CN101413011A - 叶绿体型谷氨酰胺合成酶基因的植物表达载体及其构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有拟南芥叶绿体型谷氨酰胺合成酶基因(GS2)且能提高植物氮素代谢能力的专用植物表达载体pK2－35S－Prbcs－*T－GS2。本发明是利用RT－PCR的方法从模式植物拟南芥中克隆出GS2基因，用光诱导型启动子Rubisco小亚基的启动子控制其在植物叶片中过量表达，并通过叶盘转化法将其转入野生型烟草中。实验结果表明在转基因烟草中GS2基因能够正常转录，在低氮营养条件下，转入GS2基因和的生长情况比对照植株(未转基因的野生型)要好，说明过量表达GS2基因能够很大程度的提高GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶)途径的效率，从而提高植物氮素同化的能力。本发明开创的专用载体能用于农作物的分子育种，提高其氮素利用率及对低氮营养胁迫的耐受力，在少施甚至不施氮肥的条件下获得较高的产量。
Description
技术领域
本发明属于植物工程领域，具体涉及一种叶绿体型谷氨酰胺合成酶基因GS2的植物表达载体pK2-35S-Prbcs-*T-GS2，其构建方法及其在转基因作物中的应用。
背景技术
氮是植物需求量最大的矿质营养元素，是植物正常生长发育所必需的营养元素之一，同时，又是农业生产和生态系统生长发育最受限制的营养元素之一(Jones等，2005，Soil Biology and Biochemistry，37：413—423)。为了获取尽可能多的、为生长发育所需的氮，植物形成了几种获取氮的途径：土壤氮的吸收、大气氮气的固定(豆科植物)、干湿沉降氮的吸收、捕食昆虫等，对于一般植物(非豆科植物)，主要依靠吸收土壤中的氮来维持生理活动。但是土壤中的氮难以满足作物生长发育的需求，因此在生产中，广泛采用施用氮肥的方法来满足作物的需要。但是施用的氮肥却由于氨挥发、硝态氮流失和反硝化脱氮等原因，使其利用率很低，当季氮的利用率全国平均不足30％，这不但直接导致效益降低，同时还造成土壤和水源污染，对人们赖以生存的环境造成危害。因此，施用化肥并不是满足作物生长需求的最佳办法，而应该考虑遗传学方法，提高植物本身对土壤环境逆境的适应性(Clark R B等，1991，Field Crop Res 27：219-240)。但是由于高氮利用率这一性状在大田条件上难以评价，因此采用传统育种方法来选育高氮利用率的作物品种大都很难成功，所以，通过基因工程方法，提高植物自身的氮素同化能力，成为一种最自然、最环保的方式。
植物吸收的氮主要有两种形式，无机氮(硝态氮和铵态氮)和有机氮(尿素、各种氨基酸等)。非豆科植物主要是通过吸收土壤中的硝酸盐并将其还原为氨这一过程来吸收氮元素的，植物的光呼吸过程中在线粒体释放出氨，释放出的氨经细胞质运输到叶绿体，在叶绿体中经GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶)再同化。GS是高等植物氮素循环过程中的关键酶(Miflin and Lea，1980，Ammoniaassimilation.In BJ Miflin，ed，The Biochemistry of Plants，Vol 5.AcademicPress，New York，pp 169-202)，有ATP存在的条件下，GS能够催化Glu结合无机态的NH3生成有机态的Gln(Ireland RJ等，1999，In BK Singh，ed，Plant AminoAcids，Biochemistry and Biotechnology.Marcel Dekker，New York，pp 49-109)。由于光呼吸时，随着氨的积累，叶片中谷氨酸和丝氨酸浓度随之增加，因此，这个反应成为光呼吸过程中氨再同化过程中的一个关键反应。
研究表明，高等植物中存在两种不同的同工酶：细胞质型的GS1和叶绿体型的GS2(Hirel B等，1980，Plant Physiol.66：619-623)。在叶绿体中表达的谷胺酰胺合成酶(GS2)在光呼吸氨的再同化作用中起到非常重要的作用(Wallsgrove etal.，1987，Plant Physiol 83：155-158；Migge and Becker，2000，Plant Sci153：107-112；Orea et al.，2002，Physiol Plant 115：352-361)，因为在光呼吸过程中释放的氨的水平可能超过初级氮同化量的十倍，不能合成GS2的突变体植物由于不能同化光呼吸释放的氨，在空气中生长时会因氨的过量积累而死亡，由此可见GS2对植物生长的重要性。
Kozaki和Takeba利用35s启动子在烟草中过量表达水稻的叶绿体型GS2，发现转基因植物中光呼吸作用增强，而光氧化作用得到抑制(Kozaki and Takeba，1996，Nature 384：557-560)。另外，Andrea等通过农杆菌介导法将含有大豆1，5—二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶小亚基基因(rbcS)启动子及烟草GS2cDNA的双元载体转入烟草后发现，得到的两个转基因烟草株系中GS2的转录水平分别是野生型的15和18倍，植物体鲜重分别是野生型的1.2和1.3倍，这说明GS2的过量表达明显促进了植物生长(Andrea等，2000，Planta，210：252-260)。
