CN103255112B

CN103255112B - 花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20ox1与应用

Info

Publication number: CN103255112B
Application number: CN201310207109.8A
Authority: CN
Inventors: 王兴军; 王成祥; 侯蕾; 安静; 赵术珍; 夏晗; 赵传志; 李爱芹
Original assignee: High Tech Research Center Of Shandong Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: High Tech Research Center Of Shandong Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2033-05-29
Also published as: CN103255112A

Abstract

本发明涉及花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20ox1与应用。一种花生GA20-氧化酶AhGA20ox1蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因与应用。本发明为阐明赤霉素影响花生荚果发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且在高产、优质花生新品种培育方面具有重要指导意义，为利用转基因技术通过控制赤霉素创新作物新种质奠定了基础。

Description

花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20ox1与应用

技术领域

本发明涉及花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20ox1与应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

赤霉素（gibberellins，简称GAs）属于四环二萜类化合物，是一种植物激素，至今已发现130余种（参见Israelsson et al.Plant Physiol,135(1)221-30,2004）。赤霉素具有促进种子萌发、促进茎的伸长和叶的生长、诱导开花及种子和果实生长等多种生理功能，其对生长发育过程的调节是植物生存和作物生产必不可少的。

二十世纪七十年代，育种家培育出植株矮化和抗倒伏的作物新品种，此品种的茎秆缩短，但是生物合成量不变，作物产量增加（参见Schwender et al.Biochem,31673-80,1996）。这些表型通常是由于赤霉素合成代谢或信号传导的相关基因突变引起的。因此，研究赤霉素生物合成途径基因的功能及其在作物改良中的应用具有重要意义。

根据赤霉素生物合成参与酶系的不同以及参与酶的细胞区隔化，将整个合成途径分为以下3个步骤：第一步发生在高等植物的原质体内；第二步发生在内质网上；第三步发生在细胞质内，在不同酶的氧化作用下转变为不同种类的GAs。赤霉素生物合成涉及多种酶的催化作用。其中，GA20-氧化酶催化生成了具有生物活性的GAs，因此，GA20-氧化酶是赤霉素生物合成途径最重要的限速酶（参见Croker et al.Plant Physiol,94(1)194-200,1990;Martinet al.Planta,200(2)159-66,1996），对GA20-氧化酶基因的克隆和功能确认，并最终应用于农作物种质创新具有重要价值。

在模式植物拟南芥和主要农作物如水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays L.）等中进行了该基因的分离和功能鉴定（参见Spielmeyer et al.PNAS,999043-9048,2002;Appleford et al.Planta,223568-582,2006），人们对该基因也有了进一步的了解。在许多植物中该酶是由多基因家族编码的，其氨基酸序列的同源性较低，家族的不同成员之间在表达上具有组织特异性。

GA20-氧化酶基因的表达受到多种因素的调节。GA20-氧化酶基因在长日照下的转录水平高于短日照下的转录水平。当拟南芥从短日照转到长日照后，GA20-氧化酶活性增加。高温能促进GA20-氧化酶基因的表达，导致柑橘（Carrizo citrange）果实和叶片中有活性的GA1含量升高（参见Vidal et al.Planta,217(3)442-8,2003）。GA20-氧化酶是典型的受负反馈调节的酶，在赤霉素生物合成突变体内转录水平非常高，而当外加活性GA处理时，GA20ox1的转录受到显著的抑制（参见Yamaguchi et al.Plant Cell,102115-2126,1998;Thomas et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,964698-4703,1999）。

