，室温离心10 min。取上清置于新的1.5mL EP管中，加入等体积异丙醇和1/10体积的醋酸钠（3 M， pH5.2），摇匀后置于-20℃，30min，12000rpm，4℃，离心30 min。弃上清，用75％乙醇清洗两次后（12000rpm，4℃，15min），真空干燥，用含RNase的TE缓冲液融解，37℃放置30min，使RNA降解，放置-20℃保存备用。

以基因组DNA为模板，用SGF14a基因的特异性引物，检测外源基因的插入情况。PCR反应体系使用PreMix（PCR混合物），在20μL反应体系中含有2 ×PreMix，10μL；10μmol·L^-1的上游引物和下游引物，各1μL；1 μL DNA模板和17μL ddH₂O。PCR扩增反应按94℃（3 min）；94℃（30 s），55℃（30 s），72℃（60s）（30个循环）；72℃（10 min）的程序进行。

从基因组PCR检测可以看出（图9A），以野生型烟草基因组（WT）为模板不能扩增出与正对照大小类似的（CK：以经检测正确的pK-35S-SGF14a质粒为模板）0.8Kb片段，而获得的不同柱系的转基因烟草（4、9、11、13、19和23）中都能够扩增出0.8Kb的片段，其中9号柱系扩增得到的片段相对比较弱。

（ 2 ）转基因烟草 RNA 提取和 RT-PCR 分析

转基因植物RT-PCR检测：采用TRIzoL Reagent（Invitrogen）提取烟草根总RNA。用M-MLV Reverse Transcriptase （Fermentas公司）反转录成25 μL cDNA体系。以反转录成的cDNA为模板，分析外源SGF14a基因在烟草中的转录表达情况，确定其表达是否受35S启动子驱动。RT-PCR反应体系和条件与基因组PCR反应体系相同。用烟草的18s rRNA作为内参，引物序列上游（5′-GGGCATTCGTATTTCATAGTCAG-3′）和下游（5′-AAGGGATACCTCC GCATAGC-3′）。反应条件为，按94℃（3 min）；94℃（30 s），55℃（30 s），72℃（30s）（30个循环）；72℃（10 min）的程序进行扩增18S rRNA。

RT-PCR分析结果如图9B所示，从结果中可以看出野生型烟草（WT）不能扩增出与正对照（CK）大小类似的0.8Kb片段，而获得的6株转基因柱系中除了9号柱系没有扩增出与目的片段大小类似的片段外，其他5个柱系（4、11、13、19和23）都能够扩增出0.8Kb片段。这说明，获得的这5株转基因植株中外源SGF14a基因能够发生正确转录。

（ 3 ）转基因烟草的蛋白水平 Western-blotting 检测

选取在DNA和RNA水平上表达差异不同的柱系11、19和23，命名为：S11、S19和S23。取0.1g无菌烟草的叶片，用蛋白抽提液提取叶片总蛋白，通过Bradford方法测定蛋白浓度后，取相同量蛋白（50μg）通过聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE:12%分离胶和4%浓缩胶）分离后，经半干式转膜仪将经SDS-PAGE分离后的蛋白转移到PVDF（醋酸纤维素膜）上后，经5%的脱脂奶粉常温封闭1h，然后用PBS（磷酸盐缓冲液）清洗PVDF膜3次，每次10min；接着加入10μL的14-3-3蛋白特异性抗体（兔抗：通过构建大豆14-3-3a（SGF14a）基因的原核表达载体，分离纯化得到SGF14a蛋白，最后用该纯化蛋白免疫新西兰家兔1个月后，获得抗SGF14a蛋白的抗血清）与PVDF一起常温孵育2-3h；用PBS清洗PVDF膜3次后，在加入连有辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗，常温孵育1h；最后在用ECL发光试剂盒显色。

从Western-blotting结果中可以看出（图9C）在3株转基因柱系（S11、S19和S23）中SGF14a的表达量明显比野生型烟草中的表达量高。在野生型烟草中也检测出SGF14a的蛋白信号，这是因为烟草中本身的14-3-3蛋白与来自大豆的14-3-3蛋白之间的同源性非常高，由于实验中我们采用的是来自大豆14-3-3a蛋白的抗血清，所以在进行Western-blotting检测时也能够在野生型烟草中出现信号。

通过DNA、RNA和蛋白水平的检测分析结果说明外源SGF14a基因已准确插入烟草基因组中，并且在35S的启动子下，外源SGF14a基因能够正确的转录和翻译出14-3-3a蛋白。

实施例 5 ：转基因烟草耐铝能力分析

（ 1 ）铝胁迫处理对野生型和转基因烟草根生理特性的影响

将在MS培养基中生长一致的野生型和转基因型烟草幼苗转移到Hoagland液体培养基中进行水培，水培2周后，在先用pH4.3的0.5mM CaCl₂预处理过夜后，记录铝处理前的根长度，然后置于 50µM的AlCl₃溶液（含有0.5mM CaCl₂，pH 4.3）分别处理24 h后，记录铝处理后的根长度，每个做6个重复。其中以未经铝处理下野生型和转基因烟草根的生长量为对照。相对根生长量（Relative Root Growth: RRG）：铝处理下的根生长量/未经铝处理下的根生长量100%。

