CN118222583A

CN118222583A - 一种抗根肿病基因BjuVA03G52300及其应用

Info

Publication number: CN118222583A
Application number: CN202410350809.0A
Authority: CN
Inventors: 李可琪; 黄镇; 顿小玲; 徐爱遐; 于澄宇; 王凯; 石益基
Original assignee: Northwest A&F University; Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Northwest A&F University; Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2024-03-26
Filing date: 2024-03-26
Publication date: 2024-06-21

Abstract

本发明属于基因筛选及其应用技术领域，具体涉及一种抗根肿病基因BjuVA03G52300及其应用，抗根肿病基因BjuVA03G52300的核苷酸序列为SEQ ID No.1；用于鉴定抗根肿病基因BjuVA03G52300的引物包括基因克隆引物以及基因重组序列。本发明通过简化基因组测序对由CT19与感病黄芥构建的F₂群体进行分析，发现BjuVA03G52300对根肿病的抗性显著，从而拓宽根肿病抗性基因库，为抗根肿病油菜育种提供理论指导。

Description

一种抗根肿病基因BjuVA03G52300及其应用

技术领域

本发明属于基因筛选及其应用技术领域，具体涉及一种抗根肿病基因BjuVA03G52300及其应用。

背景技术

根肿病是由芸薹属根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起的一种世界性土传病害，是对十字花科作物如油菜、白菜、甘蓝等最具破坏性的病害之一。根肿菌主要危害植物的根部，植物被侵染后，主根、侧根和须根上逐渐长出大小不等的肿瘤，感染后期肿瘤龟裂而且粗糙，易被其他杂菌侵入而引起腐烂，严重影响植物对水分和养分的正常吸收。由于根肿病传染性强、传播速度快、传播途径多、生物和化学防治的效果不佳，以及缺乏具有广谱抗原的植物，使根肿病成为世界范围内的毁灭性土传植物病害。

目前主要在蔬菜中发现一些抗根肿病的基因/位点，如欧洲芜菁/白菜、甘蓝、黑芥、萝卜等，而在甘蓝型油菜中发现的抗源较少。基于现有研究，至少有28个与根肿病抗性相关的QTL被定位到白菜的A01、A02、A03、A06和A08这5条染色体上(Ueno等，2012；Kato等，2012；Chen等，2013；Sakamoto等，2008；Pang等，2018；Suwabe等，2003；Hirai等，2004；Nguyen等，2018；Laila等，2019；Chen等，2013；Zhu等，2019；Cui等，2020；Chu等，2014)；Huang等，2017；Yu等，2017；Karim等，2020))，其中12个抗性QTL(Crr3、Rcr1、Rcr2、Rcr4、Rcr5、PbBa3.1、CRk、CRd、CRb、CRa、CRaki、PbBp3.3)位于A03染色体上，并且这些位点之间相互连锁，说明来源于白菜的抗根肿病位点比较单一；而甘蓝型油菜中的根肿病抗性主要来源于白菜。

现阶段，针对某一地区种植单一抗病品种或种植只有单一抗性的品种，随着根肿菌的变异，抗病基因可能会失效；加拿大早期育成的抗病品种由于抗病位点和种植品种的单一，已经丧失了抗病性，而且进化出的根肿菌毒性更强(Askarian等，2021)。

可见，抗根肿病甘蓝型油菜种质或品种的抗性来源较为单一，导致其抗病性比较单一，不能达到广谱抗性，无法满足实际需求。

发明内容

针对甘蓝型油菜中抗根肿病的品种较少以及无法满足国内需求的技术问题，本发明提供一种抗根肿病基因BjuVA03G52300及其应用。

本发明通过简化基因组测序对由CT19与感病黄芥构建的F₂群体进行分析，发现BjuVA03G52300对根肿病的抗性显著，从而拓宽根肿病抗性基因库，为抗根肿病油菜育种提供理论指导。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种抗根肿病基因BjuVA03G52300，抗根肿病基因BjuVA03G52300的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

