CN115161329B - 控制花生荚果大小的主效基因AhP07及开发的分子标记与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制花生荚果大小的主效基因AhP07及开发的分子标记与应用。本发明首先基于基因组重测序技术定位到控制花生荚果大小的主效基因AhP07，发现该基因启动子区域在荚果大小不同的材料间存在3个SNP位点，其中一个SNP位点被成功转化为KASP标记，利用该分子标记对当前国内主要育成品种品系成功进行了基因分型，验证了分子标记的有效性。利用该发明方法能够快速、准确的辅助花生荚果大小的育种目标性状选择，可有效提高花生育种效率和分子育种技术水平。

Description

控制花生荚果大小的主效基因AhP07及开发的分子标记与 应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种控制花生荚果大小的主效基因AhP07及开发的分子标记与应用。

背景技术

花生是重要的经济和油料作物，也是谷物蛋白的优质来源，在世界范围内广泛种植。近年来，随着人们生活水平日益提高，对花生的需求量不断增加，因此，提高花生产量一直是花生育种工作的重要目标。

花生荚果大小是影响花生荚果产量的直接因素，荚果长、荚果宽以及荚果长与宽的乘积是衡量荚果大小的重要性状。花生荚果产量性状遗传机制复杂，受环境影响较大，发掘与育种目标性状相关的分子标记及功能基因，对提升花生分子育种技术水平、指导培育高产优质新品种具有重要的理论指导意义和实践应用价值。

然而，栽培花生(Arachis hypogaea L.)是异源四倍体(2n＝4x＝40，AABB)，是由两个花生区组的二倍体祖先野生种A.duranensis(AA)和A.ipaensis(BB)天然杂交后经自然加倍事件形成的，基因组大小为2.7Gb。由于栽培花生基因组庞大且复杂，且A染色体组和B染色体组间核苷酸序列的同源性较高，因此，花生分子标记的开发和辅助选择育种难以实现广泛应用。

目前，有关于花生荚果大小性状基因的研究仍旧有限，因此发掘花生荚果大小性状相关基因和分子标记对花生高产优质育种意义重大。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种控制花生荚果大小的主效基因AhP07及开发的分子标记与应用。本发明首先基于基因组重测序技术定位到控制花生荚果大小的主效基因AhP07，发现该基因启动子区域在荚果大小不同的材料间存在3个SNP位点，其中一个SNP位点被成功转化为KASP标记，利用该分子标记对当前国内主要育成品种品系成功进行了基因分型，验证了分子标记的有效性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供基因AhP07在调控花生荚果大小中的应用；所述基因AhP07的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，包含上述基因AhP07的重组表达载体、重组菌和/或转基因细胞系在调控花生荚果大小中的应用，也是本发明的保护范围。

本发明的第二方面，提供检测特异SNP的分子标记在鉴定或辅助鉴定花生荚果大小性状中的应用；

所述特异SNP为花生基因组7号染色体上第461129位核苷酸；所述特异SNP为C/T多态。

优选的，所述鉴定或辅助鉴定的花生荚果大小性状包括：荚果长、荚果宽和荚果长宽乘积。

本发明的第三方面，提供检测特异SNP的分子标记在花生育种中的应用；所述特异SNP为花生基因组7号染色体上第461129位核苷酸；所述特异SNP为C/T多态。

本发明的第四方面，提供一种检测特异SNP的KASP分子标记引物组，包括：SEQ IDNO.5所示的第一等位特异引物、SEQ ID NO.6所示的第二等位特异引物和SEQ ID NO.7所示的通用引物。

所述特异SNP为花生基因组7号染色体上第461129位核苷酸；所述特异SNP为C/T多态。

本发明的第五方面，提供上述KASP分子标记引物组在如下(1)或(2)中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定花生荚果大小；

(2)花生育种。

本发明的第六方面，提供一种鉴定或辅助鉴定花生荚果大小的方法，包括以下步骤：

检测待测花生基于特异SNP的基因型；T:T基因型的花生荚果大于C:C基因型的花生荚果；

所述特异SNP为花生基因组7号染色体上第461129位核苷酸；所述特异SNP为C/T多态。

优选的，采用上述KASP分子标记引物组检测待测花生基于特异SNP的基因型。

优选的，检测的PCR反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性10s，61-55℃梯度退火60s，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，26个循环。

