CN102177241A - 有效利用氮的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离自水稻(Oryza sativa)(Rasi变体)的谷氨酸脱羧酶(GAD)基因序列以及其对应的编码多肽，它们产生提高植物氮利用效率的性状。本发明还涉及这些核酸分子和多肽在制备氮利用效率提高的转基因植物、植物细胞、植物材料或植物种子中的用途。

Description

有效利用氮的转基因植物
发明领域
分离白水稻(Oryza saliva)的谷氨酸脱羧酶(GAD)基因序列及其在植物中增强氮摄取和氮利用效率中的用途。
背景技术
作物植物已有近10000年的历史，并且大多数时间没有强力施肥。然而，近50年间，世界范围内作物的氮肥使用量增加了超过20倍。这些肥料的使用效率不佳，因为仅有约50％在植物收获中被回收。作物植物并未在高氮营养条件下进化，许多机制不一定适合在这种营养条件下的生长。因此问题在于，根据已有知识和实验，能否提高作物植物的氮利用效率？有两种可能方式，一是充分利用基因库中氮利用特征的可用变化，二是尝试引入可能增加这种变化的新基因。
增加植物的氮利用效率产生多种有益影响。例如，有效利用氮的植物在贫氮土壤中能够生长，并且比常规植物产量更好。有效利用氮的植物减少对于施用氮肥的需求。施肥占了作物生产费用的一大部分，因此减少肥料的使用将直接导致节约费用。
减少施肥还将减少氮肥广泛应用造成的环境损害。这些使用氮肥对环境造成的不利影响表现在增加水体富营养化、酸雨、土壤酸化和温室效应。
现有技术
基础植物生物化学和生理学提供了更好了解作物生产系统与N供应之间关系的方法。二氧化碳(CO2)和硝酸盐(NO3 -)同化的相互作用及动态对于作物生产至关重要。NO3 -的充足供应，同化为氨基酸(这需要光合成碳化合物)和及其对于蛋白质合成的可用性是代谢所必需。NO3 -充足供应刺激叶片生长和光合成，前者通过细胞生长和分裂实现，后者则由光反应组分的较大成分以及CO2同化和相关步骤实现。然而，代谢和产量之间的联系少有量化。必须更好的使用生化特征和刺激模型并将其组合以改进N肥应用、N使用效率和产量。使用遗传学全部潜能，以及充足的N，每单位N更多的C同化，将增加生物量。
遗传学潜能可定义为当没有环境限制时，植物形成生物量或产量的全部能力；育种家和农学家经常提到产量潜能，但在考虑如何增加作物的潜在生长时，总产量更加切合。产量潜能与遗传信息相关联，它说明了蛋白质的特征，因此确定了结构、生长和发育以及系统能够生长的大小。生长周期中的最大尺寸成为遗传学潜能。
关键点是当N供应低于达到遗传学潜能所需时，必须提高N摄取以得到更高的生物量。或者，可增加每单位蓄积N的C同化，以从更小的N蓄积中得到更高的生物量。理论上通过增加每单位N蓄积的C同化，可增加产生生物量的遗传学潜能，其代价是增加C/N比值。前提是光能量充足。如果同化了更多的N，但不改变与C同化的平衡，理论上可增加生物量并保持当前的C/N比。
植物学家长久以来意识到需要开发出更加有效吸收和利用营养的作物。两种方法用于增加作物植物的营养利用效率(NUE)。第一种方法包括传统育种，以及标记物辅助选择以鉴定涉及的基因。第二种方法使用经设计提高NUE的特定方面的新基因构建物。
硝酸盐还原酶
氮同化通路中两个连续的酶催化步骤将硝酸盐还原为氨。首先硝酸盐还原酶(NR)将硝酸盐转化为亚硝酸盐，然后亚硝酸盐从胞质转运到叶绿体，在叶绿体中被亚硝酸盐还原酶(NiR)还原为氨。植物中NR基因的表达受多种内源和环境因素影响，并且在转录、翻译和翻译后水平高度受到调控。总之，在分析的组织中，NR过表达似乎降低亚硝酸盐的水平。在植物中过表达NR或NiR基因能增加mRNA水平，并常常影响N摄取。然而，无论可用的氮源如何，N摄取的增加似乎都不提高植物的产量或生长。这被认为部分是因为NR调节和整体通路调节的复杂性。
谷胺酰胺合成酶和谷氨酸合酶
在高等植物中发现了氨同化中的重要酶对谷胺酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)之后[Miflin和Lea，1976]，多个实验室聚焦于理解该通路的调控机理[Harrison等，2000]。此外，已产生GS/GOGAT水平改变的突变体或转基因植物以确定这些蛋白质在植物发育中的效应，并研究GS多基因家族不同成员的表达。多个研究表明转基因植物中GS活性增强与生物量或产量的直接相关性。与GS相比，很少有报道描述过表达GOGAT的转基因植物的产量。过表达苜蓿GOGAT基因的转基因植物显示GOGAT蛋白含量增加，但没有表现任何与此性状相关的表型。
GABA旁路
γ-氨基丁酸(GABA)是含四个碳原子的非蛋白质氨基酸，在细菌、植物和脊椎动物中具有保守性。GABA是游离氨基酸池的重要组分。GABA在γ碳而非α碳上具有氨基，以未结合的形式存在。它具有高水溶性。就结构而言，它是柔性分子，可在溶液中采取若干构象，包括与脯氨酸1类似的环状结构。GABA在生理pH值(pK值为4.03和10.56)下为两性离子(同时携带正电荷和负电荷)。
这于半个多世纪前在植物中发现，但揭示GABA在大脑中以高水平产生并在神经传递中发挥主要作用时，对GABA的兴趣转移到了动物上。此后，在脊椎动物中对GABA的研究就主要集中在其作为信号传导分子特别是在神经传递中的作用上。在植物和动物中，GABA主要经包含三种酶的短途径进行代谢，所述短途径称为GABA旁路，因为它绕过了三羧酸(TCA)循环中两个步骤。所述途径包含胞质酶谷氨酸脱羧酶(GAD)与线粒体酶GABA氨基转移酶(GABA-T)和琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)。该保守代谢途径的调节在植物中似乎具有特定特征。