通过有效操控GA20-氧化酶基因的表达可实现植物株型的改变。抑制GA20-氧化酶基因的表达能得到矮化或半矮化的转基因植株，解决了农作物高产和倒伏的矛盾（参见Niki et al.Plant Physiol,126(3)965-972,2001;Sakamoto et al.Nat Biotechnol,21909-913,2003;Xiao et al.Plant Growth Regul,50179-189,2006）。而过量表达GA20ox能促进赤霉素的过量合成，导致单性结实、加快植株生长。例如，在番茄中过量表达该基因致单性结实，增加了果实产量（参见García-Hurtado et al.J Exp Bot,63(16)5803-13,2012）；在树木中的应用可使木质部纤维细胞的数量增多、纤维变长，最终增加了转基因植株的生物量（参见Eriksson et al.NatureBiotechnology,18784-788,2000）。最新研究发现，GA20ox不仅参与植物株型的改变，还与植物抵抗病虫害有关。水稻OsGA20ox3超表达植株不仅表现出种子萌发快、节间伸长生长旺盛、早花、成熟植株株高增高等赤霉素超量合成表型，在接种稻瘟菌（Magnaporthe grlsea.）和纹枯菌（Rhizoctonia solan）后发病级数显著高于野生型，说明OsGA20ox3作为一种负调控因子参与水稻幼苗对病原真菌的防卫反应（参见Oikawa et al.Plant Mol Biol,55(5)687-700,2004;Qin et al.Mol Plant Microbe Interact,26(2)227-39,2013）。由此可见，GA20ox在植物的生长发育中发挥重要的作用，利用转基因技术控制该基因的表达是改良作物品质的有效方法。

花生是我国重要的油料作物之一，我国花生总产占全国油料作物总产量的1/2。然而，我国花生产业仍面临着十分严峻的问题，花生产量和含油量的进一步提高仍然是我国花生品种培育的最重要课题。加大生物技术在种质创新和品种培育中的力度是实现我国花生品种改良新飞跃的关键。然而，由于对花生重要农艺性状形成的分子机理知之甚少，花生的分子生物学研究也远落后于其他农作物，为了促进花生在我国油料产业中发挥更重要的作用，缓解我国油料及食用油短缺的现状，必须加快推动花生的分子生物学研究进程，在理论上阐明决定高产、优质与抗逆性状的遗传与分子基础。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20ox1与应用。

一种花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因。

该载体可购买市售的载体，经过常规手段，将目的基因SEQ ID NO.2导入载体，即可获得含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的重组载体。

一种重组细胞，含有上述编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因或者上述重组载体。

上述编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他经济作物品质中的应用。

有益效果

本发明首次发现了花生GA20-氧化酶蛋白及其编码基因AhGA20ox1，通过构建AhGA20ox1过量表达载体转化烟草，研究转基因植株，确认了所克隆基因的功能。通过分析AhGA20ox1基因在花生不同组织以及在果针不同时期的表达差异，发现AhGA20ox1基因在花生生长发育过程中起重要作用；为阐明赤霉素影响花生荚果发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且在高产、优质花生新品种培育方面具有重要指导意义，为利用转基因技术通过控制赤霉素创新作物新种质奠定了基础。

附图说明

图1、荧光定量PCR分析AhGa20ox1在花生不同组织中的表达量的柱状图；

其中：JS、幼年茎（15天），AS、成年茎（40天），JL、幼年叶片（15天），AL、成年叶片（40天），JR、根，F、花，G0、未入土的果针，G3、入土3天的果针，G9、入土9天的果针，S、未成熟种子；

图2、植物表达载体pCAMBIA2300-AhGa20ox1的构建过程示意图；

图3、通过PCR分子检测法，对AhGa20ox1转基因烟草的鉴定；

其中：1-10、AhGa20ox1转基因烟草植株，经PCR显示为阳性，为转基因植株；11：阴性对照；M：Marker DL2000（购自TaKaRa公司）；

图4、转AhGA20ox1基因烟草与野生型烟草生长20天照片；

其中：1：转AhGA20ox1基因烟草；WT：野生型烟草。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

烟草品种SR1购自山东鲁生生物科技有限公司；

鲁花14花生种子购自山东种业集团有限公司；

农杆菌EHA105购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。

花生品种的种植：

选取种仁饱满、没有病虫害及霉变的花生籽粒作为种子。首先温水浸种2～4h，然后种植于直径15cm，深10cm的花盆中。将花盆置于光照培养箱中，白天光照时间为16h，温度(25±0.3)℃，湿度为80%；夜晚黑暗时间8h，温度(20±0.3)℃，湿度为80%。一周左右子叶即可出土，在相应时间段进行样品采集。