在水稻的肌动蛋白1(Actl)和玉米的ubiqitin(Ubi)启动子的控制下过量表达GS1和GS2基因可以显著提高植株对低氮胁迫的耐受性(孙辉等，2005，Journalof Plant Physiology and Molecular Biology 2005，31(5)：492-498)，另外还有研究发现，在植物过量表达GS2可以提高其对胁迫的耐受力，比如对过度辐射的耐受(Kozaki and Takeba，1996，Nature 384：557-560)，氧化胁迫和金属元素的耐受(Javier F.Palatnik等，1999，Plant Physiology，Vol.121，pp.471-478)，盐耐受(Hisashi Hoshi等，2000，Plant Molecular Biology，43：103-111)，以及干旱胁迫的耐受(Tommaso Martinelli等，2007，Journal of ExperimentalBotany，Vol.58，No.11，pp.3037-3046)。
拟南芥中存在的叶绿体型GS2可以再同化光呼吸过程产生的氨，如果能在植物的叶绿体中过量表达GS2，那么GS2就可以高效催化Glu与无机态的NH3结合生成有机态Gln的过程，以达到增强植物的氮素利用率以及对低氮营养胁迫耐受力的目的。目前尚未有含有拟南芥基因组中存在的叶绿体型GS2基因在番茄1，5—二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶小亚基基因(rbcS)和35S双启动子调控的植物表达载体的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种提高植物氮素利用能力的谷氨酰胺合成酶基因的植物表达载体，该载体是含有叶绿体型谷氨酰胺合成酶基因(即GS2基因)的植物表达载体；同时提供该载体的构建方法，以及该载体在提高植物氮素利用率中的应用。
本发明所提供的用于提高植物氮素利用能力的载体，是具有光诱导的启动子和叶绿体定位序列，以及叶绿体型谷胺酰胺合成酶基因cDNA的植物表达载体。
上述载体中，所述的叶绿体型谷胺酰胺合成酶基因GS2的cDNA来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。所述的来源于拟南芥的叶绿体型谷胺酰胺合成酶基因GS2的cDNA登录号为S69727。
上述的植物表达载体，在起始载体pH2GW7上连有Rubisco小亚基启动子PrbcS和叶绿体定位序列*T，其后紧接GS2基因。
上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pK2GW7(购自FlandersInteruniversity Institute for Biotechnology，VIB)。
本发明上述的重组植物表达载体pK2-35S-Prbcs-*T-GS2由下述方法构建而成：
(1)从GenBank中查找拟南芥叶绿体型GS2的全长基因cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
GS25：5’-caccgcATGcCTCAGATCTTAGCAGCTTC-3’
GS23：5’-gaattcTTAAACATTCAAAGAAAGCTTTT-3’
5’端引物GS25，末端加caccgc特征序列，并将ATG后的G改为c由此形成SphI酶切位点；3’端引物GS23，末端添加EcoRI位点；对拟南芥(Arabidopsisthaliana，ecotype，Columbia)的总RNA进行RT-PCR，得到GS2的编码区全长。
(2)回收并纯化GS2全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-GS2；
(3)构建入门载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2，用SphI以及EcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP(pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建方法见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)和pMD-GS2，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片段和GS2基因片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-*T-GS2。
(4)构建植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GS2，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-GS2亚克隆到植物表达载体pK2GW7(Gateway的目的载体，比利时VIB/Gent公司)中，获得GS2基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GS2。
本发明利用光诱导型启动子PrbcS构建GS2基因的植物表达载体，以便在转基因植物叶片的叶绿体中过量表达GS2基因，高效催化Glu与无机态的NH3结合生成有机态Gln的过程，增强植物的氮素利用率以及对低氮营养胁迫的耐受力。
附图说明：
图1拟南芥总RNA的提取1、2、3泳道均为所提拟南芥总RNA。
图2中间载体pMD-GS2的构建策略。
图3GS2基因的扩增和TA克隆。
(A)：以拟南芥RNA为底物反转录成cDNA进行RT-PCR。M：DL2000DNA marker；1-4：GS2的RT-PCR扩增产物。(B)：重组质粒pMD18-GS2的电泳检测。1：正对照(分子量为3.9kb的质粒DNA)；2：重组质粒pMD18-GS2。(C)：重组质粒pMD18-GS2的PCR检测。M：DL2000 DNA marker；1：正对照(以拟南芥RNA为底物反转录成的cDNA为模板，用GS25和GS23为引物扩增的PCR产物)；2：负对照(以水为模板的PCR产物)；3-6：以pMD18-GS2为模板用GS25和GS23引物扩增的PCR产物。
图4GS2基因的Gateway入门克隆载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2的构建策略
