CN102176817A - 环境适应性转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对盐胁迫具有耐受性的新型转基因植物。用编码分离自水稻的谷氨酸脱羧酶的重组核酸转化所述植物。本发明还涉及一种生产所述耐盐性转基因植物的方法。

Description

环境适应性转基因植物
发明领域
本发明涉及耐盐性转基因植物。具体而言，本发明涉及表达谷氨酸脱羧酶的转基因植物，以及制备这样的转基因植物的方法。
发明背景
盐度胁迫对全世界的农业产量具有不利影响，无论对于自给性还是经济性收获，生产均会受到影响。植物对盐度的应答由大量过程组成，它们必须协调发挥作用以同时减轻细胞高渗透压(hyperosmolarity)和离子不平衡。此外，作物必须能够在盐环境中实现令人满意的生物量生产。在本发明中，提供了通过植物遗传工程制备耐受环境应激的能力增强并具有所需形态学和/或农艺学特征等的植物的方法和材料。更具体而言，本发明涉及用增强植物合成谷氨酸脱羧酶的能力的基因对植物进行遗传转化，所述谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸转化为GABA从而增强植物耐受应激的能力，或赋予其它所需特征。
作为本发明的背景知识，已显示GAD酶(谷氨酸脱羧酶)催化谷氨酸形成γ-氨基丁酸(GABA)，已克隆了若干植物的GAD基因。接触到应激后植物细胞中迅速累积GABA已被文献充分证明。GAD促进谷氨酸发生脱羧反应产生GABA被认为是接触应激之后植物中累积GABA的主要来源。然而，也可通过其它代谢途径如与多胺分解代谢相关的代谢途径或通过可逆的GABA氨基转移酶反应引起的GABA旁路的一部分来生物合成GABA。用大豆子叶或芦笋细胞悬浮培养物进行的实验表明，通过谷氨酸代谢形成GABA是正常现象，GABA的生物合成并不是研究条件下对应激的应答。
然而，还显示GABA在受到机械性刺激、温度变化如冷激或热激条件时在植物中迅速累积。鉴于该背景知识，可看出已为研究植物中的GABA合成和GAD酶活性付出了诸多努力；然而，尚未表明GABA赋予植物盐度耐受性中的直接作用。本发明是本领域中的重大进步。
现有技术
耐盐性的机制
生物学家关于盐生植物(适应盐性生存环境的植物)对高浓度NaCl的耐受性不大于非盐生植物(也称为嫌盐植物或适应甜水的植物)的早期发现是所有耐盐性机制的基础(Munns 2002)。例如，从盐生植物滨藜(Atriplex spongeosa)或海滨碱蓬(Suaeda maritima)提取的酶在体外对NaCl的敏感性与从豆或豌豆提取的酶相同(Greenway和Osmond 1972；Flowers等1977)。甚至是可在高于海水10倍以上盐度下生长的粉红色盐湖藻类巴夫杜氏盐藻(Dunaliella parva)的酶对NaCl的敏感性也与最敏感的嫌盐植物相同(Munns等综述1983)。Na+通常在高于100mM的浓度开始抑制大多数酶。对Cl-产生毒性的浓度的说明更少，但可能在与Na+相同的范围内。甚至K+也可在100-200mM的浓度下抑制酶(Greenway和Osmond 1972)。
因此，耐盐性的机制有两个主要类型：最大程度减少盐进入植物的机制和最大程度减少胞质中盐浓度的机制。盐生植物同时具有两种机制，它们充分地“排除”盐，但有效地将不可避免进入的盐隔离在液泡中。这使得它们能在盐性土壤中长时间生长。一些嫌盐植物也充分排除盐，但不能如盐生植物那样将吸收的其余盐有效隔离。大多数嫌盐植物排除盐的能力差，盐在蒸腾叶中聚集到毒性水平。
高盐度条件对大多数植物造成高渗损伤，升高的Na+浓度通过干扰至关重要的Na+敏感酶和通过影响关键的离子运输来破坏细胞过程。认为在盐性条件下通过多个Na+可渗透通道/转运蛋白进行Na+摄入，在胞质Na+浓度达到某阈值水平时触发离子毒性(Volkamar等，1999；Hasegawa等，2000)为通过遗传方法增强植物的耐盐性，应采取合理的策略方法以赋予植物针对上述应激的抗性。大多数植物合成并累积渗压剂，即所谓的相容性溶质，作为对干旱或高盐度条件的应答。这些相容性溶质在生理pH下呈中性，分子量低，水溶性高，即使在胞质溶胶中高浓度累积时对生物体也不具有毒性。引入生物合成渗压剂基因的一些转基因植物显示改善的高渗耐受性，上述渗压剂如甘露醇(Tarczynski等，1993)、4-O-甲基内消旋肌醇(ononitol)(Sheveleva等，1997)、海藻糖(Holmstriim等，1996；Romero等，1997)、脯氨酸(Kishor等，1995)、甜菜碱(Lilius等，1996；Hyashi等，1997；Sakamoto等，1998)或果聚糖(Pilon-Smits等，1995)、嗜盐菌盐单胞菌(Halomonas elongata)中的相容性溶质艾可托英(ectoine)(1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸)、肌醇(Das-Chatterjee等，2006)。作为另一个策略，据报道，编码调节应激耐受性基因表达的转录因子的拟南芥(Arabidopsis thaliana)DREBIA基因的过表达会改善转基因植物对干旱、盐度和严寒的耐受性(Kasuga等，1999)通常难以对Na+毒性耐受性进行分子水平的改善。关于通过过表达拟南芥中的液泡Na+/H+反向转运蛋白基因(NHXI)或液泡质子泵基因(AVPZ)来改善耐受性的报道很少(Apse等，1999)。我们现在对通过引入编码谷氨酸脱羧酶的水稻(Oryza sativa)GAD基因增强植物细胞的盐胁迫耐受性进行说明。