以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规技术，试剂均为市售产品。

实施例1：花生AhGa20ox1基因全长的克隆

通过分析花生果针和荚果发育早期转录组高通量测序的信息，共查找到9条AhGa20ox1的Unigene。将短片段拼接成较长的基因片段，序列3'端缺失大概100bp的序列，5'端缺失大概20bp左右的序列。通过5'RACE和3'RACE进行巢式PCR扩增，最终得到AhGa20ox1全长开放读码框。该基因长度1125bp，编码一种花生GA20-氧化酶，其编码374个氨基酸残基。所推导的蛋白质氨基酸序列与大豆GmGA20ox蛋白（XP_003555361.1）、拟南芥AtGA20ox2蛋白（NP_199994.1）的同源性分别为82.2%和66.2%。5'RACE、3'RACE反应分别使用的是TaKaRa公司的5'-Full RACE Kit（TaKaRa Code:D315）、3'-Full RACE Core Set Ver.2.0（TaKaRa Code:D314）试剂盒。

具体步骤如下：

1.1花生RNA的提取：

（1）参照CTAB-LiCl法，称取0.2g新鲜花生组织（鲁花14），在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻。

（2）将研好的组织迅速转移至预热（65℃）的含有600μl CTAB提取液的Ep管中，立即剧烈涡旋振荡30s，使其混匀。

（3）65℃水浴2-5min，期间剧烈涡旋振荡3-5次。

（4）冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1）涡旋振荡1min，混匀，4℃，12000rpm离心15min。

（5）将上清转移到另一新的Ep管中，加入2μl的DNase I，37℃水浴15min。

（6）再加入等体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1）涡旋振荡1min，混匀，4℃，12,000rpm离心15min。

（7）将上清转移到另一新的Ep管中，加入1/3体积的8M LiCl，使其终浓度为2M，4℃过夜沉淀。

（8）4℃，12,000rpm离心20min，弃上清。

（9）分别用70%乙醇、无水乙醇洗沉淀，晾干，加30-50μl DEPC-H₂O，溶解沉淀。

1.25'RACE获得基因5'端：

步骤参照5'-Full RACE Kit（TaKaRa Code:D315）试剂盒说明书。通过已知片段序列，利用olige6.0软件在此片段上设计与5'RACE试剂盒中的outer引物和inner引物配对的基因特异性引物：

AhGA20ox1-5'race-outer:5'-CCAGTTCCCAAGGCGAGGTCAGGTT-3'（SEQ ID NO.3）

AhGA20ox1-5'race-inner:5'-GCTCATCCCTAGAAGCTCCATTATCCCC-3'（SEQ IDNO.4）

使用TaKaRa LA Taq（TaKaRa Code:DRR02）进行巢式PCR反应。PCR反应结束后，取10μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认5'RACE PCR扩增产物，AhGA20ox1的5'端得到大约230bp的条带，记作AhGA20ox1-5'。

1.33’RACE获得基因3'端：

步骤参照3'-Full RACE Core Set Ver.2.0（TaKaRa Code:D314）试剂盒说明书。通过已知片段序列，利用olige6.0软件在此片段上设计与3'RACE试剂盒中的outer引物和inner引物配对的基因特异性引物：

AhGA20ox1-3'race-outer：5'-CCTGACCTCGCCTTGGGAACTGGA-3'（SEQ ID NO.5）

AhGA20ox1-3'race-inner：5'-AACGGAAGGACGATAAGAT-3'（SEQ ID NO.6）

使用TaKaRa LA Taq（TaKaRa Code:DRR02）进行PCR反应。PCR反应结束后，取10μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认3'RACE PCR扩增产物，AhGA20ox1的3'端得到大约210bp的条带，记作AhGA20ox1-3'。

