CN115960952B - 过表达玉米ZmHB53基因的表达载体和构建方法及其在提高植物耐旱性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，提供了过表达玉米ZmHB53基因的表达载体和构建方法及其在提高植物耐旱性中的应用。从玉米幼苗叶片中分离获得ZmHB53基因，构建35S‑pCAMBIA3301‑ZmHB53过表达载体，通过农杆菌介导法将前述载体转化入植物，使ZmHB53基因在植物中过表达，可以提高植物耐旱性。本发明为玉米耐旱性能研究提供相关基因基础与理论支持，为玉米遗传育种提供了有用的资源。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及过表达玉米ZmHB53基因的表达载体和构建方法及其在提高植物耐旱性中的应用。
背景技术
玉米是种植范围最广、产量最大的谷类作物，居三大粮食作物之首，在粮食安全保障体系中发挥重要作用。干旱是影响玉米产量最重要的限制因子，干早对玉米的光合作用、呼吸机制、氮素代谢及生长发育和产量等都有明显影响。干旱发生后，植株根系的生长受到抑制，吸收水分和矿质养分的能力下降；干旱影响叶片的扩展，使叶片失水，气孔关闭，光合作用降低，植株制造和积累的有机养分减少；缺水还促进老叶片的衰老和枯黄，使植株生长缓慢，植株矮小；干旱还影响雌雄穗的正常发育，增加败育小花数量，使抽雄和吐丝间隔期延长，花丝和花粉活力下降，授粉结实能力降低，穗粒数减少，灌浆速度减慢，粒重降低，最终导致减产(冯晔,张建华,包额尔敦嘎,等.高温、干旱对玉米的影响及相应的预防措施[J].北方农业学报,2008(6):38-39.)。近年来，针对人们不合理耕种及其工业的进一步发展，土壤干旱程度进一步加深，严重影响玉米产量及人们的生活。因此，筛选培育耐旱玉米新品种对于粮食生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供过表达玉米ZmHB53基因的表达载体和构建方法及其在提高植物耐旱性中的应用，所述ZmHB53基因可提高植物的耐旱性，为培育抗干旱转基因植物提供了新思路。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了过表达玉米ZmHB53基因的表达载体，包括初始表达载体35S-pCAMBIA3301和ZmHB53基因。
优选的，所述ZmHB53基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选的，所述过表达玉米ZmHB53基因的表达载体的序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了上述过表达玉米ZmHB53基因的表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)线性化初始表达载体35S-pCAMBIA3301；
(2)利用扩增引物扩增ZmHB53基因得到ZmHB53目的片段；
(3)将ZmHB53目的片段插入步骤(1)中的线性化初始表达载体35S-pCAMBIA3301中，得到过表达玉米ZmHB53基因的表达载体35S-pCAMBIA3301-ZmHB53。
优选的，步骤(2)中所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，具体如下：
上游引物(SEQ ID NO.3)：5'-CGGGGGACTCTTGACCATGATGGAG AGGGTCGAGGAC-3'；
下游引物(SEQ ID NO.4)：5'-GGAAATTCGAGCTGGTCACCCTACG TACTAGTGGCTCGGTCG-3'。
本发明还提供了上述玉米ZmHB53基因或上述过表达玉米ZmHB53基因的表达载体在提高植物耐旱性中的应用。
优选的，所述植物包括玉米。
优选的，将过表达玉米ZmHB53基因的表达载体利用农杆菌介导法转入植物植株中。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明在玉米中发现ZmHB53基因，分离克隆该基因，并首次在玉米中过量表达了ZmHB53基因，明确了玉米ZmHB53基因可提高植物的耐旱性，为培育抗干旱转基因植物提供了新思路。对农作物耐旱育种及生产应用具有重要的指导意义，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为农杆菌侵染玉米幼胚后的共培养图片；
图2为愈伤组织诱导及玉米第一次筛选培养图片；
图3为玉米愈伤组织第二次筛选培养图片；
图4为经过预分化、分化培养后的转基因玉米图片；
图5为经过生根培养后的转基因玉米图片；
图6为CTAB法提取玉米基因组DNA后，阳性苗PCR检测结果；
图7为荧光定量检测各株系过表达玉米基因表达量结果；
图8为各株系玉米在不同浓度PEG6000模拟干旱处理的表型；
图9为各株系玉米苗期干旱处理后存活率鉴定；
图10为四周正常生长，21天干旱处理后各株系玉米耐旱性鉴定。
具体实施方式
本发明提供了过表达玉米ZmHB53基因的表达载体，包括初始表达载体35S-pCAMBIA3301和ZmHB53基因。
在本发明中，所述ZmHB53基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