一种用于鉴定抗根肿病基因BjuVA03G52300的引物，所述引物包括基因克隆引物以及基因重组序列；

所述基因克隆引物包括：BjuVA03G52300-F和BjuVA03G52300-R，

BjuVA03G52300-F序列为SEQ ID No.2；BjuVA03G52300-R序列为SEQ IDNo.3

所述基因重组序列包括BjuVA03G52300-2F和BjuVA03G52300-2R；

BjuVA03G52300-2F序列为SEQ ID No.4；BjuVA03G52300-2R序列为SEQ IDNo.5。

一种抗根肿病基因BjuVA03G52300的鉴定方法，包括以下步骤：

S1、以待鉴定基因组DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

S2、根据所述PCR产物来鉴定抗感品系。

进一步限定，所述引物为基因克隆引物时，PCR扩增的反应体系为：

2×Phanta Max Buffer：体积25μL；dNTP Mix：体积1μL；正反向引物体积各2μL；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase：体积1μL；模板DNA：浓度50ng/μL～100ng/μL、体积1μL；ddH₂O：体积18μL。

进一步限定，所述引物为基因重组引物时，PCR扩增的反应体系为：2×Phanta MaxBuffer：体积25μL，dNTP Mix：体积1μL，正反向引物体积各1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase：体积1μL，模板cDNA：体积1μL，ddH₂O：体积18μL。

进一步限定，所述PCR扩增的反应程序为：预变性95℃、3min，变性95℃、15s，退火15s，延伸72℃、30-60sec/kb，彻底延伸72℃、5min，从变性到延伸35个循环。

如所述的抗根肿病基因BjuVA03G52300在调控十字花科植物抗根肿病性能中的应用。

进一步限定，所述抗根肿病基因BjuVA03G52300正调控对根肿病的抗性。

如所述的抗根肿病基因BjuVA03G52300在十字花科植物抗根肿病育种中的应用。

进一步限定，所述十字花科植物为油菜、拟南芥、白菜或甘蓝。

与传统技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明通过对抗根肿病芥菜型油菜CT19与感病芥菜杂交构建的F₂群体进行重测序分析，结合表型，在A03染色体的25.09Mb-25.54Mb区段鉴定到1个抗根肿病的主效QTL(qCRa3-1)，用基因BjuVA03G52300编码非典型的TIR-NBS-LRR蛋白，过表达该BjuVA03G52300基因可以显著增强根肿病抗性，从而拓宽根肿病抗性基因库，满足实际需求，为抗根肿病十字花科植物的育种提供理论指导。

2、本发明采用基因克隆引物以及基因重组序列对待鉴定抗根肿病基因组DNA为模板进行PCR扩增，从而实现对抗根肿病基因BjuVA03G52300的鉴定，具有较强的特异性和选择性，从而提高测序结果的可靠性和稳定性。

3、本发明通过在十字花科植物中过表达BjuVA03G52300，将挖掘出的抗根肿病基因转化到十字花科植物中，培育出具有抗根肿病的植物新品种，从而提高十字花科植物对根肿病的抗性，在植物育种中具有较好的应用。

附图说明

图1为根肿病抗性基因在各染色体上的分布；

图2为表达量图；

图3为BjuVA03G52300同源基因在抗感材料中的序列分析；

图4为过表达BjuVA03G52300的拟南芥的根肿病抗性；

图5为BjuVA03G52300在甘蓝型油菜中抗根肿病的结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，实施例中未作详细描述的技术手段属于本领域专业技术人员熟知的常规技术。实施例只用于说明本发明，但不限制本发明的范围，任何本领域的技术人员在不付出创造性劳动的情况下，以本发明的实施例为基础所获得的其他实施例均属于本发明的保护范围。