1.4RACE扩增产物的切胶回收：

电泳后切胶回收使用的是TaKaRa公司的TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.3.0(TaKaRa Code:9762)试剂盒，步骤参照说明书，制得回收的DNA片段1（5’RACE产物）、DNA片段2（3’RACE产物）。

1.5将回收的DNA片段1、DNA片段2分别连接pMD^TM18-T Vector(TaKaRa Code:6011)载体，构建成pMD18-T-AhGA20ox1-5'、pMD18-T-AhGA20ox1-3'。

连接体系如下：

将上述a、b、c反应物混匀，16℃反应过夜，用于转化大肠杆菌DH5α。

1.6大肠杆菌感受态细胞的制备：

（1）挑取E.coil DH5α（购自天根生化科技有限公司）单菌落接种到约5ml的LB液体培养基，于37℃，250rpm震荡培养过夜。

（2）次日将此菌液以1wt%的接种量转移至100ml的LB液体培养基中，继续培养至吸光度OD₆₀₀=0.4左右。

（3）将此菌液冰浴10min，在无菌条件下转移至预先冰冷的50ml离心管中，4℃、5000rpm离心10min，收集菌体。

（4）重悬于10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2中，冰浴10min，4℃、5000rpm离心10min，收集菌体。

（5）重悬于2ml（含15wt%甘油）的预冷的0.1mol/L的CaCl₂中，分装成100μl/管，-70℃保存备用。

1.7转化：

（1）从-70℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞置于冰上溶解。

（2）将10μl连接体系加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min。

（3）42℃热激90s，在此过程中不要晃动离心管。

（4）热激完毕后立即取出放于冰上2min。

（5）加入600μl的LB液体培养基，37℃，200rpm孵育1h。

（6）将菌液涂布在氨苄霉素（Amp，50mg/L）抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。

（7）将平板放入4℃保存。

1.8质粒的提取：

（1）用灭菌的牙签挑取单克隆菌斑，放入添加氨苄霉素（Amp，50mg/L）的LB液体培养基中，于37℃，250rpm震荡培养过夜。

（2）将菌液转移到离心管中，室温8000rpm离心2min，收集菌体。

（3）倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的液体流出。

（4）加入100μl预冷的溶液Ⅰ，在涡旋振荡器上剧烈震荡重悬菌体，其中所述溶液Ⅰ配方为：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、10mmol/L EDTA（pH8.0）。

（5）加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀10次，冰浴5min，其中所述溶液Ⅱ配方为：0.2mol/L NaOH、1wt%十二烷基硫酸钠（SDS）。

（6）加入150μl预冷的溶液Ⅲ，轻柔地颠倒10次，冰浴5min，4℃12000rpm离心10min，其中所述溶液Ⅲ配方为：5mol/L乙酸钾60ml、3mol/L冰乙酸11.5ml、H₂O28.5ml、pH5.2。

（7）将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（体积比为25:24:1），反复混匀，4℃12000rpm离心10min。

（8）将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比为24:1），反复混匀，4℃12000rpm离心10min。

（9）将上清转移到干净的离心管中，加入等体积预冷（-20℃）的异丙醇，混匀后-20℃沉淀1h，4℃12000rpm离心10min。

（10）倒掉上清，加入500μl70%的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥。

（11）加入TE溶液和2μl RNaseA，37℃消化0.5h，制得质粒。

1.9质粒的酶切检测：

（1）用pMD18-T载体两端的酶切位点BamH Ⅰ、Pst I对质粒进行双酶切

酶切体系：

（2）37℃酶切3h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果：pMD18-T-AhGA20ox1-5'、pMD18-T-AhGA20ox1-3'分别酶切出约230bp、210bp的条带。

1.10序列测定：

以上步骤中获得的阳性克隆pMD18-T-AhGA20ox1-5'、pMD18-T-AhGA20ox1-3'测序后，将序列结果进行NCBI BLAST比对，确认序列正确，并与已知序列进行拼接，得到AhGA20ox1基因全长的序列。