经GABA将谷氨酸转化为琥珀酸的途径称为GABA旁路。该旁路的第一步是通过谷氨酸脱羧酶(GAD，EC 4.1.1.15)对谷氨酸进行直接和不可逆的α-脱羧化。已在多个植物种类和组织的粗提物中对体外GAD活性进行了表征(Brown和Shelp，1989)。GAD对L-谷氨酸具有特异性，具有吡多醛5’-磷酸依赖性，受已知与巯基反应的试剂的抑制作用，具有钙调蛋白结合结构域，显示约-5.8的明显酸性的最适宜pH。已鉴定了来自矮牵牛花(Baum等，1993)、番茄(Gallego等，1995)、烟草(Yu和Oh，1998)和拟南芥(Zik等，1998)的GAD基因。参与GABA旁路的第二个酶是GABA氨基转移酶(GABA-T；EC 2.6.1.19)，其将丙酮酸或a-酮戊二酸作为氨基受体，催化GABA可逆地转化为琥珀酸半醛。在粗提物中，相对于α-酮戊二酸，体外GABA-T活性似乎更愿选择丙酮酸。然而，烟草叶的粗提物中存在不同的丙酮酸依赖性和α-酮戊二酸依赖性活性，它们可通过离子交换色谱进行相互分离(Van Cauwenberghe和Shelp)。两种活性显示的最适宜pH很宽，为8-10。来自烟草的纯化约1000倍的丙酮酸特异性线粒体GABA-T的米氏常数(Km)就GABA为1.2mM，就丙酮酸为0.24mM(Van Cauwenberghe和Shelp)。
GABA旁路的最后一步由琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH；EC 1.2.1.16)催化，不可逆地将琥珀酸半醛氧化为琥珀酸。所述部分纯化的植物酶具有约为-9的碱性最适宜pH，与NAD的活性最多是与NADP的活性的20倍(Shelp等，1995)。
实际上，对植物中GABA旁路的兴趣主要来自关于GABA主要在对生物性胁迫和非生物性胁迫作出应答时快速产生的实验观察。从此将GABA旁路与各种生理应答联系起来，包括胞质pH调节、TCA循环碳流入、氮代谢、阻止昆虫、针对氧化胁迫的保护作用、渗透调节和信号传导。
本发明中，我们将植物中自从发现GABA的这些发现和其它发现以及最近的证据(主要来自拟南芥功能基因组方法)联系在一起，表明GABA在植物中作为信号分子的可能作用，以及在植物应激反应和碳:氮(C:N)平衡中的其它作用。
发明内容
本发明涉及在植物(包括单子叶植物和双子叶植物)中使用谷氨酸脱羧酶基因通过土壤杆菌介导的转化增加氮利用效率的方法。此外，本发明涉及一种使植物表达氮利用效率相关基因的植物修饰方法，以及采用该方法产生的植物。
本文首次报道利用谷氨酸脱羧酶基因增加植物氮摄取和氮利用效率的方法。并且使用了硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶基因。迄今为止没有人尝试过使用参与GABA旁路的基因，尤其是谷氨酸脱羧酶来增加植物的氮利用效率。许多研究聚焦于植物碳氮平衡和氮同化中谷氨酸脱氢酶的工作，并对谷氨酸脱氢酶的重要性进行综述(Miflin和Habash 2002)。然而之前的尝试集中在水稻OsGAD1和OsGAD2的两种谷氨酸脱羧酶基因，通过土壤杆菌将两者同时引入水稻愈伤组织以建立转基因细胞系，产生表型异常，如矮小、叶片黄化和不育的水稻植株(Akama和Takaiwa，2007)。
因此在低氮条件下生长时需要对氮进行有效利用。
序列表
SEQ ID 1显示水稻谷氨酸脱羧酶基因的核酸序列。起始密码子和终止密码子用斜体表示。
SEQ ID 2显示水稻谷氨酸脱羧酶基因的氨基酸序列。星号表示终止密码子。
附图简要说明
图1显示携带谷氨酸脱羧酶编码DNA序列的植物转化载体。
图2显示通过土壤杆菌介导的基因转移用GAD基因转化烟草叶的不同阶段。
图3显示用以下不同的引物组合对转化和再生的具有GAD基因的烟草T0幼苗进行的PCR证实，：-a)HygR基因的正向和反向引物；b)基因特异性正向和反向引物和c)基因正向引物和Nos反向引物。
图4显示对具有GAD基因的烟草T0幼苗中引入基因(GAD)表达的证实，其中采用以cDNA为模板的RT-PCR用GAD基因特异性正向和反向引物分析GAD基因。
图5显示与对照植物相比，T0代不同的转基因植株叶片中的总氮含量百分数。
图6显示了温室中生长的三种GAD转基因植物(D1A，E2和H1)的T1幼苗的植物氮状态，幼苗生长于不含N源的1/10th MS培养液中，以不同浓度的硝酸铵(2、4和8mM)独立提供N，并与野生型的叶绿素含量作比较。用明诺塔(Minolta)SPAD读数仪读值，并以SPAD单位表示。数值来自5株幼苗(生物样品)，每株幼苗进行3次读值(实验样品)。
图7显示了温室中生长的三种GAD转基因植物(D1A、E2和H1)的T1幼苗的植物氮状态，幼苗生长于不含N源的1/10th MS培养液中，以不同浓度的硝酸钾(2、4和8mM)独立提供N，并与野生型的叶绿素含量作比较。用明诺塔SPAD读数仪读值，并以SPAD单位表示。数值来自5株幼苗(生物样品)，每株幼苗进行3次读值(实验样品)。
图8显示来自潮霉素抗性阳性的GAD转基因(H1)T1幼苗和野生型幼苗植株高度的比较，这些幼苗生长于含有不同水平氮肥(100％推荐剂量(RD)、50％RD和10％RD)，而磷肥和钾肥水平恒定的温室罐中。
图9显示来自潮霉素抗性阳性的GAD转基因(H1)T1幼苗和野生型幼苗节间距的比较，这些幼苗生长于含有不同水平氮肥(100％推荐剂量(RD)、50％RD和10％RD)，而磷肥和钾肥水平恒定的温室罐中。
图10显示来自潮霉素抗性阳性的GAD转基因(H1)T1幼苗和野生型幼苗分枝数目的比较，这些幼苗生长于含有不同水平氮肥(100％推荐剂量(RD)、50％RD和10％RD)，而磷肥和钾肥水平恒定的温室罐中。
图11显示来自潮霉素抗性阳性的GAD转基因(H1)T1幼苗和野生型幼苗叶片数目的比较，这些幼苗生长于含有不同水平氮肥(100％推荐剂量(RD)、50％RD和10％RD)，而磷肥和钾肥水平恒定的温室罐中。