收集经50µM的AlCl₃溶液处理后的根，用蛋白抽提缓冲液( 50 mM Tris-HCl pH 7.4，甘油 10%，β-巯基乙醇10 mM，PMSF 1mM，EDTA 2mM，Insoluble PVP10%) 提取可溶性总蛋白，采用 Bradford 法测定可溶性总蛋白质的浓度。取铝处理和未经铝处理的野生型烟草和转基因烟草根0.3g，加入10%的三氯乙酸（TCA）提取MDA，采用硫代巴比妥法测定MDA含量，在MDA提取液中加入0.6%TBA进行显示反应，混匀，置于沸水中沸煮15min，迅速冷却，离心，取上清液测定532nm和450nm处的OD值，通过公式MDA=6.45OD₅₃₂-0.56OD₄₅₀计算MDA的含量，单位以µmol.g^-1 FW表示。H₂O₂含量采用二甲酚橙法测定，单位以µmol.g^-1 FW表示。

实验结果显示：经过50µM的AlCl₃处理24h后，与未经铝胁迫处理相比，3株转基因烟草的根相对生长量（RRG）大约为野生型的1.3-1.4倍（图10A）。可溶性总蛋白的含量能够反映植物耐受胁迫的程度，含量越低，说明受到的胁迫程度越严重，而含量越高说明耐受胁迫能力越强。从可溶性总蛋白测定结果（图10B）可以看出在正常生长的条件下，3株转基因烟草根中可通行总蛋白的含量就比野生型高，这说明过量表达外源SGF14a基因后能够增加烟草中蛋白的的含量，而经铝胁迫后，野生型烟草和3株转基因烟草根中可溶性总蛋白的含量都有所下降，但在3株转基因烟草中可溶性总蛋白含量的下降趋势并不明显，并且含量也相对比野生型中高，这个结果说明在烟草中过量表达SGF14a基因后能够通过增加可溶性总蛋白的含量来增强其对铝的耐受性。MDA的含量能够反映经胁迫后质膜的氧化程度，H₂O₂的含量能够反映在胁迫后细胞内活性氧的积累量。从MDA含量的测定结果可以看出（图11A）在正常生长的条件下野生型烟草和3株转基因烟草根中MDA的含量没有明显差别，而铝胁迫后野生型烟草和转基因烟草根中MDA的含量都有所上升，而在野生型烟草中MDA含量上升趋势更为明显。从H₂O₂含量的测定结果中可以看出（图11B）无论是在正常生长条件下还是在铝胁迫下转基因烟草中的H₂O₂的含量都明显低于野生型烟草，只是在铝胁迫后野生型烟草和转基因烟草根中H₂O₂的积累量都有所上升，这说明在烟草中过量表达SGF14a基因后能够显著降低烟草细胞内H₂O₂的积累，减轻其受氧化胁迫的影响。对野生型和转基因型烟草在经铝胁迫后根相对生长量（RRG）、根中可溶性总蛋白含量、MDA和H2O2含量的测定结果可以看出在烟草中过量表达外源SGF14a基因后能够增强烟草中可溶性总蛋白的积累，通过降低MDA的产生以及H₂O₂的积累来减轻铝胁迫对质膜的氧化和ROS（活性氧）对细胞的毒害。

（ 2 ）酸性土壤对野生型和转基因烟草生长的影响

由于铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要限制因子，因此考察在本发明技术能否推广在酸性土壤中的应用具有实际利用价值。将筛选得到的生长一致的转基因烟草（S11、S19和S23）以及野生型烟草种植在酸性土壤中生长。在起初将烟草幼苗由无菌条件下转移到酸性土壤中时，应用薄膜盖住，避免无菌烟草幼苗被外界环境灼伤，当生长2周左右时使其适应外界生长环境，揭开薄膜，在让其在温室中生长30天和90天后，观察野生型烟草和转基因烟草在酸性土壤生长状况，拍照记录。考察酸性土壤对野生型烟草和转基因烟草（S11、S19和S23）生长的影响。结果如图12和13所示，从图中我们可以看出，在酸性土壤培养条件下，3株转基因烟草（S11、S19和S23）的生长状况都明显优于野生型烟草的生长。这些结果说明，在烟草过量表达外源大豆SGF14a基因后能够提高烟草的耐受酸性土壤能力，因此这就扩大了本发明的应用范围。本发明中所得到的实验数据结构能够为后期研究奠定理论基础，以及本发明中所构建的植物表达载体pK-35S-SGF14a能够通过相关的转染方法转入其他农作物中（如水稻、棉花和玉米等），在其他农作物过量表达SGF14a基因后也能够提高其对酸性土壤的耐受性。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种丹波黑大豆SGF14a基因的植物表达载体及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagcttatgt cggattcttc tcgggaggag 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcgagctat tcacctggtt gttgcttaga t 31

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggttgagga gttgacggtg ga 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcggatggga tgaggttgga c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccgtctcag attggtgtca tt 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atagcgagca agtcggtgga tt 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggcattcgt atttcatagt cag 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagggatacc tccgcatagc 20

Claims

1.丹波黑大豆SGF14a基因的植物表达载体pK-35S-SGF14a在增强作物对酸性土壤耐受性及提高作物耐铝能力中的应用。