GABA旁路
γ-氨基丁酸(GABA)是含四个碳原子的非蛋白质氨基酸，在细菌、植物和脊椎动物中具有保守性。GABA是游离氨基酸池的重要组分。GABA在γ碳而非α碳上具有氨基，以未结合的形式存在。它具有高水溶性：就结构而言，它是柔性分子，可在溶液中采取若干构象，包括与脯氨酸1类似的环状结构。GABA在生理pH值(pK值为4.03和10.56)下为两性离子(同时携带正电荷和负电荷)。
这于半个多世纪前在植物中发现，但揭示GABA在大脑中以高水平产生并在神经传递中发挥主要作用时，对GABA的兴趣转移到了动物上。此后，在脊椎动物中对GABA的研究就主要集中在其作为信号传导分子特别是在神经传递中的作用上。在植物和动物中，GABA主要经包含三种酶的短途径进行代谢，所述短途径称为GABA旁路，因为它绕过了三羧酸(TCA)循环中两个步骤。所述途径包含胞质酶谷氨酸脱羧酶(GAD)与线粒体酶GABA氨基转移酶(GABA-T)和琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)。该保守代谢途径的调节在植物中似乎具有特定特征。
经GABA将谷氨酸转化为琥珀酸的途径称为GABA旁路。该旁路的第一步是通过谷氨酸脱羧酶(GAD，EC 4.1.1.15)对谷氨酸进行直接和不可逆的α-脱羧化。已在多个植物种类和组织的粗提物中对体外GAD活性进行了鉴定(Brown和Shelp，1989)。GAD对L-谷氨酸具有特异性，具有吡多醛5’-磷酸依赖性，受已知与巯基反应的试剂的抑制作用，具有钙调蛋白结合结构域，显示约5.8的明显酸性的最适宜pH。已鉴定了来自矮牵牛花(Baum等，1993)、番茄(Gallego等，1995)、烟草(Yu和Oh，1998)和拟南芥(Zik等，1998)的GAD基因。参与GABA旁路的第二个酶是GABA氨基转移酶(GABA-T；EC 2.6.1.19)，其将丙酮酸或α-酮戊二酸作为氨基受体，催化GABA可逆地转化为琥珀酸半醛。在粗提物中，相对于α-酮戊二酸，体外GABA-T活性似乎更优选丙酮酸。然而，烟草叶的粗提物中存在不同的丙酮酸依赖性和α-酮戊二酸依赖性活性，它们可通过离子交换色谱进行相互分离(Van Cauwenberghe和Shelp)。两种活性显示的最适宜pH很宽，为8-10。来自烟草的纯化约1000倍的丙酮酸特异性线粒体GABA-T的米氏常数(Km)就GABA为1.2mM，就丙酮酸为0.24mM(Van Cauwenberghe和Shelp)。
GABA旁路的最后一步由琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH；EC 1.2.1.16)催化，不可逆地将琥珀酸半醛氧化为琥珀酸。所述部分纯化的植物酶具有约为9的碱性最适宜pH，与NAD的活性最多是与NADP的活性的20倍(Shelp等，1995)。
实际上，对植物中GABA旁路的兴趣主要来自关于GABA主要在对生物性应激和非生物性应激作出应答时快速产生的实验观察。从此将GABA旁路与各种生理应答联系起来，包括胞质pH调节、TCA循环碳流入、氮代谢、阻止昆虫、对氧化应激的保护作用、渗透调节和信号传导。
对氧化应激的保护作用
在拟南芥中，琥珀酸半醛脱氢酶被破坏的突变体对环境应激更为敏感，因为它们不能清除H2O2(Bouche等，2003)。GABA旁路的最后一步可向呼吸链同时提供琥珀酸和NADH。因此假设GABA降解可在抑制TCA循环的某些酶的氧化应激条件下限制活性氧中间体的累积。在酵母中，GABA旁路基因被敲除的突变体似乎对H2O2更为敏感(Coleman等，2001)。
Coleman等，2001的研究提供了对GAD在胞内参与氧化应激耐受性的认识。增大酿酒酵母(S.cerevisiae)GAD1基因座的基因剂量导致对两种不同氧化剂二酰胺和H2O2的耐受性增大。该增大的耐受性严格依赖于从谷氨酸产生琥珀酸的完整的谷氨酸分解代谢途径的存在。遗传消除谷氨酸脱羧酶下游任何一个酶反应均会使细胞对氧化剂产生超敏感性。
相容性溶质的合成/过表达
耐盐性生物对长期和短期的盐胁迫的细胞应答包括合成和累积一类称为相容性溶质的渗透保护性化合物。这些较小的有机分子对代谢不具有毒性，包括脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、多元醇、糖醇和可溶性糖。这些渗压剂稳定蛋白质和细胞结构，可增大细胞的渗透压(Yancey等，1982)。该应答对细胞水状态具有内稳态作用，其面对包含较高量NaCl的土壤溶液时会受到干扰，从而导致水分从细胞流失。甘氨酸甜菜碱和海藻糖作为蛋白质四级结构和细胞膜高度有序状态的稳定剂发挥作用。甘露醇作为自由基清除剂发挥作用。其还能稳定亚细胞结构(膜和蛋白质)并在应激下缓冲细胞氧化还原电位。因此，这些有机渗压剂也称为渗透保护剂(Bohnert和Jensen，1996；Chen和Murata，2000)。