图12显示来自潮霉素抗性阳性的GAD转基因(H1)T1幼苗和野生型幼苗茎周长的比较，这些幼苗生长于含有不同水平氮肥(100％推荐剂量(RD)、50％RD和10％RD)，而磷肥和钾肥水平恒定的温室罐中。
图13显示来自潮霉素抗性阳性的GAD转基因(H1)T1幼苗和野生型幼苗叶面积的比较，这些幼苗生长于含有不同水平氮肥(100％推荐剂量(RD)、50％RD和10％RD)，而磷肥和钾肥水平恒定的温室罐中。
图14显示来自潮霉素抗性阳性的GAD转基因(H1)T1幼苗和野生型幼苗以干重计算的总生物量(叶、茎和根)的比较，这些幼苗生长于含有不同水平氮肥(100％推荐剂量(RD)、50％RD和10％RD)，而磷肥和钾肥水平恒定的温室罐中。
图15显示来自潮霉素抗性阳性的GAD转基因(H1)T1幼苗和野生型幼苗以单位干重计算的叶片总N百分数的比较，这些幼苗生长于含有不同水平氮肥(100％推荐剂量(RD)、50％RD和10％RD)，而磷肥和钾肥水平恒定的温室罐中。
图16显示来自潮霉素抗性阳性的GAD转基因(H1)T1幼苗和野生型幼苗以单位干重计算的氮利用效率(NUE)的比较(根据生物量/生物量中的N含量进行计算)，这些幼苗生长于含有不同水平氮肥(100％推荐剂量(RD)、50％RD和10％RD)，而磷肥和钾肥水平恒定的温室罐中。
图17显示来自潮霉素抗性阳性的GAD转基因(H1)T1幼苗和野生型幼苗总谷物产量的比较，这些幼苗生长于含有不同水平氮肥(100％推荐剂量(RD)、50％RD和10％RD)，而磷肥和钾肥水平恒定的温室罐中。
发明详述
提供以下对本发明的详细说明来协助本领域技术人员实施本发明。即使如此，不应将对本发明的详细说明理解为对本发明构成不适当的限制，因为本领域普通技术人员可作出本文所讨论的实施方式中的修改和变动，而不背离本发明的精神或范围。
本发明涉及一种具有谷氨酸脱羧酶特征的纯化分离的DNA序列。
如本发明所述，所述纯化分离的DNA序列通常由谷氨酸脱羧酶核苷酸序列或其片段组成。
本发明还包括上述序列或片段的互补序列，其可通过任何手段产生。
本发明包括上述序列的变体，即通过保守核苷酸取代而不同于参考序列的核苷酸序列，其中一个或多个核苷酸被其它具有相同特征的核苷酸取代。
如本发明所述，上述核苷酸序列可位于表达载体中包含启动子和感兴趣基因的序列的5’和3’端。
本发明包括上述序列在增加由其产生的植物的氮利用效率中的用途。“氮利用效率”指在合适条件下将DNA序列引入宿主植物后，与没有转化所述DNA序列的对照植物相比，所述序列能够提高植物中的氮水平。
以下定义用来帮助理解本发明。
“染色体”是在细胞内发现的DNA和蛋白质的有序结构。
“染色质”是在真核细胞的细胞核内发现的DNA和蛋白质的复合体，其组成染色体。
“DNA”或脱氧核糖核酸包含遗传信息。其由不同的核苷酸构成。
“基因”是编码成熟蛋白质的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列，“基因”不应包含不翻译侧翼序列如RNA转录起始信号、多聚腺苷酸化添加位点、启动子或增强子。
“启动子”是控制基因表达的核酸序列。
“增强子”指不依赖基因位置或取向而启动基因转录的基因序列。
本文定义的“载体”指可向其中插入外源DNA片段的DNA分子。载体通常衍生自质粒，其作用类似“分子运载体”，携带DNA片段进入宿主细胞。
“质粒”是在细菌和一些其它生物体中发现的小环状DNA。质粒可独立于宿主细胞染色体进行复制。
“转录”指从DNA模板合成RNA。
“翻译”指从信使RNA合成多肽。
“取向”指DNA序列中核苷酸的次序。
“基因扩增”指对某个基因进行重复复制而不引起其它基因拷贝数量成比例增多。
“转化”指通过任何转移手段向植物细胞引入外源遗传材料(DNA)。不同的转化方法包括基因枪轰击(生物射弹)、电穿孔、土壤杆菌介导的转化等。
“转化植物”指将外源DNA引入其中的植物。该DNA将成为宿主染色体的一部分。
“稳定的基因表达”指制备永久性表达感兴趣基因的稳定的转化植物取决于质粒稳定整合到宿主染色体中。
尽管本发明如上述定义广泛，但本发明的熟练技术人员应当了解本发明并不限于此，还包括下文中包含实施例的实施方式。
实施例1
从水稻分离和纯化GAD基因核苷酸序列，构建植物转化载体。
将GAD基因克隆到35S花椰菜花叶病毒启动子下游，用NOS终止子终止，全部为操作性连接。
植物材料
将水稻(Rasi变种)用于制备核酸。种子萌发后，将其置于培养室的水栽溶液中培育。用150mM NaCl对幼苗处理7-16小时。
RNA抽提和EST文库构建
从整株幼苗中提取RNA。构建受盐胁迫的Rasi cDNA的EST文库。从EST文库中鉴定显示与谷氨酸脱羧酶具有相同性的EST。
鉴定和分离GABA旁路中的基因
在高等植物中GABA在各种应激开始之后发生累积，所述应激如酸化作用、缺氧、低温、热激、机械性刺激、病原体侵袭、干旱和盐胁迫。已从水稻的盐胁迫文库中分离出GABA旁路中的谷氨酸脱羧酶基因。
克隆谷氨酸脱羧酶基因
已将谷氨酸脱羧酶基因克隆到克隆载体和植物转化载体中(生物射弹，二等分)，位于组成型启动子之下。使用如下BglII和EcoRI限制性酶切位点(有下划线的核苷酸序列)标记引物对从籼稻(RASI变种)的cDNA中扩增编码谷氨酸脱羧酶基因的完整编码序列的cDNA。
正向：5′-GCGGATCCATGGTGCTCTCCAAGGCCGTCTC-3′
反向：5′GCGAATTCCTAGCAGACGCCGTTGGTCCTCTTG-3′
采用以下PCR条件：94℃1分钟；94℃30秒；75℃3分钟(循环5次)；94℃30秒；68℃3分钟(循环30次)，68℃最后延伸7分钟。
扩增的cDNA由1479个核苷酸碱基对组成，编码成熟的谷氨酸脱羧酶。