本发明的第七方面，提供一种花生育种的方法，包括如下步骤：

在花生苗期检测花生基于特异SNP的基因型；T:T基因型的花生荚果大于C:C基因型的花生荚果；根据育种目标选择相应基因型的花生苗；

所述特异SNP为花生基因组7号染色体上第461129位核苷酸；所述特异SNP为C/T多态。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次发现了一种控制花生荚果大小的主效基因AhP07。

(2)基于发现的主效基因AhP07，本发明在该基因启动子区域筛选出了区分花生荚果大小的SNP位点，该SNP为花生Arahy.07染色体上第461129位核苷酸C→T。

(3)利用该SNP开发出了KASP标记，通过该KASP标记可以对花生荚果大小准确进行基因分型。利用该发明方法能够快速、准确的辅助花生荚果大小的育种目标性状选择，可有效提高花生育种效率和分子育种技术水平。

附图说明

图1：79266和D893的荚果。

图2：采用BSA-seq对花生荚果大小基因的遗传定位。

图3：D893与79266荚果R2-R5时期AhP07基因的表达量比较。

图4：花生AhP07基因PCR扩增产物电泳图。

图5：KASP标记在56个品种品系材料中的基因分型检测。

图6：C:C和T:T基因型品种品系的荚果大小对比。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，有关于花生荚果大小性状基因的研究仍旧有限，在常规育种方法中，荚果大小性状的鉴定要等到花生成熟期，费时费力且选择效率低下。因此发掘花生荚果大小性状相关基因和分子标记对花生高产优质育种意义重大。

影响花生荚果发育的因素有多种，从遗传学角度来看，控制花生荚果大小的主效基因还很少见有报道。

本发明基于基因组重测序技术定位到控制花生荚果大小的主效基因AhP07，发现该基因启动子区域在荚果大小不同的材料间存在3个SNP位点，其中一个SNP位点被成功转化为KASP标记，利用该分子标记对当前国内主要育成品种品系成功进行了基因分型，验证了分子标记的有效性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

其中，本发明中用于基因组重测序的花生栽培品种79266由山东省花生研究所培育，荚果大小变异株系D893由山东农业大学创制(表1，图1)；用于验证KASP标记有效性的品种(品系)由国内多家育种单位提供，山东农业大学花生课题组保存。

表1：多个种植环境下79266与D893的荚果长(mm)、荚果宽(mm)和荚果长宽乘积(mm²)统计

**表示差异达极显著水平(P<0.01)。

本发明在多个环境下统计了花生栽培品种79266和荚果大小变异株系D893两个材料的荚果大小，结果表明：荚果相关性状均表现出极显著差异，可以说明荚果性状可以稳定遗传，受环境影响较小，适合做荚果大小性状的相关基因定位研究。

实施例1：采用BSA-seq技术对控制花生荚果大小基因进行定位

利用栽培品种79266与D893构建杂交组合，获得包括1020个单株的F2群体。对F2群体进行荚果大小相关性状调查，选择30个极端大果和30个极端小果构建2个混池(B-bulk池和S-bulk)。对亲本及两个混池进行基因组重测序，双亲及两个混池测序深度均大于30×。测序数据与已发表的栽培种Tifrunner花生基因组为参考进行比对，筛选亲本间纯合差异SNP位点用于SNP-index分析。以79266作为突变型，计算两个混池在该SNP位点SNP-index及△(SNP-index)。计算方法为SNPindex(a/b)＝Ma/b/(Ma/b+Pa/b)其中：Ma/b表示a/b池来源于79266的深度；Pa/b表示a/b池来源于D893的深度；ΔSNP-index＝SNPindex(a)-SNPindex(b)。两个混池获得的SNP-index及△SNP-index通过2M滑动窗口分析做分布图，并对获得的△SNP-index进行1000次置换检验，选取99％置信区间水平作为筛选阈值，超过阈值线的区域作为荚果性状QTL候选目标区间，将荚果性状相关基因候选区域定位在Arahy.07染色体11016-746246bp区域(图2)。

根据BSA定位的结果在目标区段开发了12个KASP标记，在F₂群体中扩增，利用软件joinmap 4.0，设置LOD＝3.0为阈值，成功构建候选区域遗传连锁图谱。利用软件QTLIciMapping进行QTL分析，LOD阈值为2.50，检测到主效QTL位点，位于312253-461129bp区间，区间长度为148.9kb。提取79266和D893 R2-R5荚果发育时期的总RNA，对区间的注释基因进行基因表达分析，检测到一个基因(基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示)在不同荚果发育时期D893表达量均显著高于79266，将其作为AhP07目标基因(图3)。