图5入门克隆载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2的检测
(A)：pENTR*-PRbcS-*T-GS2质粒的电泳检测。1：正对照(分子量为5.2kb的质粒DNA)；2-3：pENTR*-PRbcS-*T-GS2质粒DNA。(B)：pENTR*-PRbcS-*T-GS2的PCR检测。M：DNA markerIII；1：负对照(以pENTR*-PRbcS-*T-GFP为模板的PCR产物，引物为PrbcS primer 5和GS23)；2：正对照(以pMD18-GS2为模板的PCR产物，引物为PrbcS primer 5和GS23)；3-7：pENTR*-PrbcS-*T-GS2的PCR检测(引物为PrbcS primer 5和GS23)；(C)：pENTR*-PRbcS-*T-GS2以BamHI和EcoRI双酶切检测。1：DL2000 DNA marker；2-3：负对照(pK2GW7的酶切产物)；4-7：pENTR*-PRbcS-*T-GS2的酶切产物。
图6GS2植物表达载体pK2-35S-Prbcs-*T-GS2的构建策略
图7GS2植物表达载体pK2-35S-Prbcs-*T-GS2的检测
(A)：pK2-35S-PRbcS-*T-GS2质粒的电泳检测。1：质粒pK2GW7；2-5：质粒pK2-35S-PRbcS-*T-GS2；(B)pK2-35S-PRbcS-*T-GS2的PCR检测。M：Marker III；1：正对照(以pMD-GS2质粒为模板扩增的PCR产物，引物为PrbcS5和GS23)；2：负对照(以pK2GW7为模板扩增的PCR产物，引物为PrbcS5和GS23)；3-5：以pK2-35S-PRbcS-*T-GS2为模板扩增的PCR产物，引物为PrbcS5和GS23。
图8农杆菌转化子菌落的PCR检测
M：MarkerIII；1：正对照(以pMD-GS2为模板，使用PrbcS primer5’和GS2-3引物进行扩增的PCR产物)；2：正对照(以pK2GW7为模板，使用PrbcS primer5和GS23引物进行扩增的PCR产物)；3-7：pK2-35S-PrbcS-*T-GS2的农杆菌转化子菌落的PCR扩增产物(引物为PrbcS primer5和GS23)。
图9GS2在转基因烟草中的插入情况检测
(A)：烟草的基因组电泳图。(B)：转GS2基因烟草的PCR检测。1：Marker III；2：正对照(以pMD-GS2为模板，使用GS2基因内部部分序列的上下游引物进行扩增的PCR产物)；3：负对照(以野生型烟草基因组为模板，使用GS2基因内部分序列的上下游特异性引物进行扩增的PCR产物)；4-6：转GS2基因烟草基因组DNA的PCR产物(引物为GS2基因内部分序列的上下游特异性引物)。
图10转GS2基因烟草的RT-PCR检测
(A)：提取的烟草总RNA电泳图；(B)：1：Marker III；2：正对照(以pMD-GS2为模板，使用GS2基因内部分序列的上下游特异性引物进行扩增的PCR产物)。3：负对照(以野生型烟草cDNA为模板，使用GS2基因内部分序列的上下游特异性引物进行扩增的PCR产物)；4-11：转GS2基因烟草的RT-PCR产物(引物为GS2基因内部分序列的上下游特异性引物)。
图11转基因烟草株高测定
wt：野生型烟草植株；wt-GS2：转GS2基因的烟草植株。wt与wt-GS2型烟草株高对比。1-2：wt型烟草；3-5：wt-GS2型烟草。
图12转基因烟草叶绿素含量的测定
CA-Chl：叶绿素A的含量(mg/g叶片)；CB-Chl：叶绿素B的含量(mg/g叶片)；CT-Chl：总叶绿素的含量(mg/g叶片)。
图13转基因烟草蔗糖含量的测定
图14转基因烟草总蛋白含量的测定
具体实施方式：
试剂与仪器：
试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒、Gateway LR clonaseEnzyme Mix kit购自invitrogen公司。其余试剂均为国产分析纯。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：GS2基因cDNA扩增及TA克隆
首先从GenBank中查找拟南芥叶绿体型GS2的全长基因cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
GS25：5’-caccgcATGcCTCAGATCTTAGCAGCTTC-3’
GS23：5’-gaattcTTAAACATTCAAAGAAAGCTTTT-3’
5’端引物GS25，末端加caccgc特征序列，并将ATG后的G改为c由此形成SphI酶切位点；3’端引物GS23，末端添加EcoRI位点；
用TRIzoL Reagent(Invitrogen)从拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗中提取总RNA，取拟南芥嫩叶0.1g，加入1ml的TRIzoL RNA提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，加入0.2ml氯仿，振荡混匀，4℃，12000rpm/min离心15min。转移上清液，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min后12000rpm/min离心10min。弃上清，75％的乙醇1ml清洗沉淀，4℃，7500rpm/min离心5min，真空干燥沉淀，用20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA，-20℃。取1ulRNA用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果(图1)说明提取到的RNA质量符合要求。用拟南芥总RNA为模板，使用RevertAidTM-MuLV Reverse Transcriptase Kit(Fermentas)进行cDNA的合成。