将扩增的片段克隆到pGEMT轻便(pGEMT easy)载体中。用限制酶在BamHI和EcoRI位点消化所述基因，并连接到生物射弹载体pV1中。在BglII和EcoRI限制位点切割该生物射弹载体(BglII和BamHI酶产生相容性末端)以证实存在所述基因。还通过测序证实所述基因。所得载体(pV1-GAD)具有受35S花椰菜花叶病毒(35S CaNfV)启动子驱动和NOS终止子终止的GAD基因(1.479kb)，其中用氨苄青霉素抗性基因作为选择性标记。
在HindIII和BamHI位点限制性消化来自pV1-GD的由35S CaMV启动子驱动和NOS终止子终止的GAD基因的基因盒。将该基因盒连接到在HindIII和BamHI位点限制性消化的pCAMBIA 1390pNG15中。所得载体(pAPTV1390-GAD)具有由35S花椰菜花叶病毒(35S CaMV)启动子驱动和NOS终止子终止的GAD基因(1.479kb)，其中nptII(卡那霉素抗性)基因和hph(潮霉素抗性)基因作为选择性标记(图1)。
实施例2
产生GAD基因改变并且氮含量更高的植物
植物转化
以通过土壤杆菌将谷氨酸脱羧酶基因转化到烟草(模式植物)，以证明所鉴定基因的构思。
土壤杆菌介导的用携带GAD基因的二元载体(binary vector)转化烟草叶外植体的详细步骤如下：
1.将土壤杆菌的阳性菌落接种到含50mg/L卡那霉素(Kan)和10mg/L利福霉素(Rif)的LB肉汤中作为由Kan和Rif抗性基因组成的载体主链，同时也作为一次进行的双重选择。
2.然后将所述肉汤置于摇床上在28℃下培育。
3.将过夜生长的菌落在早上接种到含50mg/L Kan和10mg/L Rif的50mLLB肉汤中，在28℃培育3-4小时，检测600nm的OD，并使其继续生长到OD为0.6-1。
4.一旦所述肉汤达到所需OD，将其在5000rpm离心5分钟。
5.弃去上清液，将细胞沉淀溶解在穆拉什格斯固格(Murashige和Skooge，MS)液体培养基(Agro-MS肉汤)中。
6.将烟草叶切为小方片作为外植体而不携带中脉，小心地在所有四个面上对叶进行破坏而不损伤接种物的中心部分。
7.将这些叶样品置于MS普通培养基上，在培育箱中放置两天。接种两天后，用现处于Agro-MS肉汤中的土壤杆菌细胞转化这些叶样品。
8.将所述叶样品在该Agro-MS肉汤中放置30分钟，然后将其在共培养基上放置两天，所述共培养基由MS+1mg/L盐酸6-苄氨基嘌呤(BAP)+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+250mg/L头孢噻肟组成(图2a)。
9.在共培育后，在MS+1mg/L BAP+0.2mg/L NAA+40mg Hyg+250mg/L头孢噻肟组成的第一选择培养基中放置外植体15天，当愈伤组织出芽时将这些外植体再次置于第一选择培养基上进行亚培养，以便使愈伤组织足够成熟(图2b)。
10.一旦发现所述愈伤组织达到成熟，将这些愈伤组织接种到第二选择培养基上，所述第二选择培养基由MS+1mg/L BAP+0.2mg/L NAA+50mgHyg+250mg/L头孢噻肟组成。随着潮霉素浓度增大，从第一选择逃离的逃离例受到抑制，仅有转化的愈伤组织开始在该培养基上存活。
11.随后10天中在该第二培养基上进行一次亚培养。
12.这时候，愈伤组织开始长出小植株。取出来自第二选择的小植株置于生根培养基上，所述生根培养基由1/2MS+0.2mg/L吲哚-3-丁酸(IBA)组成。此处的小植株在12-15天时开始伸出根部。由于也开在该阶段鉴定逃离例，一旦形成成熟的根，将所述植物在含20mg/L潮霉素的生根培养基上进行亚培养(图2c)。
13.使该阶段的植物习服，其中将瓶盖在开放状态保持两天，使植物适应其生长空间环境。之后将植物从琼脂培养基上移出并在1/4MS液体培养基上放置两天。再将这些植物转移到蛭石上，每天浇水，持续一周。
14.根据植株的条件，将合适的植株转移到温室。
15.在将植株送到温室之前的习服期间收集植株的老叶。
16.从各叶样品提取DNA，用基因特异性引物和选择性标记如潮霉素引物进行PCR。再将PCR证实的阳性植物转移到温室。
用引入的GAD基因证实植物
提取GAD烟草转基因品系的基因组DNA
收集转基因GAD烟草植株的叶样品，提取基因组DNA。
基因组DNA提取的步骤：
·从各植株收集约1gm叶。
·用液氮在研钵和臼中研磨所述样品。
·向所述样品中加入1ml提取缓冲液(0.2M Tris Cl pH-8.0；2M NaCl；0.05M EDTA；2％CTAB)，在13000rpm离心10分钟。
·收集上清液。加入RNA酶[1ml加入3μl(1mg/mL)]，在37℃培养半小时。
·然后加入相等体积的氯仿-异戊醇，在13000rpm离心10分钟。
·将上清液收集在新试管中，加入相等体积的冷异丙醇，在13000rpm离心10分钟。
·用70％的醇洗涤沉淀，将沉淀干燥并溶解在30μl温热的高压灭菌水中。
·将1μl DNA加样到凝胶上进行检测。
用不同引物组合进行PCR证实转基因植物：
1.用潮霉素正向(Hyg F)和潮霉素反向(Hyg R)引物进行PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   1μL
  Hyg F   10pM   0.5μL
  Hyg R   10pM   0.5μL
  dNTP混合物   10mM   0.5μL
  Taq DNA聚合酶   3U/μL   0.3μL
  Taq缓冲液A   10X   3μL
  MilliQ水   24.2μL
  总体积   30μL
PCR条件：(艾本德机器(Eppendorf Machine))