本发明来自科技创新2030—重大项目，抗病虫新基因挖掘与育种价值评价(2023ZD04070)的研发成果。

实施例

一、CT19与感病黄芥构建的F₂群体

本实施例中，黄芥选用陕北黄芥。

通过远缘杂交将抗根肿病白菜与抗病黑芥杂交，经过胚胎拯救和秋水仙素加倍合成了高世代的抗根肿病芥菜型油菜CT19，从CT19中挖掘出抗根肿病基因。本步骤中，抗根肿病芥菜型油菜CT19的合成属于现有技术。

F2群体构建方法：将抗根肿病芥菜型油菜CT19与感病芥菜型油菜黄芥杂交获得杂交一代F₁代植株，然后进一步自交获得F₂代群体。并利用DNA提取试剂盒提取172份F₂代单株的叶片DNA。

二、简化基因组测序及数据分析

2.1、简化基因组测序

简化基因组测序主要包括DNA样品检测、文库构建、文库质控和上机测序四个步骤。

(1)DNA样品检测

对提取的F₂代单株的DNA进行检测。方法如下：利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带完整无降解且无RNA污染；OD260/280值在1.8～2.0之间；DNA浓度大于50ng/μL，总量不低于2μg。

(2)文库构建

利用限制性内切酶MseⅠ和SacⅠ对检测合格的总量为200ng的基因组DNA进行酶切，将其切割成片段，随后利用特异性的接头连接酶切后的片段并对其进行纯化，纯化后的产物在DNA聚合酶的作用下进行扩增，将所有的产物利用Bio-Rad Certified MegabaseAgarose低压过夜电泳，对其中300bp～400bp的片段进行胶回收纯化即为所得的文库。

(3)文库质控

利用Agilent 2100对insert size进行检测，确保其无接头污染；利用实时荧光定量PCR保证有效浓度＞2nmol/L。

(4)上机测序

用Illumina HiSeq平台进行Paired-end 150bp(PE150)测序，获取测序结果。

2.2数据分析

将上述2.1中得到的简化基因组测序数据分析通过生物信息学的手段进行分析，方法如下：

(1)测序数据质控与统计

利用fastp软件对上机得到的原始数据(Raw Data)进行质控，去除reads中的接头、低质量碱基和小于50bp的reads。随后对测序数据碱基质量数分布和GC含量进行统计，确保测序数据的质量能用于后续分析。

(2)测序数据的生物信息学分析

首先是比对参考基因组，利用BWA(Burrow-Wheeler Aligner，version0.7.15-r1140)软件的MEM算法将质控后的数据比对到芥菜型油菜参考基因组(Braju_tum_V2.0，http://brassicadb.cn/#/Download/)上，随后利用samtools(version 1.3.1)将上一步得到的sam文件转换成bam文件并对其进行排序。最终得到的排序后的bam文件用于测序覆盖度和覆盖深度及变异统计。

基因组覆盖度(Coverage)：测序得到的数据在参考基因组上覆盖的碱基占整个参考基因组的比例，覆盖度越高，可检测到的变异越多。

覆盖深度(Depth)：参考基因组上的每个碱基被覆盖的次数，一般用reads数计量，深度越高，变异位点的准确性越高。

变异检测利用GETK软件(Genome Analysis ToolKit，version 3.7)的HaplotypeCaller模块和GenotypeGVCFs模块，结果包括SNP和InDel。

随后通过ANNOVAR软件(version 2016Feb1)对检测到的变异进行注释并预测其对基因功能的影响。

(3)遗传连锁图谱的构建

首先，根据子代标记之间的连锁关系推断亲本的基因型，再以此为依据将子代的基因型命名为A(CT19)和B(陕北黄芥)；继而根据抗感亲本的实际基因型验证亲本的真实性；随后利用隐马尔可夫模型(HMM)部分一些基因型进行修正补齐；最后利用MSTMap软件评估标记之间的重组率，使用Kosambi计算标记之间的遗传图距。