取植物总RNA 0.1-0.5μg，oligo(dT)50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将其收集于管底，置于65℃恒温干热加热器中加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl(10×reaction buffer 4μl，25mM MgCl2 4μl，0.1 M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl)，混匀，短暂离心将其收集于管底，25℃保温2min，加入1μlRevertAidTM-MuLV Reverse Transcriptase，混匀25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。
以cDNA为模板，用GS2基因上下游特异性引物GS25和GS23作RT-PCR，在RT-PCR反应混合液中加入3μl的cDNA作为模板，同时加入50ng的特异性引物GS25和GS123、2.5μl dNTP(2.5mM，)2.5μl的10×Ex taq反应Buffer和0.25μl的Extaq(5U/μl聚合酶(日本宝生物)，加双蒸水使反应终体积为25μl。在PCR仪上于94℃加热2分钟，然后按照94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、1分钟的程序进行30个循环的反应，最后在72℃延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得到GS2基因。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离GS2的PCR扩增产物(图3A)，回收并纯化GS2编码区全长片段(1.2kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的TA克隆试剂盒将其连接到pMD18-T(大连宝生物公司)载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态DH5α(购自天根生化科技公司)，采用碱裂解法提取质粒DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳(图3B)，选取大小和理论值相符的重组质粒pMD18-GS2做进一步的PCR检测，用GS2基因上下游特异性引物GS25和GS23作PCR，亚克隆成功的重组质粒均能扩增出1.2kb左右的GS2基因DNA片段(图3C)。根据阳性重组质粒pMD18-GS2载体两端的多克隆位点，用SphI和EcoRI双酶切重组质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD18-GS2含有1.2kb左右的DNA插入片段。
实施例2：Gateway入门克隆载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2的构建
入门克隆载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2的构建策略如图4所示，用SphI(Fermentas)和EcoRI(Fermentas)切开纯化的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pMD18-GS2，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后产生的载体片pENTR*-PrbcS-*T(4.0kb)及pMD18-GS2被切割产生的GS2基因的DNA片段(1.2kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*-PrbcS-*T和GS2基因的DNA片段产生入门载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的LB平板上，于37℃过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图5A)，以Prbcs primer 5和GS23作引物进行PCR扩增检测(图5B)，连接成功的质粒载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2可扩增出大小为1.4kb的*T-GS2片段。用BamHI(Fermentas)和EcoRI(Fermentas)双酶切重组质粒进行检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生两条带，分子量小的一条为1.0kb，另一条为4.2kb(图5C)。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落以液体LB进行培养，用试剂盒纯化质粒pENTR*-PRbcS-*T-GS2。
实施例3：GS2基因植物表达载体pK2-35S-Prbcs-*T-GS2的构建
GS2基因植物表达载体的构建策略如图6所示，通过Gateway技术的LR反应把pENTR*-PrbcS-*T-GS2亚克隆到植物表达载体pK2GW7(Gateway的目的载体，购自比利时VIB/Gent公司)中。具体的做法是：用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pK2GW7，在Gateway的LR反应体系中加pENTR*-PrbcS-*T-GS2和pK2GW7各150ng，1μl LR ClonaseII Enzyme Mix(Invitrogen)，混匀于25℃反应过夜，通过整合酶的作用把PrbcS-*T-GS2整合到pK2GW7中获得GS2的植物表达载体质粒pK2-35S-Prbcs-*T-GS2。用反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的LB平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒(图7A)，用位于PrbcS区域中的特异性引物PrbcS5和GS2的下游特异性引物GS23进行PCR检测，整合成功的质粒均能扩增出一条1.4kb左右的条带(图7B)，确认是重组成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落以液体LB进行培养，用试剂盒纯化质粒。