  步骤   温度   时间  循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   50℃   50秒
  4   72℃   1分钟  转到第2步，30次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
图3a中显示在0.8％琼脂糖凝胶上观察到的扩增产物。
2.用基因特异性引物GAD正向(GD F)和GAD反向(GD R)引物进行PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   2μL
  GD F   10pM   0.5μL
  GD R   10pM   0.5μL
  dNTP’s   10mM   0.5μL
  Taq DNA聚合酶   3U/μL   0.3μL
  Taq缓冲液   10X   2μL
  MilliQ水   14.2μL
  总体积   20μL
PCR条件：(艾本德机器)
  步骤   温度   时间   循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   69℃   50秒
  4   72℃   1.30分钟   转到第2步，35次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
在0.8％琼脂糖凝胶上观察到扩增产物(图3b)。
3.用GD F和Nos MR进行PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   2μL
  GD F   10pM   0.5μL
  Nos MR   10pM   0.5μL
  dNTP混合物   10mM   0.5μL
  Taq DNA聚合酶   3U/μL   0.3μL
  Taq缓冲液   10X   2μL
  MilliQ水   14.2μL
  总体积   20μL
PCR条件：(艾本德机器)
  步骤   温度   时间   循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   67℃   50秒
  4   72℃   2分钟   转到第2步，35次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
图3c中显示在0.8％琼脂糖凝胶上观察到的扩增产物。
不同PCR反应中采用的引物序列如下所示：
Hyg F：5′-CTGAACTCACCGCGACGTCT-3′
Hyg R：5′-CCACTATCGGCGAGTACTTC-3′
GD F：5′-GCGGATCCATGGTGCTCTCCAAGGCCGTCTC-3′
GD R：5′-GCGAATTCCTAGCAGACGCCGTTGGTCCTCTTG-3′
NOS MR：5′-GATAATCATCGCAAGACCGGCAAC-3′
证实引入的GAD基因在转基因植物中表达
对引入的GAD基因表达的证实包括以下步骤，例如提取RNA、合成cDNA和逆转录PCR。
分离转基因GAD烟草植株和对照植株(野生型)的RNA。
提取RNA包括的详细步骤：
1.在预冷的臼中取出500mg叶组织，用液氮研磨成细粉末。
2.用预冷的刮刀将粉末转移到预冷的艾本德管中。
3.在匀浆样品中加入1mI Trizol溶液(英杰公司)。充分混合并在室温(RT)下培育5分钟。
4.向其加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，在室温下培育5分钟。
5.将样品13000rpm 4℃离心15分钟。
6.将上部水相收集在新管中(约60％，即600μl)。
7.向收集的上部相中加入500μl冷异丙醇，在室温下培育10分钟。
8.将样品13000rpm 4℃离心15分钟。
9.倾析出上清液，用500μl 70％的醇(DEPC H2O)洗涤沉淀，在10000rpm、4℃离心5分钟。
10.弃去上清，在室温下将沉淀干燥15分钟。
11.在55℃的水浴或干浴中将团块溶解于20μl DEPC处理的H2O中。
12.将2μl样品上样于凝胶。将样品存储于-80℃备用。
合成cDNA包括的详细步骤：
合成转基因GAD烟草植株和野生型植株的cDNA：
1.按照下列顺序加入组分：
总RNA：4μl(1μg)
寡dT：0.5μl
0.1％DEPC/无核酸酶水：6.5μl
总计：11μl
2.在PCR仪上将所述组分加热至70℃5分钟，冰上迅速冷却。
3.同时将以下组分加入另一个管中制备下一个混合物：
5x反应缓冲液：4μl
dNTP混合物(10mM)：2μl
RNA酶抑制剂(20U/ul)：0.5μl
0.1％DEPC/无核酸酶水：2μl
总计：8.5μl
4.将该8.5ul混合物加入PCR管的内容物中，迅速冷却并轻拍混合。
5.将PCR管中的组分用PCR机在37℃培育5分钟。
6.向所述管中加入0.5μl M-MuLV RT酶，继续进行PCR机中设定的程序(25℃10分钟，37℃60分钟，70℃10分钟)。
7.将cDNA存储于-20℃，供进一步用于PCR。
通过RT-PCR分析引入的GAD基因在转基因烟草植株中的表达
通过用基因特异性引物进行PCR来分析来自GAD转基因烟草和野生型植株的cDNA，以检测引入的GAD在烟草中的表达：
用基因特异性引物对cDNA进行PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   2μL
  GD F   10pM   0.5μL
  GD R   10pM   0.5μL
  dNTP混合物   10mM   0.5μL
  Taq DNA聚合酶   3U/μL   0.3μL
  Taq缓冲液   10X   3μL
  MilliQ水   24.2μL