(4)进一步进行QTL分析。

三、基因测定

利用引物鉴定位于A03染色体上的根肿病抗性QTL。

3.1、基因组DNA的提取

1)取拇指大小的新鲜幼嫩芥菜型油菜CT19和陕北黄芥的叶片，液氮中充分研磨成粉末。

2)将粉末移入2ml离心管中，加入500μL、65℃预热的CTAB溶液，充分混匀，65℃水浴1h，中间十分钟左右摇晃混匀一次。

3)水浴结束后加入500μL氯仿/异戊醇溶液(体积比为24:1)，轻微混匀后室温静置10min；10000r/min下离心10min。

4)取上清液加入等体积的异丙醇静置直到有沉淀生成，10000r/min下离心10min。

5)弃上清液后，用70％的乙醇漂洗沉淀两次到三次，后将离心管倒置自然风干，加入适量的ddH₂O(超纯水)溶解后存放在-20℃冰箱。

3.2、基因克隆

基因克隆的目的是考察基因的序列在亲本之间是否有差异，然后确定候选基因为关键候选基因。

通过对候选基因(候选基因指的是在QTL分析，检测到显著关联的QTL之后，QTL区间的候选基因)的序列进行分析，利用Primer Premier 5.0设计分数较高的能够涵盖基因全长的正反向引物(参见表1)，利用高保真酶(诺唯赞，P505)以基因DNA为模板对其进行扩增。

PCR扩增反应体系为：2×Phanta Max Buffer(含有Mg²⁺，终浓度为2mmol/L)：体积25μL；dNTP Mix(10mmol/L each)：体积1μL，正反向引物体积各2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase：体积1μL，模板DNA(浓度50ng/μL～100ng/μL)：体积1μL；ddH₂O(超纯水)：体积18μL。

PCR扩增反应程序：预变性95℃3min，变性95℃15s，退火15s，延伸72℃30-60sec/kb，彻底延伸72℃5min，从变性到延伸35个循环。

表1基因克隆的扩增引物

引物Primer	序列Sequence
		BjuVA03G52300-F	ATGGTCGAAACAATTGCCAGT
BjuVA03G52300-R	TTAACACGAGGGAGCCAAGGT

对反应结束的产物利用琼脂糖凝胶电泳的方式确定目标条带，随后切下目标条带利用胶回收试剂盒(Omega，D2500-01)进行纯化回收。

具体操作流程为：在胶块中加入Binding Buffer(1g/mL)，置于60℃水浴锅中，待胶块完全溶解后转移液体至HiBindTM DNA柱子，室温10000×g离心1min；弃掉收集管中废液，再加入300μL Binding BufferHiBind，室温10000×g离心1min；弃掉废液后加入700μLSPW Wash bufferHiBind DNA柱子中，室温10000×g离心1min，重复两次；弃掉废液室温10000×g空转离心1min；将柱子装入新的1.5mL离心管中，加入50μL洗脱液静置2min，10000×g离心1min。对上述纯化后产物进行TA克隆，利用热激法将其转化到大肠杆菌感受态细胞中：在冰上将TA克隆产物加入到大肠杆菌感受态中，静置30min后42℃水浴60s，再置于冰上2min，加入500μL无抗LB液体培养基37℃摇床复苏40min，随后移液枪吸取200μL菌体均匀的涂在加有卡那抗生素的LB固体培养基中，37℃过夜培养，挑取长出来的单克隆置于加入卡那抗生素的液体培养基中37℃摇床培养4h～5h，对菌液进行菌液PCR鉴定阳性单克隆，将阳性单克隆送西安擎科公司进行一代测序即可得到目标基因的序列。