实施例4：用GS2基因的植物表达载体转化农杆菌
制备农杆菌感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-35S-Prbcs-*T-GS2转入农杆菌(C58C1(pPMP90))中，在加有壮观霉素的LB平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混合液落至杯底，将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的点击杯和200欧姆，2.5Kv/0.2cm的参数进行电击，点击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5mlSOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃，200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先挑取农杆菌单菌落于20μlddH2O中，98℃处理15分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用位于PrbcS区域中的特异性引物PrbcS primer5和GS2的下游特异性引物GS23作PCR检测，转化成功的菌落能扩增出1.4kb的条带(图8)，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
实施例5：用含有GS2基因植物表达载体的农杆菌转化烟草
挑取携带有pK2-35S-Prbcs-*T-GS2质粒的农杆菌单菌落接种于50ml的LB液体培养基(含Spe，100μg/ml)，180rpm，28℃培养2h，待菌液OD600至1.0左右，3500rpm，离心10min，沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮菌体，3000rpm离心10min，沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后用加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD600值为0.5。制备烟草(Nicotiana tabacumcv.Xanth)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌苗的叶片切成小片叶盘，将其用以上制备好的农杆菌菌液浸染15～20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1(MS+NAA0.21μg/ml+BAP0.02μg/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽诱导培养基MS4(MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含卡那霉素(50ug/ml)的MS培养基上进行根的诱导。
实施例6：GS2基因在转基因植物中的插入情况和转录水平的检测
为了确认通过卡那霉素筛选的转基因烟草株系确实含有导入的目的基因的DNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因植株作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取0.1g植物叶片置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉状。加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液(Tris-HCl pH7.5 100mM，EDTA 20mM，NaCl 1.4M，CTAB 2％)，65℃水浴20min，中间每隔2min摇匀一次，取出冷却至室温，再加入500μl氯仿：异戊醇(24：1)混合液，旋转摇匀，4℃，7500rpm，离心10min，转移上清至一新的离心管。重复上述步骤。加入1/10体积3M pH5.2 NaOAc和等体积的异丙醇，摇匀后4℃，12000rpm，离心20min。弃上清，用75％乙醇清洗两次后干燥，用含有RNase的1×TE缓冲液溶解并降解RNA，取2μl以1％琼脂糖凝胶电泳检测(图9A)。以植物基因组DNA为模板，用GS2基因内部部分序列的上下游特异性引物作PCR检测，成功转入GS2基因的植株均能扩增出600bp左右的DNA条带(图9B)。经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。