实施例2：花生AhP07基因cDNA的克隆测序

1、花生荚果总RNA的提取和cDNA合成：

(1)依据华越洋RNA提取试剂盒的操作说明书提取花生品种79266和荚果大小变异株系D893的荚果组织RNA。

(2)依据Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit操作说明对提取的RNA进行反转录合成cDNA：

在无RNA酶的PCR管中加入1μg的总RNA，和1μl的100μM的oligo(dT)引物，并用DEPC处理过的灭菌水加至体积12μl；将上述混合液于65℃处理5分钟，然后在冰上立即冷却1分钟；再在反应液中依次加入4μl 5X reaction buffer、1μl RiboLock RNase Inhibitor(20U/μl)、2μl 10mM dNTP mix、1μl RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μl)，轻轻混匀，并短暂离心；在PCR仪上42℃孵育1个小时，70℃孵育5分钟后结束反应。

(3)AhP07基因的扩增：

引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，序列如下：

AhP07-F：5’-ATGGCGGAGCTGAAGTTG-3’；(SEQ ID NO.3)

AhP07-R：5’-TTAAAAGACCGTGGCATGG-3’。(SEQ ID NO.4)

PCR扩增体系：总体系50μl，包括PCR-Grade Water：15.0μl，2×PCR Buffer forKOD FX Neo：25.0μl，dNTP Mix(10mM)：1.0μl，KOD FX Neo(1U/μl)：1.0μl，cDNA第一链：5.0μl，primer F(10X)：1.5μl，primer R(10X)：1.5μl。

PCR反应程序：98℃预变性5min；98℃变性30s，55℃梯度退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃后延伸10min。

(4)目的基因片段进行琼脂糖凝胶回收：

经琼脂糖凝胶电泳后产生约1400bp目的条带(图4)，切下目的条带胶块放入干净的离心管中，称取重量；向胶块中加入3倍体积溶胶液，50-55℃水浴放置10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，将吸附柱中残余的漂洗液去除，防止漂洗液中的乙醇影响后续的实验；将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加适量经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min；回收产物-20℃保存。

(5)连接与转化：

使用TaKaRa公司的T4连接酶试剂盒，10μl反应体系：pMD-18Vector：1.0μl，PCR回收产物：7.0μl，T4 Ligase buffer：1.0μl，T4 DNA ligase：1.0μl，4℃连接过夜。从-80℃冰箱中取100μl感受态细胞悬液，冰上解冻；加入连接产物10μl，轻轻弹匀，冰上放置25分钟后；42℃水浴中热击45秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟；向管中加入0.6ml LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

(6)阳性克隆的鉴定与筛选：

用经灭菌的牙签随机挑选24个圆润、单一的白色菌落转入装有300μl氨苄青霉素培养液的EP管中，37℃培养8小时；阳性克隆鉴定50μl PCR反应体系：TaKaRa Taq(5U/μl)：0.28μl，10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)：5.0ul，dNTP Mixture(各2.5mM)：4.0μl，被检测菌液：2.5μl，M13F(20μM)：1.0μl，M13R(20μM)：1.0μl，灭菌蒸馏水：36.25μl。PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性10s，55℃梯度退火30s，68℃延伸1.0min，35个循环；68℃后延伸10min。

根据电泳图检测的DNA条带大小，挑取符合预期大小的克隆，由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。利用DNAMAN软件进行序列比对分析，结果表明：79266和D893的AhP07基因CDS序列一致(SEQ ID NO.1)，全长1398bp；与栽培花生参考基因组DNA序列(SEQID NO.2)(https://www.peanutbase.org/peanut_genome/)比对发现，该基因含有3个外显子和4个内含子。

实施例3：79266和D893的AhP07基因启动子SNP检测和KASP标记开发

(1)AhP07基因启动子SNP检测：

依据天根植物DNA提取试剂盒操作说明提取79266和D893幼嫩叶片的基因组DNA。对提取的DNA进行片段化、纯化和末端修复，经DNA片段大小选择及PCR扩增构建了片段长度为250-350bp的重测序文库，高通量测序在Illumina HiSeq2500平台采用150bp*2双向测序技术进行。测序得到的原始序列进行过滤，去除带接头的reads，N含量大于10％的reads，质量值低于10的碱基超过50％的reads以及低质量的reads，最终得到clean reads。参考花生栽培种Tifrunner花生基因组(https://www.peanutbase.org/peanut_genome/)，使用bwa软件对clean reads进行比对；使用Picard的Mark Duplicate工具去除重复，去除PCR-duplication的影响；使用GATK进行SNP变异检测，在AhP07的启动子区域检测到79266与D893存在3个SNP差异位点，命名为SNP-7-124、SNP-7-125和SNP-7-126(表2)。