相容性渗压剂
AtProT2可由水应激，AtProT2和LeProT1转运GABA以及其它应激相关化合物，如脯氨酸和甘氨酸甜菜碱诱导(Breitkreuz等1999；Schwacke等1999；Fischer等1998)。这些发现表明，GABA可能具有作为相容性渗压剂的作用(Yancey 1994)。所有三种化合物在中性pH下均为两性离子，水溶性高，可累积到低mM浓度，明显对细胞的没有毒性作用。在高浓度(25-200mM)下，GABA在盐存在时能稳定并保护分离的类囊体免受冷冻损伤，胜过脯氨酸的低温防护性质。此外，GABA具有体外羟基-自由基-清除活性，胜过脯氨酸和甘氨酸甜菜碱在相同浓度(16mM)下的该活性(Smirnoff和Cumbes 1989)。可通过位于叶绿体的参与合成甘氨酸甜菜碱的甜菜碱醛脱氢酶从γ-氨基-丁醛(多胺分解代谢途径的一种产物)合成GABA(Trossat等，1997)，但相对谷氨酸脱羧作用多胺的相对通量仍未知。
发明目的
本发明涉及一种通过用谷氨酸脱羧酶基因进行土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化来增大植物(单子叶植物和双子叶植物)的耐盐性的方法。此外，本发明涉及一种使植物表达耐盐性相关基因的植物修饰方法，以及采用该方法产生的植物。
描述了一种采用来自水稻的谷氨酸脱羧酶基因增大植物耐盐性的方法。先前已采用渗压剂如甘露醇、4-O-甲基内消旋肌醇、海藻糖、脯氨酸、甜菜碱或果聚糖、艾可托英、肌醇在该方向上进行了尝试。
非生物性应激是限制作物生产的复杂环境约束。产生应激耐受性作物的生物工程应激信号传导途径是农业研究的主要目标之一。渗压调整是这种操作的有效组成，渗压保护剂(相容性溶质)的累积是植物系统中观察到的常见应答(Penna 2003)。相容性溶质保护植物免受应激的其它机制包括对氧自由基脱毒并稳定蛋白质的四级结构以保持其功能。
考虑到耐盐性的生理复杂性和遗传学特征，产生耐盐性作物是一项很困难的任务。在该方向上仅在上世纪90年代中期有有限的成功例子(Flowers和Yeo，1995)，自那以后鲜有进展。已提出了各种方法，包括常规繁殖育种、远缘杂交、利用生理特性，以及最近为标记协助性选择和利用转基因植物。这些方法中没有一种可称为通用方案。常规繁殖育种计划很少能提供增强的耐盐性(Flowers和Yeo，1995)，而远缘杂交通常使产量降低到不可接受的低水平(Yeo和Flowers，1981)。采用生理标准作为选择水稻的基础已取得了成功(Dedolph和Hettel，1997)，近年来已提出将这样的方法用于小麦(Munns等，2002)。近期的分析显示，尽管可能产生与耐盐性相关的某个方面特性改变的大量转基因植物，但尚未在该领域中进行任何测试，很少有成功例子声称符合显示增强耐受性所需的最低标准(Flowers，2004)。
目前尚未出现采用参与GABA旁路途径的基因，特别是来自水稻的谷氨酸脱羧酶来增大植物耐盐性的尝试。之前的尝试涉及来自水稻的两种谷氨酸脱羧酶基因OsGAD1和OsGAD2，经土壤杆菌将二者同时引入水稻愈伤组织以建立转基因细胞系。再生的水稻植物具有异常表型，如矮态、黄化叶和不育(Akama和Takaiwa，2007)。
序列表
SEQ ID 1显示水稻谷氨酸脱羧酶基因的核酸序列。起始密码子和终止密码子用斜体表示。
SEQ ID 2显示水稻谷氨酸脱羧酶基因的氨基酸序列。星号表示终止密码子。
附图简要说明
图1显示携带谷氨酸脱羧酶编码DNA序列的植物转化载体。
图2显示通过土壤杆菌介导的基因转移用GAD基因转化烟草叶的不同阶段。
图3显示用以下不同的引物组合对转化和再生的具有GAD基因的烟草T0幼苗进行的PCR证实：-a)HygR基因的正向和反向引物；b)基因特异性正向和反向引物和c)基因正向引物和Nos反向引物。
图4显示对具有GAD基因的烟草T0幼苗中引入基因(GAD)表达的证实，其中采用以cDNA为模板的RT-PCR用GAD基因特异性正向和反向引物分析GAD基因。
图5显示在盐胁迫条件(200mM NaCl)下生长于光照室琼脂培养基上的T1 GAD转基因烟草幼苗(D1A、E2和H1)的较好性能。
图6显示在盐胁迫条件(300mM NaCl)下生长于温室水栽培养基上的T1 GAD转基因烟草幼苗(E2和H1)的较好性能。
图7显示在不同水平盐胁迫(0、200和300mM NaCl)下生长于温室罐中的呈潮霉素阳性的GAD转基因植株的T1幼苗(D1A、E2和H1)和野生型幼苗之间植株高度的比较。
图8显示在不同水平盐胁迫(0、200和300mM NaCl)下生长于温室罐中的呈潮霉素阳性的GAD转基因植株的T1幼苗(D1A、E2和H1)和野生型幼苗之间节间距离的比较。
图9显示在不同水平盐胁迫(0、200和300mM NaCl)下生长于温室罐中的呈潮霉素阳性的GAD转基因植株的T1幼苗(D1A、E2和H1)和野生型幼苗之间叶片数量的比较。
图10显示在不同水平盐胁迫(0、200和300mM NaCl)下生长于温室罐中的呈潮霉素阳性的GAD转基因植株的T1幼苗(D1A、E2和H1)和野生型幼苗之间茎周长或厚度的比较。
图11显示在不同水平盐胁迫(0、200和300mM NaCl)下生长于温室罐中的呈潮霉素阳性的GAD转基因植株的T1幼苗(D1A、E2和H1)和野生型幼苗之间叶片面积的比较。