1.11PCR克隆AhGA20ox1基因全长：

设计克隆全长引物，以花生果针cDNA为模板扩增基因的全长。

AhGA20ox1-sal1-Forward：5'-GTCGACATGGCAATAGACTG-3'（SEQ ID NO.7），含有Sal I酶切位点；

AhGA20ox1-pst1-Reverse：5'-CTGCAGTCATCAAATAATCTTATCG-3'（SEQ ID NO.8），含有Pst I酶切位点；

（1）反转录反应：利用花生总RNA为模板，使用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA SynthesisKit反转录试剂盒（TaKaRa Code:6110A），参照说明书，反转录合成花生单链cDNA。

（2）使用Pyrobest^TM DNA Polymerase（TaKaRa Code:R005Q）高保真酶进行PCR扩增：

PCR反应体系如下：

（3）按以下条件进行PCR反应：

置PCR仪上按以下程序进行扩增：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃终延伸10min。

PCR反应结束后，使用加A反应液(购自天根生化科技有限公司，货号RT124)将PCR扩增产物3'端加A，实验步骤参照加A反应液说明书。取20μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物长度约为1125bp，与预期相符合。

（4）DNA片段回收同实施例1步骤1.4。

（5）连接pMD18-T载体同实施例1步骤1.5。

（6）大肠杆菌感受态细胞的制备同实施例1步骤1.6。

（7）转化同实施例1步骤1.7。

（8）质粒的提取同实施例1步骤1.8。

（9）质粒的酶切检测：

用限制性内切酶Sal I、限制性内切酶Pst I双酶切质粒中基因片段两端的酶切位点，酶切体系：

37℃酶切3h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果：pMD18-T-AhGA20ox1酶切出约1125bp的条带，证明pMD18-T-AhGA20ox1构建成功。

（10）序列测定：

以上步骤中获得的阳性克隆pMD18-T-AhGA20ox1测序后，将序列结果进行NCBIBLAST比对，确认序列正确，得到编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述LB液体培养基配方如下：

称取10g胰蛋白胨（Typtone），5g酵母提取物（Yeast extract），5g NaCl，用1M NaOH调pH值约7.0，加双蒸水定容至1000mL，121℃灭菌15min备用。

LB固体培养基为在每升上述LB液体培养基中加入15g的琼脂制得。

实施例2：AhGA20ox1在花生不同组织中的表达模式分析

2.1植物中RNA的提取：

同实施例1中的1.1步骤，分别提取花生幼年茎（15天，JS）、成年茎（40天，AS）、幼年叶片（15天，JL）、成年叶片（40天，AL）、根（JR）、花（F）、未入土的果针（G0），入土3天的果针（G3），入土9天的果针（G9）以及未成熟种子（S）等不同时期不同组织的总RNA。

2.2花生不同组织cDNA的获得：

同实施例1中的1.11步骤（1）。

2.3利用荧光定量PCR技术分析AhGA20ox1基因的表达模式：

以AhActin为体系内参，引物序列为：

AhActinqF:5'-GTCATCGT CATCCTCTTCTC-3'（SEQ ID NO.9），

AhActinqR:5'-CATTCCTGTTCCATTGTCAC-3'（SEQ ID NO.10）

用于AhGA20ox1荧光定量的引物为：

AhGA20ox1qF:5'-TAACCATTCTCCACCAAGAC-3'，（SEQ ID NO.11）

AhGA20ox1qR:5'-TTTGAAAGA GCC ATGAAGGT-3'（SEQ ID NO.12）

荧光定量PCR反应条件为：95℃10min；95℃15s，60℃1min，共进行40个循环。结果显示AhGA20ox1在花生的根、茎、叶、花、果针和种子中均有表达。在幼年根中表达量最高，花中次之，而在幼年叶片、未入土或刚入土3天的果针以及种子中表达量极低，但在果针入土后9天表达量显著升高，说明AhGA20ox1基因在花生荚果发育初期具有重要作用（如图1所示）。