  总体积   30μL
PCR条件：(艾本德机器)
  步骤   温度   时间  循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   69℃   50秒
  4   72℃   1.30分钟  转到第2步，30次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
图4中显示在0.8％琼脂糖凝胶上观察到的扩增产物。
估算T0植株中的氮
分析T0GAD烟草植株和野生型植株叶片中的N含量。收集来自成熟植株的叶片并在热空气炉中干燥。将干叶片粉碎，用凯氏(Kjeldahl)法计算N2含量。凯氏法是定氮的标准方法。该方法包含三个基本步骤：1)在硫酸中添加催化剂消化样品，这将使氮转化为氨；2)将氨蒸馏入捕获溶液中；和3)用标准溶液滴定以便定量测定氨。
步骤
消化
1.将约0.200g研磨的叶片样品称入消化烧瓶中，记录重量(W)精确到0.1mg。
2.加入3.5g消化混合物，然后加入10ml硫酸。将烧瓶放置于设定为42℃的预热的BIOKJEL加热器上。
3.将BIOSCRUB单元的管子连接到消化烧瓶以收集加热时产生的烟。
4.加热管子/烧瓶中的混合物约60-90分钟，直到消化混合物变成淡绿色。
5.消化后，将消化管直立冷却。
蒸馏和滴定
1.将消化管转移到蒸馏装置BIODIST中，将锥形瓶放置在在接收末端，并开始蒸馏。
2.用0.1N HCL滴定锥形瓶中的内容物，直到永久变成淡粉色。
计算
氮(N)百分数的计算：
% N = [ S - B ] × 0.1 × 14 × 100 W × 1000
其中
S＝样品滴定值；B＝空白滴定值；14＝氮当量；0.1＝HCL的当量浓度；W＝以克表示的样品重量。
与对照相比，所有10个转基因植株显示更高水平的氮含量(图5)。最高的N含量出现于H2(3.4％)，比野生型多41％。N含量升高最少的是J2(2.5％)，比野生型多4.1％。因此，当生长于营养成分相似的土壤中时，含GAD基因的T0转基因植株与野生型(不含GAD转基因)相比N含量增加。
研究下一代(T1)中的氮摄取以确定该特征是否能稳定数代。在幼苗期以及植物的整个生命周期中进行实验以研究效应。
实施例3
GAD转基因植物的T1代显示更好N状态的证据
为了研究生长培养基中不同氮水平对转基因植物的效应，使用两种不同的氮源-硝酸铵和硝酸钾，浓度为2、4和8mM，而不改变培养基中的其它营养物(P和K)或微营养物的水平。
植物材料
分析在不同氮源条件下(硝酸铵和硝酸钾)，T1转基因烟草GAD植物的氮状态。
将T1种子播种于含潮霉素的平皿上，取阳性植物培养于温室中进行进一步研究，例如在不同氮水平下的N2摄取。
不同硝酸铵水平下的植物N状态
挑选潮霉素培养基中存活的三株GAD转基因植株(D1A、E2和H1)的T1幼苗，并将其移植到温室的小杯中，其中含有无氮源的1/10th MS培养基。以不同浓度的硝酸铵(2、4和8mM)单独提供氮源，并与野生型植物比较叶绿素含量。用明诺塔SPAD读数仪读值，并以SPAD单位表示(图6)。由于生长培养基中的氮水平降低，野生型植物显示出植物N含量的降低(这表明对其生长而言存在N缺乏)。然而，在低可用氮的条件下，转基因植物的植物N状态只有轻微降低，且氮含量高于野生型植物，表明其生长状态优于野生型。
不同硝酸钾水平下的植物N状态
挑选潮霉素培养基中存活的三株GAD转基因植株(D1A、E2和H1)的T1幼苗，并将其移植到温室的小杯中，其中含有无氮源的1/10th MS培养基。以不同浓度的硝酸钾(2、4和8mM)提供氮源，并与野生型植物比较叶绿素含量。用明诺塔SPAD读数仪读值，并以SPAD单位表示(图7)。在所有不同浓度的硝酸钾中，转基因植物的植物N含量均高于野生型植物，表明其氮摄取优于野生型。
在不同氮源供应的条件下，以及N缺乏的条件下，含GAD基因的转基因植物显示出更好的植物N状态。
实施例4
在N缺乏土壤条件下，GAD转基因植物显示更好的氮利用效率(NUE)和更高的收获指数的证据
为了研究土壤中不同氮水平对转基因植物的生长和发育的影响，使用不同水平的氮-100％推荐剂量，50％推荐剂量和10％推荐剂量，而不改变土壤中的其它营养物(P和K)或微营养物的水平。通过施用尿素或硝酸铵钙(CAN)或磷酸二铵(DAP)，外源性供给不同水平的N。
用野生型和转基因烟草进行实验。挑选潮霉素培养基上存活的三株转基因植物(H1)的T1幼苗，移植到温室中的小杯子中。在温室中含野外土壤和厩肥(FYM)混合物的罐子中培养幼苗。用普通水灌溉植物，外加使用肥料。施肥计划见表1。对两种基因型(野生型和H1转基因烟草)进行三种处理(一式三份)以便进行实验。如表2所示。如下计算所需肥料剂量，表3、4和5显示了使用不同肥料的实际剂量。
对GAD转基因烟草施肥
FCV烟草推荐N剂量20Kg N/Ha
Bidi烟草推荐N剂量180Kg N/Ha
-对于肥沃土壤，推荐@60Kg N，80Kg P2O5，80-100Kg K2O和15KgMgO/ha
-对于沙土，推荐70Kg N，60Kg P2O5，100-120Kg K2O和15Kg MgO/ha。
表1：烟草植物直接施肥计划
Figure BPA00001330355200191
烟草栽培推荐的种植密度是10,000-12,000株幼苗/Ha，因此1株幼苗/m2(1Ha＝10,000m2)，因此每株植物的推荐N剂量是每株幼苗6克N(60,000克N/Ha(10,000m2)，即每10,000株幼苗)。因此如下计算不同肥料的使用剂量。
尿素(46％N含量)：
尿素肥(46％N)，即46Kg N/100Kg尿素(4.6克N/10克尿素)
每株植物13克尿素(按照推荐剂量每株植物供应6克N)
25％第一剂量(3.25克尿素)(10DAT)