测序后的基因序列如下：

>BjuVA03G52300ATGGTCGAAACAATTGCCAGTGACGTTTCAAATGAGCTCTTTAATTTTGTGCCATCAAGGGATTTCGAAGTTTTTGTTGG

CATGAGAGCTCATATGATAAATCTGAAACCGTTGTTGCTCCTAGGCACCAATGAAGTGAGGATGAAAGGGATTTGGGGTC

CTTCTGGAATTGGTAAGAGCACCATCGCCAGAGTTCTATTTAACCAACACTCTCATCAGTTCCCGTTTAGTGTCTTCATG

GAGAAAATTAAAAGACGTTATCGGGGACCTTATATCGATACGTACAGTGCACAAATTCAATTACAGGAAGAGTTCCTGTC

CAAACTAATCAACCAAAAAGATATCAAGATTCATCGTTTAGAAGTTGTGCAAGACAGGTTAAAAGGCAAGAAAGTGCTTG

TGGTTCTTGATGACGTGGACCATTTGTTGCAACTAGAAGCCGTGGCGGAAAAAGCTCAGTGGTATGCTTTTGGTCAAAAG

TATCCACCTGATGGCTTCAAAGAACTTGCCTGGGAGGTTACAAAACTTGCTGGTAAGCTCCCTTTGGGACTGAGGGTTAT

GGGATCTCATTTCAAAGGAAGGCCCAAGCAGGAGTGGCAAGAGGAACTACCAAGGTTAAGAAGTAGACTTGATGGAGAAA

TAGAAAGTACTTTAAAGTTCAGTTATGATGCCTTATGCGATGACAATCAAGCTATATTTCTTCACTTAGCATGCTTTCTC

AAAGACGAATTGCCGGAAACTGTGGAAAGGTGTCTTGAAAAGAATTTTGTTGGTGTGAAAGGTTGTCTTCGTGTTTTAGC

TGAGAAATCTTTCATATACTTCGAGTGGGGACGTATACAGATGCATGATTTGCTAGCACTTTTGGGTAGAGAAATTGTTC

GTAAAAAATCCATTCATGAACCTGGGCAGCGCCAGTTTTTGGTTGATGCTGGAGATATATGCCAAGTACTACGTGATGGT

ACACTAGGTAGTCGAAATGTTATAGGCATAGATTCAAAGTTGTTGGAGACGGGGTTGAAGATAAGTGACAGAGTTTTTAA

AAGAATGCCCAATGTCCAATTCTTAAGAGTGAAATATCACAGTAAGCCATATCCTCACAGCATAGATCCCGTGACATGTC

TGCCCTCAAATCTAAGAATTTTGGATTGGGATTCTTTTCCGATGACATGCCTGCCTTCTAATTTTAATCCGGAGTTCCTG

GTGGAAATAATCTTGACTAAAAGCAACTTCCTTGAGAAATTGTGGGAAGGAAATAAAACGATTTAGAAATCTGAAATTGA

TGAATTTGTCGAACTCCAAAAATCTAAAGGAGCTTCCCGATCTCTCAACTGCCACTAATCTGCAAAGCTTGGATCTTTCT

GGTTGCTCAAGTCTAACTGAGCTCCCCTCTTCTATGGAAAATGTCACTACTCTCGAGGAATTGTATCTCACGAGCTGCTC

ACATCTAGCTAAGCTCCCCTCTTCTTTTCTTCTATCTTGTCTTATATATTCCGAAATGGAAAGTTACGACGAGGTATTGT

CTCTTTATGGATGCTCAAGTCTACGGGAGCTACCTTCTTCTATTGGGAATATGACTAGGCTTCAAAAGTTCGATCTTGAT

GGATGCTCAAGTCTTGTAGAGCTCCCCTCTTCCATTGGGGATTTAATCAGACTGAAGACGTTGAATCTTAATGGATGTTC

AAGTCTTGTGATGCTCCCCTCTTCCATTGGGAATATGAATAATCTCAGGAAGTTGTATCTCAAAAGATGCTCAAAGCTAA

AGGCCCTTCCGATCAACATCAACATGAAATCTCTTGATGAGGTTGATCTCACTGACTGCTCGTCATTGAAAAGTTTTCCC

GAGATTTCCACAAACATCAGCGTTCTAGAGCTCACTAGAACTTCAATAGAAGAATTACCTCGATCAATAATGTCATGGCC