图12显示在不同水平盐胁迫(0、200和300mM NaCl)下生长于温室罐中的呈潮霉素阳性的GAD转基因植株的T1幼苗(D1A、E2和H1)和野生型幼苗之间总生物量的比较。
图13显示在不同水平盐胁迫(0、200和300mM NaCl)下生长于温室罐中的呈潮霉素阳性的GAD转基因植株的T1幼苗(D1A、E2和H1)和野生型幼苗之间总谷物产量的比较。
发明详述
提供以下对本发明的详细说明来协助本领域技术人员实施本发明。即使如此，不应将对本发明的详细说明理解为对本发明构成不适当的限制，因为本领域普通技术人员可作出本文所讨论的实施方式中的修改和变动，而不背离本发明的精神或范围。
本发明涉及一种具有谷氨酸脱羧酶特征的纯化分离的DNA序列。
如本发明所述，所述纯化分离的DNA序列通常由谷氨酸脱羧酶核苷酸序列或其片段组成。
本发明还包括上述序列或片段的互补序列，其可通过任何手段产生。
本发明包括上述序列的变体，即通过保守核苷酸取代而不同于参考序列的核苷酸序列，其中一个或多个核苷酸被其它具有相同特征的核苷酸取代。
如本发明所述，上述核苷酸序列可位于表达载体中包含启动子和感兴趣基因的序列的5’和3’端。
本发明包括上述序列在增大由此产生的植物的耐盐性方面的应用，“耐盐性”指在合适的条件下将DNA序列引入宿主植物中后，与未用所述DNA序列转染的对照植物相比，所述序列能够增强植物耐受植物生长环境中高浓度盐的能力。
以下定义用来帮助理解本发明。
“染色体”是在细胞内发现的DNA和蛋白质的有序结构。
“染色质”是在真核细胞的细胞核内发现的DNA和蛋白质的复合体，其组成染色体。
“DNA”或脱氧核糖核酸包含遗传信息。其由不同的核苷酸构成。
“基因”是编码成熟蛋白质的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列，“基因”不应包含不翻译侧翼序列如RNA转录起始信号、多聚腺苷酸化添加位点、启动子或增强子。
“启动子”是控制基因表达的核酸序列。
“增强子”指不依赖基因位置或取向而启动基因转录的基因序列。
本文定义的“载体”指可向其中插入外源DNA片段的DNA分子。载体通常衍生自质粒，其作用类似“分子运载体”，携带DNA片段进入宿主细胞。
“质粒”是在细菌和一些其它生物体中发现的小环状DNA。质粒可独立于宿主细胞染色体进行复制。
“转录”指从DNA模板合成RNA。
“翻译”指从信使RNA合成多肽。
“取向”指DNA序列中核苷酸的次序。
“基因扩增”指对某个基因进行重复复制而不引起其它基因拷贝数量成比例增多。
“转化”指通过任何转移手段向植物细胞引入外源遗传材料(DNA)。不同的转化方法包括基因枪轰击(生物射弹)、电穿孔、土壤杆菌介导的转化等。
“转化植物”指将外源DNA引入其中的植物。该DNA将成为宿主染色体的一部分。
“稳定的基因表达”指制备永久性表达感兴趣基因的稳定的转化植物取决于质粒稳定整合到宿主染色体中。
实施例1
从水稻分离和纯化GAD基因核苷酸序列，构建植物转化载体。
将GAD基因克隆到35S花椰菜花叶病毒启动子下游，用NOS终止子终止，全部为操作性连接。
植株材料
将水稻(Rasi变种)用于制备核酸。种子萌发后，将其置于培养室的水栽溶液中培育。用150mM NaCl对幼苗处理7-16小时。
提取RNA和构建EST文库
从整株幼苗中提取RNA。构建受盐胁迫的RASI cDNA的EST文库。从EST文库中鉴定显示与谷氨酸脱羧酶具有相同性的EST。
鉴定和分离GABA旁路中的基因
在高等植物中GABA在各种应激开始之后发生累积，所述应激如酸化作用、缺氧、低温、热激、机械性刺激、病原体侵袭、干旱和盐胁迫。已从水稻的盐胁迫文库中分离出GABA旁路中的谷氨酸脱羧酶基因。
克隆谷氨酸脱羧酶基因
已将谷氨酸脱羧酶基因克隆到克隆载体和植物转化载体中(生物射弹，二等分)，位于组成型启动子之下。从籼稻(RASI变种)cDNA扩增编码谷氨酸脱羧酶基因完整编码序列的cDNA，采用以下用BglII和EcoRI限制酶位点(下划线标出的核苷酸序列)标记的引物对：
正向：5′-GCGGATCCATGGTGCTCTCCAAGGCCGTCTC-S′
反向：5′-GCGAATTCCTAGCAGACGCCGTTGGTCCTCTTG-S′
采用以下PCR条件：94℃1分钟；94℃30秒；75℃3分钟(循环5次)；94℃30秒；68℃3分钟(循环30次)，68℃最后延伸7分钟。
扩增的cDNA由1479个核苷酸碱基对组成，编码成熟的谷氨酸脱羧酶。
将扩增的片段克隆到pGEMT轻便(pGEMT easy)载体中。在BamHI和EcoRI位点限制性消化所述基因，并连接到生物射弹载体pV1中。在BglII和EcoRI限制位点切割该生物射弹载体(BglII和BamHI酶产生相容性末端)以证实存在所述基因。还通过测序证实所述基因。所得载体(pV1-GAD)具有由35S花椰菜花叶病毒(35S CaMV)启动子驱动和NOS终止子终止的GAD基因(1.479kb)，其中用氨苄青霉素抗性基因作为选择性标记。