50％第二剂量(6.5克尿素)(2-3周DAT)
25％第三剂量(3.25克尿素)(40DAT)
CAN(25％N含量)：
60,000克N/Ha(10,000m2)，即每10,000株幼苗
每株幼苗6克N(推荐剂量)
CAN肥(25％N)，即.25Kg N/100Kg CAN(2.5克N/10克CAN)
每株植物25克CAN(按照推荐剂量每株植物供应6克N)
25％第一剂量(6.25克CAN)(10DAT)
50％第二剂量(12.5克CAN)(2-3周DAT)
25％第三剂量(6.25克CAN)(40DAT)
SSP(18％P 2 O 5 含量)：
80,000克P2O5/Ha(10,000m2)，即每10,000株幼苗
每株幼苗8克P2O5(推荐剂量)
SSP肥(18％P2O5)，即18Kg P2O5/100Kg SSP(1.8克N/10克SSP)
每株植物44.5克SSP(根据推荐剂量每株植物供应8克P2O5)。
100％第一剂量(44.5克SSP)(10DAT)
DAP：(18％N和46％P含量)
80,000克P2O5/Ha(10,000m2)，即每10,000株幼苗
每株幼苗8克P2O5(推荐剂量)
DAP肥(46％P2O5)，即46Kg P2O5/100Kg SSP(4.6克N/10克DAP)
每株植物17.4克DAPP(根据推荐剂量每株植物供应8克P2O5)。
100％第一剂量(17.4克DAP)(10DAT)
这也提供3.1克N，由于推荐剂量是6克/幼苗，即需要通过尿素补充3克。
尿素肥(46％N)即46Kg N/100Kg尿素(4.6克N/10克尿素)
每株植物6.5克尿素(供应推荐剂量的一半即每株植物3克N)
第一剂量(若给予DAP，则没有尿素)(10DAT)
25％第二剂量(3.25克尿素)(2-3周DAT)
25％第三剂量(3.25克尿素)(40DAT)
MOP(60％K2O含量)：
100,000克K2O/Ha(10,000m2)即每10,000株幼苗
每株幼苗10克K2O(推荐剂量)
MOP肥(60％K2O)即60Kg K2O/100Kg MOP(6克K2O/10克MOP)
每株植物16克MOP(按照推荐剂量每株植物供应10克K2O)
50％第一剂量(8克MOP)(10DAT)
50％第二剂量(8克MOP)(2-3周DAT)
表2：氮摄取研究实验设计。对两种基因型进行三种处理(一式三份)以便比较。
Figure BPA00001330355200211
表3：如果使用尿素、SSP和MOP作为肥料，则使用如下剂量
  100％RD   50％RD   10％RD
  克/植株   克/植株   克/植株
  尿素   13   6.5   1.3
  SSP(P2O5)   44.5   22.25   4.45
  MOP(K2O)   16   8   1.6
表4：如果使用尿素、DAP和MOP作为肥料，则使用如下剂量
  100％RD   50％RD   10％RD
  克/植株   克/植株   克/植株
  尿素   6.5   3.25   1.3
  DAP(N:P2O5)   17.4   8.7   1.74
  MOP(K2O)   16   8   1.6
表5：如果使用CAN、SSP和MOP作为肥料，则使用如下剂量
  100％RD   50％RD   10％RD
  克/植株   g/植株   g/植株
  CAN   25   12.5   2.5
  SSP(P2O5)   44.5   22.25   4.45
  MOP(K2O)   16   8   1.6
表型评价：
观察表型特征，记录参数如植株高度、节间距、分枝数目、叶片数目、叶片面积、茎粗(周长)、总生物量、谷物产量等。
植株高度
记录转基因植物和野生型植物(没有引入谷氨酸脱羧酶基因的植物)的植株高度。从土壤水平开始刀植物顶端包括花序和分枝的尺度用于测量植物高度。转基因植物在低N水平土壤(10％RD)中表现植株高度增加(图8)。
节间距
测量转基因植物和野生型植物(没有转入谷氨酸脱羧酶基因的植物)的茎上两节间距离。测量第5、6片叶和第6、7片叶的节间距。从顶端开始叶片计数，将完全伸展的叶片记为第1片叶。用线测量距离，然后测量线的长度，用cm表示。转基因植物在低N水平土壤(10％RD)中表现节间距增加(图9)。
分枝数目
在土壤N充足条件(100％RD)和土壤N缺乏(50％RD)条件下，转基因植物表现为分枝数目增加(图10)。
叶片数目
在土壤N充足条件下(100％RD)，转基因植物的叶片数目是野生型的2倍。当土壤N缺乏时(50％和10％RD)，观察到转基因植物比野生型植物的叶片数目多(图11)。
茎周长(圆周或茎粗)
测量转基因植物和野生型植物(没有转入谷氨酸脱羧酶基因的植物)的茎粗。测量土壤水平上5-6cm处的茎周长。在合适高度用线环绕茎，然后测量线的长度，并用cm表示。在100％RD条件下，转基因植物显示较粗的茎，而在50％和10％RD条件下茎粗没有显著性差异(图12)。
叶片面积
测量转基因植物和野生型植物(没有转入谷氨酸脱羧酶基因的植物)的叶片大小。从叶片的结到叶尖垂直测量叶片，将其作为叶片长度。在最宽的点水平测量叶片的宽度，将其作为叶片宽度。用长度×宽度计算叶片面积，用cm2单位表示。在土壤N充足条件下(100％RD)，转基因和野生型的叶片面积没有差异，然而在土壤N缺乏条件下(50％和10％RD)，与野生型相比，转基因植物显示叶片面积的增加(图13)。
植株生物量
测量转基因植物和野生型植物(没有转入谷氨酸脱羧酶基因的植物)所产生的生物量。用整个植株的干重评价植株生物量。在不同N的处理条件下，评价植株生物量。在N充足(100％RD)和N缺乏(50％)条件下，转基因植物的总生物量显著高于野生型(P≤0.005)(图14)。
净氮摄取