TCGTCTTCGTTGGTTATACTTGAGCGAGACAAGAATACAAGAAATTGCTCCATGGATCAAGGAAATGTCTCATCTAAGTC

GACTTGTAATCAAGGGGTGCACGAAGCTGGTTTCTCTTCCACAGCTTCCGGACTCCTTAAAATCCCTAGTCGCAGACAGT

TGTGAGTCCCTCGAGAGACTGGATTGCTCTTTCTACAAGACAAAGTTAGAAGAGCTCAGCTTTATCAACTGCTTTAAACT

GAATCAAGAAGCAAGAGACCTTATCATCAAGACATCGACAAGAGACCTGGCAGTTTTTCCCGGAGAATCAGTGCCTGCAT

ATTTCACGTACCGAGCCACCGGGAGTGCCCTGTCATTGACGTGGAATGGATTAGATACACAGTATTTTCCTACATCCTTG

AGATTTAAAGCTTGCCTCTTACTAGTTTATAAAGGTGACGTTGTTGCTGATGATTGGGTCTTGGCTAAAATATCTTATTG

CATCAAGGACAAACTCAATGGTGTTAAACCAGCTGGTTATTCTTCTCAAAGACGTGTCAAATTGCCTCGAACTTCAGGGG

AGCATCTGTTCGTATTCAAAATTGAAGAAACTGTGAGTGCTCCCGAGTTAGTCTTTGAGTTCGAATACACGGAAAACAAT

TGGGAGATTACAGAATGCGGGCTACATCCTCTGGAAACCTTGGCTCCCTCGTGTTAA

3.3过表达载体构建

过表达载体构建的目的是，将上述克隆出的基因进行重组，进而分析鉴定出BjuVA03G52300对根肿病的抗性。

(1)、引物设计

首先根据载体序列设计同源臂序列，以抗根肿病CT19的cDNA为模板，用引物BjuVA03G52300-2F/R对目标基因进行PCR。引物如表2所示。

表2PCR扩增引物

(2)、PCR扩增

PCR扩增反应体系为：2×Phanta Max Buffer(含有Mg²⁺，终浓度为2mmol/L)：体积25μL；dNTP Mix(10mmol/L each)：体积1μL，正反向引物体积各1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase：体积1μL，模板cDNA：体积1μL；ddH₂O：体积18μL。

对反应结束的产物利用琼脂糖凝胶电泳的方式确定目标条带，随后切下目标条带利用胶回收试剂盒(Omega，D2500-01)进行纯化回收，大概流程为：在胶块中加入BindingBuffer(1g/mL)，置于60℃水浴锅中，待胶块完全溶解后转移液体至HiBindTM DNA柱子，室温10000×g离心1min；弃掉收集管中废液，再加入300μLBinding BufferHiBind，室温10000×g离心1min；弃掉废液后加入700μL的SPW Wash bufferHiBind DNA柱子中，室温10000×g离心1min，重复两次；弃掉废液室温10000×g空转离心1min；将柱子装入新的1.5mL离心管中，加入50μL洗脱液静置2min，10000×g离心1min。

同时对含有2*CaMV 35S启动子的过表达载体1300-Dsred利用限制性内切酶BglII和XbaI进行酶切，使载体线性化，对酶切彻底的载体进行琼脂糖凝胶电泳回收后，利用一步克隆法同源重组试剂盒将目标基因序列与线性化载体进行同源重组，得到带有目标基因的载体。

本实施例中，过表达载体1300-Dsred还可替换成pMDC43和pMDC83。

同源重组(南京诺唯赞，C112-01/02)反应体系(一共10μL)：5XCEⅡ2μL，ExnaseⅡ1μL，线性化载体和插入的目的基因摩尔比为1:2。反应完成后的产物转化到大肠杆菌DH5α中，具体：转化大肠杆菌DH5α感受态，具体方法如下：取出50μL感受态于冰上融化；加入5μL的连接产物，敲打混匀，在冰上静置半小时；42℃水浴1min，迅速拿出放在冰上，静置2min；向管内加入不含抗生素的LB液体培养基700μL，37℃，200r/min摇床振荡培养60min～90min。吸取100μL，涂布在含有卡纳抗性(Kan，100mg/mL)抗性的LB培养基上，过夜培养，第2天挑选单克隆进行PCR阳性鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测后选择有条带的阳性单克隆送至公司测序。对测序正确的单克隆摇菌。