在HindIII和BamHI位点限制性消化来自pV1-GD的由35S CaMV启动子驱动和NOS终止子终止的GAD基因的基因盒。将该基因盒连接到在HindIII和BamHI位点限制性消化的pCAMBIA 1390 pNG15中。所得载体(pAPTV 1390-GAD)具有由35S花椰菜花叶病毒(35S CaMV)启动子驱动和NOS终止子终止的GAD基因(1.479kb)，其中nptII(卡那霉素抗性)基因和hph(潮霉素抗性)基因作为选择性标记(图1)。
实施例2
产生具有改变的GAD基因的植株
植株转化
通过土壤杆菌将谷氨酸脱羧酶基因转化到烟草(模式植物)中，以证明所鉴定基因的构思。
土壤杆菌介导的用携带GAD基因的二元载体(binary vector)转化烟草叶外植体的详细步骤如下：
1.将土壤杆菌的阳性菌落接种到含50mg/L卡那霉素(Kan)和10mg/L利福霉素(Rif)的LB肉汤中作为由Kan和Rif抗性基因组成的载体主链，同时也作为一次进行的双重选择。2.然后将所述肉汤置于摇床上在28℃下培育。
3.将过夜生长的菌落在早上接种到含50mg/L Kan和10mg/L Rif的50mLLB肉汤中，在28℃培育3-4小时，检测600nm的OD，并使其继续生长到OD为0.6-1。
4.一旦所述肉汤达到所需OD，将其在5000rpm离心5分钟。
5.弃去上清液，将细胞沉淀溶解在穆拉什格斯固格(Murashige & Skooge，MS)液体培养基(Agro-MS肉汤)中。
6.将烟草叶切为小方片作为外植体而不携带中脉，小心地在所有四个面上对叶进行破坏而不损伤接种物的中心部分。
7.将这些叶样品置于MS普通培养基上，在培育箱中放置两天。接种两天后，用现处于Agro-MS肉汤中的土壤杆菌细胞转化这些叶样品。
8.将所述叶样品在该Agro-MS肉汤中放置30分钟，然后将其在共培养基上放置两天，所述共培养基由MS+1mg/L盐酸6-苄氨基嘌呤(BAP)+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+250mg/L头孢噻肟组成(图2a)。
9.在共培养之后，将外植体在第一选择培养基中保持15天，所述第一选择培养基由MS+1mg/L BAP+0.2mg/L NAA+40mg Hyg+250mg/L头孢噻肟组成，随着愈伤组织开始伸出，再次将这些外植体置于第一选择培养基上进行亚培养，以便使愈伤组织足够成熟(图2b)。
10.一旦发现所述愈伤组织达到成熟，将这些愈伤组织接种到第二选择培养基上，所述第二选择培养基由MS+1mg/L BAP+0.2mg/L NAA+50mg Hyg+250mg/L头孢噻肟组成。随着潮霉素浓度增大，第一选择的逃离例受到抑制，仅有转化的愈伤组织开始在该培养基上存活。
11.随后10天中在该第二培养基上进行一次亚培养。
12.此时，小植株开始从愈伤组织伸出。取出来自第二选择的小植株置于生根培养基上，所述生根培养基由1/2MS+0.2mg/L吲哚-3-丁酸(IBA)组成。此处的小植株在12-15天时开始伸出根部。由于也在该阶段鉴定逃离例，一旦形成成熟的根，将所述植株在含20mg/L潮霉素的生根培养基上进行亚培养(图2c)。
13.使该阶段的植株习服，其中将瓶盖在开放状态保持两天，使植株适应其生长空间环境。之后将植株从琼脂培养基上移出并在1/4MS液体培养基上放置两天。再将这些植株转移到蛭石上，每天浇水，持续一周。
14.根据植株的条件，将合适的植株转移到温室。
15.在将植株送到温室之前的习服期间收集植株的老叶。
16.从各叶样品提取DNA，用基因特异性引物和选择性标记如潮霉素引物进行PCR。再将PCR证实的阳性植株转移到温室。
用引入的GAD基因证实植株
提取GAD烟草转基因品系的基因组DNA
收集转基因GAD烟草植株的叶样品，提取基因组DNA。
基因组DNA提取的步骤：
·从各植株收集约1gm叶。
·用液氮在研钵和臼中研磨所述样品。
·向所述样品中加入1ml提取缓冲液(0.2M Tris Cl pH-8.0；2M NaCl；0.05M EDTA；2％CTAB)，在13000rpm离心10分钟。
·收集上清液。加入RNA酶[1ml加入3μl(1mg/mL)]，在37℃培养半小时。
·然后加入相等体积的氯仿-异戊醇，在13000rpm离心10分钟。
·将上清液收集在新管中，加入相等体积的冷异丙醇，在13000rpm离心10分钟。
·用70％的醇洗涤沉淀，将沉淀干燥并溶解在30μl温热的高压灭菌水中。
·将1μl DNA加样到凝胶上进行检测。
用不同引物组合进行PCR证实转基因植株：
1.用潮霉素正向(Hyg F)和潮霉素反向(Hyg R)引物进行PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   1μl
  Hyg F   10pM   0.5μl
  Hyg R   10pM   0.5μl
  dNTP混合物   10mM   0.5μl
  Taq DNA聚合酶   3U/μl   0.3μl
  Taq缓冲液A   10X   3μl
  Milli Q水   24.2μl
  总体积   30μl
PCR条件：(艾本多夫仪器(Eppendorf Machine))
  步骤   温度   时间  循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   50℃   50秒