实施例3：植物表达载体pCAMBIA2300-AhGa20ox1的构建（如图2所示）

3.1将测序正确的pMD18-T-AhGA20ox1进行Sal I/Pst I双酶切：

37℃酶切4h，体系全部上样进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳后有两条带，切取1125bp片段，切胶回收，回收步骤同实施例1.4，制得DNA片段3。

3.2分别用同样两种酶双酶切pCAMBIA2300载体（购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心），双酶切体系：

37℃酶切4h，体系全部上样进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳后有一条9.4Kb左右的条带，切胶回收，回收步骤同实施例1.4，得到双酶切的pCAMBIA2300片段。

3.3将两个回收片段用T4连接酶连接，连接体系如下：

将上述i、ii、iii、iv反应物混匀，16℃反应过夜，用于转化大肠杆菌DH5α。

3.4大肠杆菌感受态细胞的制备同实施例1步骤1.6；转化方法同步骤1.7，筛选标记为卡那霉素（Kan，50mg/L）。

3.5质粒的提取同实施例1步骤1.8，制得植物表达载体pCAMBIA2300-AhGa20ox1。

3.6质粒的酶切检测：

（1）双酶切体系同实施例1.11步骤（9）。

（2）37℃酶切2h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果显示有一条1125bp左右的条带和9.4Kb左右的条带，证明植物正义表达载体pCAMBIA2300-AhGa20ox1构建成功。

实施例4：pCAMBIA2300-AhGa20ox1转化农杆菌

4.1农杆菌感受态细胞的制备：

（1）挑取单菌落（农杆菌EHA105）接种到约3ml的LB液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.5。

（2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min。

（3）5000rpm离心30s，弃去上清液。

（4）沉淀用1.5ml0.5M NaCl悬浮，冰浴20min。

（5）5000rpm离心30s，弃去上清液。

（6）每管用100μl20mM CaCl₂悬浮，用于转化，-70℃保存备用，制得农杆菌感受态细胞。

4.2转化农杆菌：

（1）在50μl农杆菌感受态细胞中加入植物表达载体pCAMBIA2300-AhGa20ox10.1-1μg（5-10μl），之后冰浴30min。

（2）放入液氮中1.5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min。

（3）取出离心管，加入0.5ml LB液体培养基，于28℃，220rpm震荡培养3至5h。

（4）取出菌液于含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养2天，菌落可见，制得转化农杆菌。

4.3重组农杆菌鉴定：

（1）从LB平板上挑取单菌落，接种于含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的LB液体培养基中，28℃震荡培养过夜；

（2）PCR反应体系：Taq酶缓冲液（含有Mg²⁺）2.5μl，dNTP(2.5mM)1μl，AhGA20ox1-sal1-Forward引物、AhGA20ox1-pst1-Reverse引物（10μM）各1μl，步骤2制得的菌液2μl，Taq酶（购自TaKaRa公司）0.3μl，加灭菌双蒸水至25μl。

（3）PCR反应程序：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35循环，72℃10min，4℃保存。取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到1125bp左右的条带，证明农杆菌中转入植物表达载体pCAMBIA2300-AhGa20ox1。

实施例5：AhGA20ox1转基因烟草的获得

5.1转基因烟草的获得

（1）取适量SR1烟草种子于1.5ml灭菌EP管中，用体积百分数为75%乙醇消毒1min，无菌水冲洗3-5次。20wt%次氯酸钠对种子消毒5-10min，无菌水冲洗3-5次；

（2）将种子均匀铺洒到1/2MS₀基本培养基上，在25℃的培养室中发芽，获得无菌苗；

（3）挑取转化农杆菌接种到含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL利福平的100mlYEP液体培养基中，28℃培养箱，200rpm振荡培养24h至OD₆₀₀=0.4-0.6；