表2：AhP07基因启动子序列存在的3个SNP位点

(2)KASP标记评估与开发：

对获得的3个SNP位点进行特异性评估，分别选取每个SNP位点及其上下游各100bp序列，参考栽培种Tifrunner花生基因组进行Blast分析，计算基因组中相似序列个数(标准：同时满足identity>83％和coverage>80％)，选择相似序列个数小于等于2的SNP-7-126进行KASP标记开发。

(3)设计检测KASP标记的PCR引物：

设计两条等位特异引物AhP07-FAM和AhP07-HEX和一条通用引物AhP07-universal来检测C:C(79266)和T:T(D893)基因型。

AhP07-FAM：下划线部分为FAM荧光标签序列

CTAACTCTCAATATTATGATCAAAACAATATATCATCGGCAGCTGCAGTGAC；(SEQ ID NO.5)

AhP07-HEX：下划线部分为HEX荧光标签序列

AACTCTCAATATTATGATCAAAACAATACCATCATCGGCAGCTGCAGTGAT；(SEQ ID NO.6)

AhP07-universal：CCCTACCTCGTATTAAAAGTTTAAGTTGAT。(SEQ ID NO.7)

实施例3：花生荚果大小主效基因AhP07的KASP标记应用

用开发的KASP标记成功对国内多家育种单位培育的包括56个花生品种品系材料进行了基因型鉴定，并验证了标记的有效性。56个花生品种均于2019年5月上旬在山东省泰安市马庄试验基地进行播种，起垄种植，每个品种种植3垄，双粒播种，垄宽110cm，垄距40cm，墩距20cm，行长450cm。田间管理同花生大田栽培。9月初收获，晒干后每个品种选取5个典型荚果进行性状测量。品种之间的种植时间、收获时间、水肥管理等外界管理条件无差异，花生荚果大小的结果分析具有可比较性。

(1)花生叶片基因组DNA提取：

采用传统的CTAB法提取了56个品种品系的叶片基因组DNA，分光光度计测定DNA样品的纯度和浓度，A260/280：1.8-2.2，260/230>＝2.0；将DNA稀释到100ng/μl备用。

(2)KASP标记检测：

KASP检测PCR反应体系：DNA：0.8μl，2×Master mix：0.4μl，引物：0.022μl，H₂O：0.4μl。

KASP检测PCR反应程序：94℃预变性15mins；94℃变性10s，61-55℃梯度退火，每个循环退火温度依次降低0.6℃，10个循环，每个循环60s；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，26个循环。

待PCR反应程序结束后，将PCR产物放置到Omega荧光信号阅读仪和Araya上，将荧光信号转变为可分析的数值，然后用LGC公司提供的分析软件KrakenTM进行基因型分析。

(3)KASP标记分型与花生荚果大小的关联度分析

经KASP标记检测，56个花生品种品系准确分型为C:C(79266)和T:T(D893)两种基因型(图5)。其中有33个材料为C:C基因型，荚果长平均为44.14mm，荚果宽平均为17.76mm，荚果长*荚果宽平均为785.80mm²；23个材料为T:T基因型，荚果长平均为45.54mm，荚果宽平均为19.62mm，荚果长*荚果宽平均为894.87mm²，T:T基因型品种品系的荚果大小显著高于C:C基因型(图6)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 控制花生荚果大小的主效基因AhP07及开发的分子标记与应用