  4   72℃   1分钟  返回步骤2，30次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
图3a中显示在0.8％琼脂糖凝胶上观察到的扩增产物。
2.用基因特异性引物GAD正向(GD F)和GAD反向(GD R)引物进行PCR：
 试剂   母液   体积
 模板DNA   2μl
  GD F   10pM   0.5μl
  GD R   10pM   0.5μl
  dNTP混合物   10mM   0.5μl
  Taq DNA聚合酶   3U/μl   0.3μl
  Taq缓冲液A   10X   2μl
  Milli Q水   14.2μl
  总体积   20μl
PCR条件：(艾本多夫仪器)
  步骤   温度   时间  循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   69℃   50秒
  4   72℃   1.30分钟  返回步骤2，35次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
在0.8％琼脂糖凝胶上观察到扩增产物(图3b)。
3.用GD F和Nos MR进行PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   2μl
  GD F   10pM   0.5μl
  Nos MR   10pM   0.5μl
  dNTP混合物   10mM   0.5μl
  Taq DNA聚合酶   3U/μl   0.3μl
  Taq缓冲液A   10X   2μl
  Milli Q水   14.2μl
  总体积   20μl
PCR条件：(艾本多夫仪器)
  步骤   温度   时间  循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   67℃   50秒
  4   72℃   2分钟  返回步骤2，35次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
图3c中显示在0.8％琼脂糖凝胶上观察到的扩增产物。
不同PCR反应中采用的引物序列如下所示：
Hyg F：5′-CTGAACTCACCGCGACGTCT-3′
Hyg R：5′-CCACTATCGGCGAGTACTTC-3′
GDF：5′-GCGGATCCATGGTGCTCTCCAAGGCCGTCTC-3′
GDR：5′-GCGAATTCCTAGCAGACGCCGTTGGTCCTCTTG-3′
NOS MR：5′-GATAATCATCGCAAGACCGGCAAC-3′
证实引入的GAD基因在转基因植株中表达
对引入的GAD基因表达的证实包括以下步骤，例如提取RNA、合成cDNA和逆转录PCR。
分离转基因GAD烟草植株和对照植株(野生型)的RNA。
提取RNA包括的详细步骤：
1.在预冷的臼中取出500mg叶组织，用液氮研磨成细粉末。
2.采用冷刮刀将所述粉末转移到预冷的艾本多夫管中。
3.向匀浆样品中加入1ml Trizol溶液(英杰公司(Invitrogen))。充分混合并在室温(RT)下培育5分钟。
4.向其加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，在室温下培育5分钟。
5.将所述样品在13000rpm、4℃离心15分钟。
6.将上部水相收集在新管中(约60％，即600μl)。
7.向收集的上部相中加入冷异丙醇，在室温下培育10分钟。
8.将所述样品在13000rpm、4℃离心15分钟。
9.倾析出上清液，用500μl 70％的醇(DEPC H2O)洗涤沉淀，在10000rpm、4℃离心5分钟。
10.倾析出上清液，在室温下将沉淀干燥15分钟。
11.在设为55℃的热水浴或干浴中将沉淀溶解在20μl经DEPC处理的H2O中。
12.将2μl样品加样到凝胶上。将所述样品储存于-80℃，供进一步使用。
合成cDNA包括的详细步骤：合成转基因GAD烟草植株和野生型植株的cDNA：
1.以以下顺序加入所述组分：
总RNA：4μl(1μg)
寡dT：0.5μl
0.1％DEPC/无核酸酶的水：6.5μl
总计：11μl
2.用PCR机将所述组分在70℃加热5分钟，在冰上骤冷。
3.同时将以下组分加入另一个管中制备下一个混合物：
5x反应缓冲液：4μl
dNTP混合物(10mM)：2μl
RNA酶抑制剂(20U/μl)：0.5μl
0.1％DEPC/无核酸酶的水：2μl
总计：8.5μl
4.将该8.5μl混合物加入PCR管的组分中，骤冷并轻拍混合。
5.将PCR管中的组分用PCR机在37℃培育5分钟。
6.向所述管中加入0.5μl M-MuLV RT酶，继续进行PCR机中设定的程序(25℃10分钟，37℃60分钟，70℃10分钟)。
7.将cDNA储存于-20℃，供进一步用于PCR。
通过RT-PCR分析引入的GAD基因在转基因烟草植株中的表达
通过用基因特异性引物进行PCR来分析来自GAD转基因烟草和野生型植株的cDNA样品，以检测引入的GAD在烟草中的表达：
用基因特异性引物进行cDNA的PCR：
  试剂   母液   体积
  模板DNA   2μl
  GD F   10pM   0.5μl