（4）5000rpm，离心10min收集菌体，将菌体重悬在等体积的MS₀液体培养基中，供侵染使用；

（5）用灭菌的打孔器切取无菌生长的烟草叶片，将叶圆盘浸入菌液中1.5min，取出，无菌滤纸吸干多余菌液，接入不含抗生素的分化培养基（添加6-BA1mg/L和NAA0.1mg/L的MS₀培养基）中，25℃暗培养2d，制得外植体；

（6）将外植体转入选择培养基（添加6-BA1mg/L、NAA0.1mg/L、250mg/L头孢霉素和150mg/L卡那霉素的MS₀培养基）上筛选抗性再生苗，约两周更换一次培养基；

（7）待再生苗长至1cm时切下，转入含250mg/L头孢霉素和150mg/L卡那霉素的1/2MS₀培养基中，诱导生根；

（8）待转基因烟草长至3-4片叶，根系发育良好后，炼苗1d，移入装有培养基质（购自山东商道生物科技有限公司）的花盆中。

上述YEP液体培养基配方如下：

称取10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl，用1M NaOH调pH值约7.0，加双蒸水定容至1000mL，121℃灭菌15min备用。固体培养基加入15g的琼脂。

上述MS₀液体培养基配方如下：

称取4.7g MS干粉（购自北京宜科思源科技有限公司），20g蔗糖，用1M NaOH调pH值约5.8，加双蒸水定容至1000mL，121℃灭菌15min备用。固体培养基加入0.7%的琼脂。

上述1/2MS₀培养基配方如下：

称取2.35g MS干粉（购自北京宜科思源科技有限公司），10g蔗糖，用1M NaOH调pH值约5.8，加双蒸水定容至1000mL，121℃灭菌15min备用。固体培养基加入0.7%的琼脂。

5.2转基因烟草基因组DNA的提取：

（1）在液氮中研磨100mg新鲜或-70℃冷冻的样品材料，放入离心管中。

（2）迅速加入600μl65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴30min，每隔5min轻轻摇动离心管。

（3）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1），混匀，室温放置10min，然后12,000rpm室温离心10min。小心将上清转移到新离心管中，加入等体积酚/氯仿（体积比1:1）重复抽提一次。

（4）吸上清到新1.5mlEp管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀后，在-20℃放置30min沉淀DNA。

（5）在室温条件下，12,000rpm离心10min，弃上清，用体积百分数为70%乙醇冲洗沉淀两次，再用100%乙醇洗沉淀，在超净台上将乙醇吹干后，用50μl蒸馏水溶解DNA，制得烟草DNA。

5.3转基因烟草PCR检测：

（1）利用pCAMBIA2300载体上的筛选标记NPT Ⅱ基因进行PCR鉴定，设计引物：

NPTⅡ-Forward:5'-CTCTGATGCCGCCGTGTT-3'（SEQ ID NO.13）和

NPTⅡ-Reverse:5'-CCC TGATGCTCTTCGTCCA-3'（SEQ ID NO.14）；

（2）PCR反应体系：Taq酶缓冲液（含有Mg²⁺）2.5μl，dNTP（2.5mM）1μl，NPTⅡ-Forward引物、NPTⅡ-Reverse引物（10μM）各1μl，烟草DNA1μl，Taq酶（购自TaKaRa公司）0.3μl，加灭菌双蒸水至25μl。

（3）PCR反应程序：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35循环，72℃10min，4℃保存。取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测（图3），结果PCR扩增得到552bp的片段。

实施例6：获得的转AhGA20ox1基因烟草在移至土中温室培养生长20天，与野生型烟草比较差异明显，主要表现为节间增长、株高增高（图4）。根据以上结果，可以看出AhGA20ox1基因能够通过增加烟草内源赤霉素合成促进烟草节间伸长生长。

Claims

1.一种花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3. 一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因。

4. 一种重组细胞，含有权利要求2所述编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因或者权利要求3所述的重组载体。

5. 权利要求2所述编码花生GA20-氧化酶AhGa20ox1蛋白的基因、权利要求3所述重组载体和/或权利要求4所述重组细胞在改良花生品质中的应用。