<130> 2021

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> AhP07基因的CDS序列

<400> 1

atggcggagc tgaagttgtc ggagtctcgg gacttgaccc gcatagagcg cataggcgct 60

cactctcaca ttcgaggcct tggtctcgac tcttctctcg agcctcgcgc cgtctccgag 120

ggcatggtcg gccagacctc ggcccgcaag gccgccggcg tcatcctcca gatgatccgc 180

gacggcaaga tcgccggccg cgctgtcctt ctcgcaggcc aacctggaac cgggaagacc 240

gccatagcca tggggatggc caagtccctc ggcctcgaga caccgttcgc catgattgcc 300

ggcagcgagc tcttctccct cgagatgtcg aagaccgagg cgctgacaca ggcgttccgt 360

aaggccattg gtgttcgcat taaggaggag actgaggtca tcgaaggtga ggtcgttgag 420

gtccagattg accgtcctgc cgtcgccggc gccgcctcta agtccggcaa actcactctc 480

aagacgacgg agatggagac cgtttacgac ttgggagcga agatgataga ggcccttggg 540

aaggagaagg tgaccagcgg tgacgtcatt gccattgaca aggcttctgg aaagatcacg 600

aagcttggga ggtcgttttc gaggtctagg gatttcgacg ccatggggcc tcaggtgaag 660

ttcgtgcagt gtcctgatgg ggagttgcag aagcgcaagg aggtcgtgca ttgtgttact 720

cttcatgaga ttgatgttat taatagcaga acgcagggat ttttggctct tttcactggt 780

gatacaggtg aaattcgtgc tgaagtaaga gaacaaattg acaccaaagt agcagagtgg 840

agagaggaag gaaaggcaga gattgtgcct ggtgtccttt tcattgatga ggtgcacatg 900

cttgatattg aatgcttttc cttcctaaat cgagctctgg agaatgagat ggctcctata 960

ttagttgttg ctactaacag aggcattaca aatattagag gcaccaatta caaatcccct 1020

catgggattc ccattgatct gcttgatcgt ctgcttatca tctctactca accttacacg 1080

gaggaagaga ttcgcaaaat tctagatatc agatgccaag aggaagatgt agaaatggct 1140

gaaggtgcga agcagttgtt aaccaaaatt ggggttgaaa catccttgag atatgccatt 1200

catctcatca tagcagctgc attggcatgc caaaagagga aggggaaagt agtggagctg 1260

gaggatataa accgtgttta ccatctattt ttggatgtca aaagatcaac gcagtacttg 1320

atggagtatc agaatcagta catgttcaac gaaacagggg aaggtgaaga cgacgatgtc 1380

catgccacgg tcttttaa 1398

<210> 2

<211> 4319

<212> DNA

<213> 栽培花生参考基因组

<400> 2

actttcatag tctcgtatga taataaggtg gaaccctcaa aagcaagttt aatatgtcat 60

aaatcataat acgtcaactt caaagtcacg attacatgta caaaaatgaa aacatcttag 120

tagttttaga taaatatttt tcaaatacaa aacgttgcag ttagagaaag acgttataat 180

tagaagctag aaacacacag aaccgtggca acttatagga agatgaaagc tgaaagtaaa 240

acaacaaatg tgacaagaga aagtcatcat aattggtgag ttggaaaaac tcatcttaga 300

caagtgtata gtatgctctt acactcataa ttaatctttc agagcaagcc ctttaattta 360

acttgtcaat tattgcaatg tatactaact tatgaatgta tttgtgtata ttgtagccca 420

aattcaattt atcaatcgca tcgtgctgtc gtgggtaaga tcaccattga catcaacctg 480

agatgtggta attatgtgta gagtaattat gttatatttt gttggacaaa acatcttatt 540

cattttttta tcacgatatt ttttaattca ttaggttaag aattaacaat agaattttat 600

ttaagaatct gttattatta ttagttaata gattattgta tatataaaat gcgatttaaa 660

ttatttacac ttatttaaac gaatgaatga gttgattatt tagtcaaatt aaattaattt 720

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acagataaac tgcctgtaac taatatagag ttagtttttc agtttgttgc gttttttgta 1980

gtatgcagta gagagcatta ttagttgtgt gtacttggtt atttgttgtt atggaagttg 2040

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tcttaatcta gctgcattat tgccgcatag gaatttttgt aggcaagact tgtaagaatc 2400