  GD R   10pM   0.5μl
  dNTP混合物   10mM   0.5μl
  Taq DNA聚合酶   3U/μl   0.3μl
  Taq缓冲液A   10X   3μl
  Milli Q水   24.2μl
  总体积   30μl
PCR条件：(Eppendorf机)
  步骤   温度   时间  循环
  1   94℃   3分钟
  2   94℃   30秒
  3   69℃   50秒
  4   72℃   1.30分钟  返回步骤2，30次
  5   72℃   10分钟
  6   10℃   ∞
图4中显示在0.8％琼脂糖凝胶上观察到的扩增产物。
实施例3
具有改变的GAD基因的植株在幼苗阶段耐受盐胁迫的证据
在T1代的幼苗阶段和包括植株整个生命周期的成体植株阶段中研究了转基因植物对盐胁迫的耐受性。
幼苗阶段在培养基上的耐盐性
用野生型和T1GAD转基因烟草幼苗进行盐胁迫实验。用无菌水洗涤两次，之后用70％的醇洗涤2分钟，然后用70％漂白液处理10分钟，最后用无菌水洗涤5-6次，以便对T1种子进行表面灭菌。然后将所述种子吸干干燥并置于具有不同盐浓度(0、50和200mM NaCl)的14MS培养基平板上，在28℃避光培育使其萌发。萌发之后，将其转移到光照室中施以16小时光照和8小时避光的循环。
与野生型相比，三个转基因产物D1A、E2和H1显示对200mM NaCl的耐受性。野生型种子在200mM NaCl下不萌发，无法进行良好生长。生长培养基中存在高盐浓度会抑制野生型幼苗(不含引入的GAD基因的植株)的正常生长，而由于引入的GAD基因使转基因幼苗具有对生长培养基中高盐浓度的耐受性，因此高盐的存在不影响转基因幼苗的正常生长。
在水栽培养基上测试的幼苗阶段的耐盐性
选择E2和H1两个转基因产物评价在水栽培养基中测试的对高盐的耐受性。所述T1种子在补充有潮霉素(50mg/L)的湿润滤纸盘上萌发，选择萌发并在该滤纸盘上生长的阳性幼苗，将其连同野生型幼苗置于水栽浮器上。
水栽生长培养基由补充有不同盐浓度(100、200和300mM)的1/10thMS培养基组成。每天监测培养基的pH，使其保持在5-7的范围内。每两天洗涤水栽槽并更换一次培养基，以避免真菌和藻类生长。在生长五周之后进行最终的观察。
与野生型相比，两个转基因产物E2和H1显示对300mM NaCl的耐受性(图6)。野生型种子在300mM NaCl上萌发并生长，但无法进行良好生长，与转基因幼苗相比，长势较弱，所含生物量较少。生长培养基中存在高盐浓度会抑制野生型幼苗(不含引入的GAD基因的植株)的正常生长，而由于引入的GAD基因使转基因幼苗具有对生长培养基中高盐浓度的耐受性，因此高盐的存在不影响转基因幼苗的正常生长。在该实验中，我们能够证明转基因植物具有增大的耐盐性，可耐受最高达300mM NaCl的盐胁迫。
实施例4
具有改变的GAD基因的植株在其整个生命周期中耐受盐胁迫的证据
在T1代的包括植株整个生命周期的成体植株阶段中研究了转基因植物对盐胁迫的耐受性。
选择D1A、E2和H1三个转基因产物评价在温室罐培养中测试的对高盐的耐受性。用野生型和转基因烟草进行实验。所述T1种子在补充有潮霉素(50mg/L)的湿润滤纸盘上萌发，选择萌发并在该滤纸盘上生长的阳性幼苗，将其连同野生型幼苗置于大罐(直径11英寸)中的土壤上。在包含田间土壤和农家肥料(FYM)的温室罐中培养幼苗。用普通水或包含200或300mM NaCl的盐水灌溉植株。所述实验对四种基因型(野生型和D1A、E2、H1转基因烟草)进行三种处理和三次重复，如表1所示。
表1：耐盐性研究的实验设计。对四种基因型进行三种处理和三次重复以进行比较。
Figure BPA00001330331700201
表型评价：
观察表型特征，记录如植株高度、节间距离、枝条数量、叶片数量、叶片面积、茎厚度(周长)、总生物量、谷物产量等参数。
植株高度
测定转基因植株和野生型植株(不含引入的谷氨酸脱羧酶基因的植株)的植株高度。采用从土壤水平面到植株顶端包括花序和枝条的度量测定植株高度。与野生型植株相比，转基因植株在盐胁迫条件(200和300mMNaCl)下显示更高的植株高度(至少高出20％)(图7)。
节间距离
测定转基因植株和野生型植株(不含引入的谷氨酸脱羧酶基因的植株)的茎上两个节之间的距离。测定第5片和第6片叶之间以及第6片和第7片叶之间的节间距离。从顶部对叶进行计数，其中将完全伸展的叶作为第1片叶。用一根线测定距离，然后用一种度量测定线长度并用厘米(cm)表示。与野生型相比，转基因植株在高水平盐度下显示节间距离增大(图8)。
叶片数量
与野生型相比时，在转基因植株中观察到在盐土壤条件(200和300mMNaCl)下的叶片数量增长(图9)。与野生型相比，转基因植株在叶片数量上显示至少20％的增长。
茎周长(圆周长或茎厚度)
测定转基因植株和野生型植株(不含引入的谷氨酸脱羧酶基因的植株)的茎的厚度。从土壤水平面以上5-6cm处测定茎的周长。在合适的高度用一根线环绕茎，然后用一种度量测定线长度并用cm表示。与野生型相比，转基因植株在200mM NaCl条件下显示更粗的茎(厚27-45％)(图10)。
叶片面积