(3)、质粒提取和农杆菌转化

将上述得到的阳性重组载体的单克隆菌液进行质粒提取，方便长期保存。质粒提取采用是的质粒提取试剂盒(天根，DP103)，首先是对37℃过夜培养的菌液进行富集，接着分别加入Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3将菌体进行重悬、裂解和沉淀，第一步需要重悬彻底，后面两步需要轻微混匀，将得到的液体转移至吸附柱中，10000r/min离心1min，弃上清液加入500μL去蛋白液PD，在10000r/min下离心1min，弃上清液后加入700μL漂洗液，在10000r/min离心1min，重复漂洗两次，弃上清液，空转10000r/min离心2min，在吸附柱中加入50μL的ddH₂O静置2min后，收集管换成新的1.5mL离心管，10000r/min下离心1min，离心管中为所提质粒。

农杆菌转化采用的是冻融法，基本步骤为：将不大于1μg的质粒加入到农杆菌感受态细胞GV3101菌株中，冰上静置5min，液氮速冻5min，37℃水浴5min，冰上静置2min，加入500μL无抗YEP液体培养基中，28℃复苏2h～3h；吸取200μL均匀的涂在加有利福平、庆大和卡那抗性的YEP固体培养基中。两天后挑取单克隆对其进行菌液PCR鉴定，向鉴定为阳性的农杆菌中加入50％的甘油(v:v，2:1)，混匀后于-80℃冰箱保存备用。

(4)、农杆菌介导的拟南芥转化

将阳性的农杆菌在28℃摇床中过夜培养至菌液OD值介于0.8～1.2之间，5000×g离心5min富集菌液，再用5％的蔗糖溶液重悬，加入万分之二到万分之五的表面活性剂(selwet-77)，利用枪头吸取菌液打到拟南芥未开的花上，静置几分钟后擦干菌液对其进行16h～24h暗培养，20天～30天后即可得到阳性种子。

首先将待检测材料种子置于在湿润的滤纸上进行萌发，三四天后挑选长势几乎一致的幼苗移栽到营养土(基质：珍珠岩：蛭石，3:1:1)中，待幼苗生长到三叶期，利用注射器在植物根基部区域注射5mL浓度为1×10⁷孢子/mL根肿菌。接种根肿菌后40天即可观察根部根肿是否形成判断抗感表型。

根肿菌孢子悬浮液制备：首先取发病的根肿置于水中浸泡过夜，随后将根肿用刀片切成小块置于磨样机中打碎，利用八层纱布对完全破碎的样品过滤，去除植物组织；对过滤后的液体进行离心弃上清，沉淀即根肿菌的休眠孢子；根据根肿的大小先加入适量的水进行重悬，利用血球计数板对重悬的孢子溶液进行浓度检测，最后加水稀释到1×10⁷孢子/mL的浓度。

正常接种根肿菌试验为2mL浓度为1×10⁷孢子/ml根肿菌。使用0-4评分系统计算病情指数：0-无症状；1-主要在侧根上的小根瘤；2-主根和侧根上有小的根瘤；3-中等大小的根瘤，可能对植物生长产生负面影响；4-主根和侧根都有严重根瘤，根变形，生长受损。

DI＝100×(1N1+2N2+3N3+4N4)/4Nt。

公式中：DI为发病指数，N1、N2、N3、N4分别指的是不同等级的发病植株数目，Nt指的是植株的总数目。

每个处理或品系包含至少40株植物，数据在Excel 2019中使用t检验进行分析(*p<0.05；**p<0.01)。

综上所述，参见图1，本实施例中，通过简化基因组测序对由CT19与感病黄芥构建的F₂群体进行分析，结合表型，在A03染色体的25.09Mb～25.54Mb区段鉴定到1个抗根肿病的主效QTL(qCRa3-1)，可解释的表型贡献率为74.30％。