ttgttcagta tgatgcatat tatgtagaac gttcagtgtt cagcctatgt tcttcttgag 2460

gatatcctct attttttctc tttaatgtgt agtttactgc tttcattgtt tgaacaatac 2520

tctgtcagag ccttttagtt agggtgactg taggtgcaac tgctgaggtt taaatggtgt 2580

atggaggggg aatttgaact taacaaggag agatgcatta catggcatat ggttaatgtt 2640

taccggctag catcacgatc attggccatc cttcttccaa cctaggagat gcaagtatat 2700

taaagactat tatcttaatt gggaatggga ttcctttttc tcttccaaat aaaattttaa 2760

attgggcttc cttttttttc tcttttaggt aagtgttcta ttttcttgtt tttcattttc 2820

tatatgttct gtcaatctac ttttaactgg tatgaagttc tgctaaaagg cattgagtat 2880

cgagattttg tgtatcctat gtttggatcc tgtaactcct tggattttga aggaggttct 2940

ctttcaactt gtgacaaagc ttgttacttc tgtagttctt agttattcct aacatttggt 3000

tgtgttatct tattttcaga acgcagggat ttttggctct tttcactggt gatacaggtg 3060

aaattcgtgc tgaagtaaga gaacaaattg acaccaaagt agcagagtgg agagaggaag 3120

gaaaggcaga gattgtgcct ggtgtccttt tcattgatga ggtgcacatg cttgatattg 3180

aatgcttttc cttcctaaat cgagctctgg agaatgagat ggctcctata ttagttgttg 3240

ctactaacag aggcattaca aatattagag gcaccaatta caaatcccct catgggattc 3300

ccattgatct gcttgatcgt ctgcttatca tctctactca accttacacg gaggaagaga 3360

ttcgcaaaat tctagatatc agatgccaag aggaagatgt agaaatggct gaaggtgcga 3420

agcagttgtt aaccaaaatt ggggttgaaa catccttgag atatgccatt catctcatca 3480

tagcagctgc attggcatgc caaaagagga aggggaaagt agtggagctg gaggatataa 3540

accgtgttta ccatctattt ttggatgtca aaagatcaac gcagtacttg atggagtatc 3600

agaatcagta catgttcaac gaaacagggg aaggtgaaga cgacgatgtc catgccacgg 3660

tcttttaaaa aacttgaatt ctagtttgga tggatttgta attatgtgag caagtctcta 3720

attattaggt tgcagtagca atattttttt ctttcttgtt ttaaaggacg ttgtgtttgt 3780

ttgatattgg gatttactag cagtttttct tggttgaact gaaatatctt catcctccat 3840

atgatgctgc tgtatctgta tgtaatttta ttacttggtg aaatgcttaa tcatttgatc 3900

tgaccatgtt agaaagttta ggttttacca ctttcaacag tcaacacggc atcaatgaac 3960

gaagaaaatt atcctcacaa tcctttaaaa ttacgtggca ttggcaaatt ggggctattg 4020

agtcgcgtaa caagaagaca aatttggttg cgtgctcatt ctttccccca attatatgct 4080

tccaagctac attctccaga ccctactatt tgtcttcggc cttactctgt aacaacgttg 4140

taaacatgct ttctattttt tattttttac cttttttatt aatttaatct tttcgaaatg 4200

gtacttgttt acttaagctt taaacacaac tctaggttgg cacttccata cgaactaatt 4260

tatctaattt aatattaact ttgttatgaa taattttttt tccctaccac cttggcatg 4319

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcggagc tgaagttg 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaaaagacc gtggcatgg 19

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctaactctca atattatgat caaaacaata tatcatcggc agctgcagtg ac 52

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aactctcaat attatgatca aaacaatacc atcatcggca gctgcagtga t 51

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccctacctcg tattaaaagt ttaagttgat 30

Claims (5)

1.基因AhP07在调控花生荚果大小中的应用；所述基因AhP07的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

2.包含基因AhP07的重组表达载体、重组菌和/或转基因细胞系在调控花生荚果大小中的应用；所述基因AhP07的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

3.检测特异SNP的KASP分子标记引物组在如下（1）或（2）中的应用：

（1）鉴定或辅助鉴定花生荚果大小；

（2）花生育种；

所述检测特异SNP的KASP分子标记引物组包括：SEQ ID NO.5所示的第一等位特异引物、SEQ ID NO.6所示的第二等位特异引物和SEQ ID NO.7所示的通用引物；

所述特异SNP为花生基因组7号染色体上第461129位核苷酸；所述特异SNP为C/T多态。

4.一种鉴定或辅助鉴定花生荚果大小的方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用权利要求3所述的KASP分子标记引物组检测待测花生基于特异SNP的基因型，检测的PCR反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性10s，61-55℃梯度退火60s，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，26个循环；

T:T基因型的花生荚果大于C:C基因型的花生荚果；

所述特异SNP为花生基因组7号染色体上第461129位核苷酸；所述特异SNP为C/T多态。

5.一种花生育种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用权利要求3所述的KASP分子标记引物组在花生苗期检测花生基于特异SNP的基因型，检测的PCR反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性10s，61-55℃梯度退火60s，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，26个循环；

T:T基因型的花生荚果大于C:C基因型的花生荚果；根据育种目标选择相应基因型的花生苗；

所述特异SNP为花生基因组7号染色体上第461129位核苷酸；所述特异SNP为C/T多态。

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