测定转基因植株和野生型植株(不含引入的谷氨酸脱羧酶基因的植株)的叶片尺寸。从叶片的节到顶端对叶进行垂直测定，将其作为叶片长度。在最宽的点水平测定叶片的宽度，将其作为叶片宽度。用长度×宽度计算叶片面积，以cm2为单位表示。与野生型相比时，在盐性土壤条件(200和300mM NaCl)下，转基因植株的叶片面积显著增大(图11)。与野生型相比时，观察到转基因植株在盐胁迫条件下具有两倍大的叶片面积。
植株生物量
测定转基因植株和野生型植株(不含引入的谷氨酸脱羧酶基因的植株)产生的生物量。通过总植株干重估计植株生物量。在不同盐胁迫条件下估计植株生物量。与野生型相比，转基因植株的总生物量在200和300mMNaCl条件下明显较高(图12)。盐胁迫条件下的转基因植株的生物量比野生型植株至少高30％。
谷物产量
转基因植株的总谷物产量在盐和非盐条件下均高于野生型(图13)。虽然在盐条件下的谷物产量与非盐条件相比时有所降低，但与类似条件下的野生型植株相比，转基因植株的谷物量较多。
就不同的植株农艺学和生理状态而言，GAD转基因植株在高盐度条件下性能优于野生型植株，由此表明GAD基因对转基因植株在盐胁迫条件下的优异性能的作用。
Figure IPA00001330331300011
Figure IPA00001330331300031
Figure IPA00001330331300041

Claims (16)

1.一种产生显示对环境应激的耐受性增强的转化植物的方法，其包括：将包含与编码功能性谷氨酸脱羧酶(GAD)的核苷酸序列操作性连接的启动子的DNA构建体引入到植物基因组中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码功能性谷氨酸脱羧酶的核苷酸序列包含SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子选自与SEQ ID No.1所示核苷酸序列操作性连接的组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或细胞特异性启动子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所选的启动子来自诱导型启动子，能够对选自机械性刺激、热、冷、盐、洪水、干旱、创伤、缺氧、病原体、紫外线-B、营养耗竭、开花信号、结果信号、细胞特化或其组合的信号作出应答。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所选的启动子来自组织特异性启动子，在选自叶、茎、根、花、花瓣、花药、胚珠等或其组合的植物组织中表达。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所选的启动子来自细胞特异性启动子，在选自薄壁组织、叶肉、木质部、韧皮部、保卫细胞、气孔细胞等或其组合的植物细胞中表达。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有效催化谷氨酸到γ-氨基丁酸(GABA)的反应。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化植物表达SEQ ID NO：1所示的谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的水平高于相同条件下同种非转化植物表达GAD基因的水平。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶植物选自单子叶植物、双子叶植物、谷类、饲料作物、豆科植物、豆类植物、蔬菜、水果、油料种子、纤维作物、花、园艺植物、药用植物和芳香植物。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将DNA构建体引入植物基因组的方法包括：
(i)用所述DNA构建体转化宿主植物的细胞、组织或器官；
(ii)选择包含所述DNA构建体的转化细胞、细胞愈伤组织、体细胞胚或种子；
(iii)从所选转化细胞、细胞愈伤组织、体细胞胚或种子再生完整植株；和
(iv)选择表达所述多核苷酸的再生完整植株。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，采用颗粒枪、生物射弹或土壤杆菌介导的DNA构建体转化宿主植株的细胞组织或器官。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法获得的转化植株及其后代。
14.如权利要求13所述的转化植物，其特征在于，将SEQ ID NO：1所示的DNA构建体引入杂合或纯合态的植株中。
15.如权利要求1-14中任一项所述的转化植物，其特征在于，所述植株对环境应激的耐受性显著增强，所述环境应激选自盐胁迫、干旱、机械性刺激、热、冷、盐、洪水、创伤、缺氧、病原体、紫外线-B、营养耗竭或其组合。
16.一种用包含与编码GAD酶的多核苷酸操作性连接的组成型启动子的载体转化的植株或其后代，其特征在于，所述植株表达所述多核苷酸，且与非转化植株相比，所述植株的生长特征、产量、繁殖功能或其它形态学或农艺学特征显著改善。
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