为了考察在含有GS2基因的转基因烟草株系中GS2基因的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测GS2基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoL Reagent(Invitrogen)提取RNA(图10A)后，使用RevertAidTM-MuLV Reverse TranscriptaseKit(Fermentas)进行cDNA的合成，去植物总RNA约0.1ug-0.5ug，oligo(dT)50ng，10mM dNTP mix 1ul，用DEPC处理水补足至10ul，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9ul(5×reactionbuffer4ul，25mM MgCl2 4ul，0.1M DTT 2ul，RNA酶抑制剂1ul)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用GS2基因上下游特异性引物作PCR，成功转入GS2的植株均能扩增出600bp的条带(图10B)，证明GS2基因可以在转基因植物中成功地转录。经RT-PCR确认的转基因植株用于进一步的生理生化分析。
实施例7：转基因植物在低氮营养条件下的生长情况
为了确认转GS2基因的植株确实具有生长优势，将转GS2基因的植株以及对照野生型植株小苗移栽入只有珍珠岩的外界培养条件下，施用低氮营养液，在持续光照条件下培养一段时间后观察植物表型的变化。转GS2基因植物都比野生型植株长势好(图11)，说明转入的GS2基因能够在植物中发挥预期的作用，增强了植物的氮素同化能力，转基因植物吸收氮素的能力增强。
实施例8：转基因植物叶片中叶绿素的含量检测
为了确认转入基因是否对植株叶片中叶绿素含量造成影响，选取转基因植物小苗和未转基因植物的野生型小苗叶片取叶片0.1g，加入少量CaCO3和1ml 95％乙醇，充分研磨，收集样品，4℃，12000rpm离心15min后，收集上清，取100ul上清液加入900ul 95％乙醇，充分混合后，于分光光度计下分别测645nm和663nm的吸光度(95％乙醇作对照)。根据以下公式计算出叶绿素a(CA)、叶绿素b(CB)以及总叶绿素(CT)的浓度以及含量(CA-Chl，CB-Chl和CT-Chl，图12)：CA＝12.72 D663-2.59D645；CB＝22.88 D645-4.68 D663；CT＝20.29 D645+8.02 D663；Chl(mg/g叶)＝C(mg/L)×提取液总量(L)×稀释倍数/材料鲜重(g)。转基因植物的叶绿素含量与野生型对照相比明显增高(图12)，说明转入的GS2基因不但不会破坏植物叶片中的叶绿素，还增加了叶绿素的含量，为提高植物的光合作用提供有利条件，同时，植物的生长优势得以表现。
实施例9：转基因植物中蔗糖含量的测定
为了确认转入基因是否对植株叶片中的蔗糖含量造成影响，故选取野生型植物和转基因植物的叶片1g，液氮充分研磨，加入4ml磷酸钾缓冲液(KH2PO4 0.27g，K2HPO4 1.83g，PH7.6)充分研磨，4℃，12000rpm离心20min，吸取上清保存至另一新的EP管中，-20℃保存备用。
吸取0.1ml的样品溶液与0.2ml Solutionl(10ml柠檬酸buffer(pH4.6)溶解720Uβ-果糖苷酶，37℃预热)混合，采用对照仅为0.2ml Solutionl，混匀后，20-25℃下孵育15min或者是在37℃条件下孵育5min，随后加入1ml Solution2(45ml三乙醇胺buffer(pH7.6)溶解110mg NADP，260mg ATP和7.2g硫酸镁)和1.7ml蒸馏水(对照蒸馏水量为1.8ml)，混匀，大约3min后读取溶液的吸光值(A1，340nm)。添加0.020ml的Suspension 3(5.8U己糖激酶；2.9U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)起始反应，充分混匀，等待充分反应(大约10-15min)，读取溶液的吸光值(A2，340nm)。如果反映在15min后没有终止，那么每间隔2min读取一个吸光值直到超过两分钟后吸光值不再上升。测定空白和样品的吸光度(A1、A2)差。从样品的吸光度差中减去空白的吸光度差ΔAtotal D-葡萄糖(来自于蔗糖样品)＝(A2-A1)sample-(A2-A1)blank。
取0.100ml得样品溶液，加入1ml Solution2和1.9ml蒸馏水(对照为1mlSolution2和2.0ml蒸馏水)，混匀，大约3min后读取溶液的吸光值(A1，340nm)。添加0.020ml的Suspension3，起始反应，充分混匀，等待充分反应(大约10-15min)，读取溶液的吸光值(A2，340nm)。如果反映在15min后没有终止，那么每间隔2min读取一个吸光值直到超过两分钟后吸光值不再上升。测定空白和样品的吸光度(A1’、A2’)差。从样品的吸光度差中减去空白的吸光度差ΔAD-葡萄糖(来自于D-葡萄糖样品)＝(A2’-A1’)sample-(A2’-A1’)blank。
ΔAtotalD-葡萄糖(来自于蔗糖样品)和ΔAD-葡萄糖(来自于D-葡萄糖样品)的差值就是
ΔA蔗糖。根据公式(单位：g蔗糖/L样品溶液)：
其中ε＝6.3(1×mmol-1×cm-1)，可以得到样品溶液中的蔗糖浓度，后通过计算得到每克植物叶片中的蔗糖含量。结果(图13)证明转入GS2基因的植物叶片中，蔗糖含量明显增高。
实施例10：转基因植物中总蛋白含量的测定
为了确认转入基因对植物体重总蛋白含量造成的影响，选取转基因和未转基因植物的幼嫩叶片0.2g左右的植物叶片，加入1ml蛋白抽提液(100mMTris-HCl(pH7.5)；10％(V/V)甘油；10mM巯基乙醇；1mM PMSF；5％(W/V)PVP)，充分研磨；收集抽提液，4℃，12000rpm离心25min后，将上清液转移到新的EP管中，800ul H20+200ul Bradford+1ul样品，595nm测定光吸收值。结果(图14)证明转基因植物叶片中的总蛋白含量也有不同水平的增加，转入的GS2基因对于提高植物体内的总蛋白含量影响较大，这说明转基因植物中代谢产物含量明显增高，与野生型植物相比具有更高的氮素利用效率。
Claims (9)
1、一种重组植物表达载体，含有拟南芥叶绿体型谷胺酰胺合成酶基因即GS2基因。
2、权利要求1的重组载体，用于构建所述植物表达载体的起始载体为pK2GW7。
3、权利要求1的重组载体，其中GS2基因cDNA的上游添加有Rubi sco小亚基的光诱导型启动子PrbcS和叶绿体定位序列*T。