评价植物的总氮摄取(％叶片干重)。在正常条件和不同环境应激条件下比较对照和转基因植物的净摄取。
T1植物的氮评价
分析T1GAD烟草植物和野生型植物叶片中的N含量。收集来自成熟植物的叶片并在热空气炉中干燥。如上所述，将干叶片粉碎，用凯氏法计算N2含量。在N充足条件下(100％RD)，转基因植物的植物总N含量显著高于野生型植物(P≤0.005)，然而在N缺乏条件下(50％和10％RD)，野生型和转基因植物的植物N含量没有显著性差异(图15)。
氮利用效率(NUE)
如下所述计算氮利用效率(NUE)
氮利用效率表示为组织中每单位N产生的干物质的量。营养效率可通过下列公式从叶片组织的N含量计算得到：
Figure BPA00001330355200231
或
NUE＝总生物量(干重毫克数)/生物量中N含量(毫克)
或者
NUE＝产生的生物量/施于土壤的氮
光合成的N利用率定义为单位叶片面积或叶片质量中每单位N固定的CO2。
在N缺乏条件下(50％RD)，转基因植物的氮利用效率(取决于总生物量和生物量中的N含量)高于野生型植物(图16)。
谷物产量
在N充足(100％RD和N缺乏(10％RD)条件下，转基因植物的总谷物产量高于野生型植物(图17)。这表明生物量的增加也引起了植物产量的增加，并没有因为生物量增加导致减产。
在N缺乏条件下，在不同的植物农艺和营养状态方面，GAD转基因植物比野生型植物表现更好，这表明在N缺乏条件下GAD基因赋予转基因植物的优良性能。这可能是因为与野生型植物相比，转基因植物对于施用N的摄取或同化增加。
Figure IPA00001330354800021
Figure IPA00001330354800031
Figure IPA00001330354800051

Claims (16)

1.一种产生氮含量升高或氮利用效率增高的转化植物的方法，包括：将包含与编码功能性谷氨酸脱羧酶(GAD)的核苷酸序列操作性连接的启动子的DNA构建物掺入植物基因组中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码功能性谷氨酸脱羧酶的核苷酸序列包含SEQ ID No.1所列核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子选自操作性连接于SEQ ID No.1所列核苷酸序列的组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和细胞类型特异性启动子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述启动子选自诱导型启动子，对于选自下组的信号产生响应：营养匮乏、机械性刺激、洪水、盐、干旱、热、冷、创伤、缺氧、病原体、紫外线B、开花信号、结果信号、细胞特化及其组合。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述启动子选自组织特异性启动子，在选自下组的植物组织中表达：叶、茎、根、花、花瓣、花药、胚珠等，及其组合。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述启动子选自细胞类型特异性启动子，在选自下组的植物细胞中表达：薄壁组织、叶肉、木质部、韧皮部、保卫细胞、气孔细胞等，及其组合。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶包含SEQID NO：2所列的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SEQ ID No.2所列的氨基酸序列有效催化谷氨酸到γ-氨基丁酸(GABA)的反应。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化植物表达SEQ ID No.1所列的谷氨酸脱羧酶(GAD)基因，其表达水平高于在相同条件下同种非转化植物表达GAD基因的水平。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶植物选自单子叶植物、双子叶植物、谷类、饲料作物、豆科植物、豆类植物、蔬菜、水果、油料种子、纤维作物、花卉、园艺植物、药用植物和芳香植物。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将DNA构建物掺入植物基因组的方法包括：
(i)用所述DNA构建物转化来自宿主植物的细胞、组织或器官；
(ii)选择包含所述DNA构建物的转化细胞、细胞愈伤组织、体细胞胚或种子；
(iii)从所选的转化细胞、细胞愈伤组织、体细胞胚或种子再生完整植株；和
(iv)选择表达所述多核苷酸的再生完整植株。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，采用颗粒枪、生物射弹或土壤杆菌介导所述DNA构建物转化所述来自宿主植物的细胞组织或器官。
13.一种根据权利要求1-12中任一项所述方法获得的转化植物及其后代。
14.如权利要求13所述的转化植物，其特征在于，所述SEQ ID No.1所列的DNA构建物掺入杂合或纯合状态的植物中。
15.如权利要求1-14中任一项所述的转化植物，其特征在于，所述植物在选自下组的环境应激下氮含量或者氮利用效率显著增加：营养匮乏、机械性刺激、洪水、盐、干旱、热、冷、创伤、缺氧、病原体及其组合。
16.一种用包含与编码GAD酶的多核苷酸操作性连接的组成型启动子的载体转化的植物或其后代；其中所述植物表达所述多核苷酸；并且与非转化植物相比，所述植物的氮含量、氮利用效率、生长特征、产量、繁殖功能或其它形态学或农艺学特征显著改善。
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