参见图2，根据基因组功能注释，qCRa3-1区间内共有66个候选基因；结合转录组分析，发现有22个基因在根肿菌侵染后基因表达量发生显著变化，其中1个具有TIR-NBS-LRR结构域的基因BjuVA03G52300在抗病材料CT19中的表达量显著高于陕北黄芥；并且该基因在CT19和陕北黄芥中有一个碱基的差异，导致编码的氨基酸差异(图3)。BjuVA03G52300+是抗病亲本CT19及抗病白菜中共同特有的序列；BjuVA03G52300-在感病材料及感病白菜中都存在。

参见图4，将抗病亲本中BjuVA03G52300的CDS序列构建到2*35S过表达载体上，侵染野生型拟南芥；发现异源过表达BjuVA03G52300的拟南芥株系(BjuVA03G52300-OE)对根肿病的抗性显著高于野生型拟南芥(WT)；表明BjuVA03G52300正调控对根肿病的抗性。

参见图5，本发明通过采用农杆菌介导的下胚轴转化法将BjuVA03G52300基因转化在甘蓝型油菜中，发现异源过表达BjuVA03G52300的甘蓝型油菜株系((BjuVA03G52300-OE))，对根肿病的抗性显著高于野生的甘蓝型油菜(WT)。

综上可见，本发明挖掘出的抗根肿病基因BjuVA03G52300对十字花科植物的根肿病具有调控作用，因此将基因BjuVA03G52300转化到油菜、拟南芥、白菜或甘蓝等十字花科植物中，培育出具有抗根肿病的植物新品种，在提高十字花科植物对根肿病的抗性中具有广泛的应用前景。

以上为本发明较佳的具体实施方式，然而本发明保护的技术方案并不限于此，本领域技术人员在本发明技术方案基础上所作的任何等同替换或是修饰，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗根肿病基因BjuVA03G52300，其特征在于，所述抗根肿病基因BjuVA03G52300的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

2.一种用于鉴定抗根肿病基因BjuVA03G52300的引物，其特征在于，所述引物包括基因克隆引物以及基因重组序列，

所述基因克隆引物包括：BjuVA03G52300-F和BjuVA03G52300-R，

BjuVA03G52300-F序列为SEQ ID No.2；BjuVA03G52300-R序列为SEQ ID No.3；

所述基因重组序列包括BjuVA03G52300-2F和BjuVA03G52300-2R；

BjuVA03G52300-2F序列为SEQ ID No.4；BjuVA03G52300-2R序列为SEQ ID No.5。

3.如权利要求1所述的抗根肿病基因BjuVA03G52300的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括以下步骤：

S1、以待鉴定基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

S2、根据所述PCR产物来鉴定抗感品系，完成鉴定。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物为基因克隆引物时，PCR扩增的反应体系为：

2×Phanta Max Buffer：体积25μL；dNTP Mix：体积1μL；正反向引物体积各2μL；PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase：体积1μL；模板DNA：浓度50ng/μL～100ng/μL、体积1μL；ddH₂O：体积18μL。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物为基因重组引物时，PCR扩增的反应体系为：2×Phanta Max Buffer：体积25μL，dNTP Mix：体积1μL，正反向引物体积各1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase：体积1μL，模板cDNA：体积1μL，ddH₂O：体积18μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：预变性95℃、3min，变性95℃、15s，退火15s，延伸72℃、30-60sec/kb，彻底延伸72℃、5min，从变性到延伸35个循环。

7.如权利要求1所述的抗根肿病基因BjuVA03G52300在调控十字花科植物抗根肿病性能中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗根肿病基因BjuVA03G52300正调控对根肿病的抗性。

9.如权利要求1所述的抗根肿病基因BjuVA03G52300在十字花科植物抗根肿病育种中的应用。

10.根据权利要求7或9所述的应用，其特征在于，所述十字花科植物为油菜、拟南芥、白菜或甘蓝。