4、权利要求1的重组载体，为pK2-35S-PrbcS-*T-GS2，在起始载体pK2GW7上连有启动子PrbcS和叶绿体定位序列*T，其后紧接AMDH基因。
5、权利要求1的重组载体，由下述方法构建而成：
(1)从GenBank中查找拟南芥叶绿体型GS2的全长基因cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
GS25：5’-caccgcATGcCTCAGATCTTAGCAGCTTC-3’
GS23：5’-gaattcTTAAACATTCAAAGAAAGCTTTT-3’
5’端引物GS25，末端加caccgc特征序列，并将ATG后的G改为C由此形成SphI酶切位点；3’端引物GS23，末端添加EcoRI位点；以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到GS2基因的全长cDNA；
(2)回收并纯化GS2全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-GS2；
(3)构建入门载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2，用SphI以及EcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP(pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)和pMD-GS2，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片段和GS2基因片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-*T-GS2。
(4)构建植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GS2，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-GS2亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得GS2基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GS2。
6 权利要求1谷胺酰胺合成酶基因GS2的cDNA来源于拟南芥，来源于拟南芥的叶绿体型谷胺酰胺合成酶基因GS2的cDNA GenBank登录号为S69727。
7、权利要求1所述的重组植物表达载体的构建方法，其特征在于：
(1)从GenBank中查找拟南芥叶绿体型GS2的全长基因cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
GS25：5’-caccgcATGcCTCAGATCTTAGCAGCTTC-3’
GS23：5’-gaattcTTAAACATTCAAAGAAAGCTTTT-3’
5’端引物GS25，末端加caccgc特征序列，并将ATG后的G改为C由此形成SphI酶切位点；3’端引物GS23，末端添加EcoRI位点；以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到GS2基因的全长cDNA；
(2)回收并纯化GS2的全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-GS2；
(3)构建入门载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2，用SphI以及EcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP(pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)和pMD-GS2，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片段和GS2基因片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-*T-GS2；
(4)构建植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GS2，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-GS2亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得GS2基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GS2。
8、权利要求1-5之一的重组植物载体在制备农杆菌转基因植株中的应用。
9、权利要求1-5之一的重组植物载体在制备农杆菌转基因烟草中的应用。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102363790A (zh) * | 2011-10-11 | 2012-02-29 | 昆明理工大学 | 拟南芥热激因子基因AtHsfA1d 的植物表达载体及其应用 |
| CN102363790B (zh) * | 2011-10-11 | 2013-10-16 | 昆明理工大学 | 拟南芥热激因子基因AtHsfA1d 的植物表达载体及其应用 |
| CN102952821A (zh) * | 2012-11-06 | 2013-03-06 | 昆明理工大学 | 紫花苜蓿苹果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表达载体及其应用 |
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