ATGATGGAGAGGGTCGAGGACTTAGGGCTCAGCCTCAGCCTCAGCTCGTCCCTCGCGTCTCCTCGCACTCACCATGTCGCCACCATGCTGCTACGCGCTCCAGAGAAGAGGTTCCTGGAGATGCCACTGCTGCTGCCCGCGAAGCGGACGACCGAGGTCACCGGCGAGGATGGCCTGCGAGGCGGCAGCGATGAGGAGGACGGCGGCTGCGGCATCGACGGCTCCAGGAAGAAGCTCCGGCTGTCCAAGGACCAGTCCGCGGTGCTCGAGGATAGCTTCCGGGAGCACCCAACTCTCAACCCTCGGCAGAAGGCAGCCTTGGCGCAGCAGCTAGGCCTGCGGCCCCGCCAGGTGGAGGTGTGGTTCCAGAACAGGCGCGCCAGGACGAAGCTGAAGCAGACGGAGGTGGACTGCGAGTACCTGAAGCGCTGCTGCGAGACGCTGACGGAGGAGAACCGGCGGCTGCAGAAGGAGGTGCAGGAGCTCCGCGCGCTCAAGCTCGTGTCGCCGCACCTCTACATGCACATGTCCCCGCCCACCACCCTCACCATGTGCCCCTCCTGCGAGCGCGTCTCCTCGTCCAACGGCAACTCCGCAGCTGCCACGGCGGCCGCGCGCGCGCGCGCCGGCGCCGGCGCCGGCGCCATCGTCTGCCACCCGATCGACCGAGCCACTAGTACGTAG。
在本发明中，所述过表达玉米ZmHB53基因的表达载体的序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
GAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATTCTAGGTACTAAAACAATTCATCCAGTAAAATATAATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATATCCTCCCTGATCGACCGGACGCAGAAGGCAATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCTCCCAAGATCAATAAAGCCACTTACTTTGCCATCTTTCACAAAGATGTTGCTGTCTCCCAGGTCGCCGTGGGAAAAGACAAGTTCCTCTTCGGGCTTTTCCGTCTTTAAAAAATCATACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGAGTGTCTTCTTCCCAGTTTTCGCAATCCACATCGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAATCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAGGGACAATCCGATATGTCGATGGAGTGAAAGAGCCTGATGCACTCCGCATACAGCTCGATAATCTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTTCATACTCTTCCGAGCAAAGGACGCCATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGCTCCAGCCATCATGCCGTTCAAAGTGCAGGACCTTTGGAACAGGCAGCTTTCCTTCCAGCCATAGCATCATGTCCTTTTCCCGTTCCACATCATAGGTGGTCCCTTTATACCGGCTGTCCGTCATTTTTAAATATAGGTTTTCATTTTCTCCCACCAGCTTATATACCTTAGCAGGAGACATTCCTTCCGTATCTTTTACGCAGCGGTATTTTTCGATCAGTTTTTTCAATTCCGGTGATATTCTCATTTTAGCCATTTATTATTTCCTTCCTCTTTTCTACAGTATTTAAAGATACCCCAAGAAGCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCACTGTTCCTTGCATTCTAAAACCTTAAATACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACATAGTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAATCAACATGCTACCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAACCCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCTTCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCAAAGTCTGCCGCCTTACAACGGCTCTCCCGCTGACGCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTAATTCGGGGGATCTGGATTTTAGTACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGAAATTTTATTGATAGAAGTATTTTACAAATACAAATACATACTAAGGGTTTCTTATATGCTCAACACATGAGCGAAACCCTATAGGAACCCTAATTCCCTTATCTGGGAACTACTCACACATTATTATGGAGAAACTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGTACCGGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTCCCGTGCTTGAAGCCGGCCGCCCGCAGCATGCCGCGGGGGGCATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCGCACGCTCGGGTCGTTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTGGAGCCCAGTCCCGTCCGCTGGTGGCGGGGGGAGACGTACACGGTCGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCGTGCCTTCCAGGGGCCCGCGTAGGCGATGCCGGCGACCTCGCCGTCCACCTCGGCGACGAGCCAGGGATAGCGCTCCCGCAGACGGACGAGGTCGTCCGTCCACTCCTGCGGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCGTGCTTGTCTCGATGTAGTGGTTGACGATGGTGCAGACCGCCGGCATGTCCGCCTCGGTGGCACGGCGGATGTCGGCCGGGCGTCGTTCTGGGCTCATGGTAGACTCGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAGCTTCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTTGACCATGGATGATGGAGAGGGTCGAGGACTTAGGGCTCAGCCTCAGCCTCAGCTCGTCCCTCGCGTCTCCTCGCACTCACCATGTCGCCACCATGCTGCTACGCGCTCCAGAGAAGAGGTTCCTGGAGATGCCACTGCTGCTGCCCGCGAAGCGGACGACCGAGGTCACCGGCGAGGATGGCCTGCGAGGCGGCAGCGATGAGGAGGACGGCGGCTGCGGCATCGACGGCTCCAGGAAGAAGCTCCGGCTGTCCAAGGACCAGTCCGCGGTGCTCGAGGATAGCTTCCGGGAGCACCCAACTCTCAACCCTCGGCAGAAGGCAGCCTTGGCGCAGCAGCTAGGCCTGCGGCCCCGCCAGGTGGAGGTGTGGTTCCAGAACAGGCGCGCCAGGACGAAGCTGAAGCAGACGGAGGTGGACTGCGAGTACCTGAAGCGCTGCTGCGAGACGCTGACGGAGGAGAACCGGCGGCTGCAGAAGGAGGTGCAGGAGCTCCGCGCGCTCAAGCTCGTGTCGCCGCACCTCTACATGCACATGTCCCCGCCCACCACCCTCACCATGTGCCCCTCCTGCGAGCGCGTCTCCTCGTCCAACGGCAACTCCGCAGCTGCCACGGCGGCCGCGCGCGCGCGCGCCGGCGCCGGCGCCGGCGCCATCGTCTGCCACCCGATCGACCGAGCCACTAGTACGGTGACCGACTACAAGGATGACGATGACAAGGGCGATTATAAAGATGACGATGACAAGCAAGACTATAAGGACGATGACGATAAGAGACGTCCCTAAAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGAGCGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCCGCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGTTCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTGCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA。
本发明还提供了上述过表达玉米ZmHB53基因的表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)线性化初始表达载体35S-pCAMBIA3301；
(2)利用扩增引物扩增ZmHB53基因得到ZmHB53目的片段；
(3)将ZmHB53目的片段插入步骤(1)中的线性化初始表达载体35S-pCAMBIA3301中，得到过表达玉米ZmHB53基因的表达载体35S-pCAMBIA3301-ZmHB53。
在本发明中，首先线性化初始表达载体35S-pCAMBIA3301，根据植物表达载体35S-pCAMBIA3301的多克隆位点，在其上游引入NcoI酶切位点(序列如SEQ ID NO.3所示)，下游引入BcuI酶切位点(序列如SEQ ID NO.4所示)，经过双酶切后获得线性化初始表达载体35S-pCAMBIA3301。
在本发明中，利用扩增引物扩增ZmHB53基因得到ZmHB53目的片段，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，具体如下：
上游引物(SEQ ID NO.3)：5'-CGGGGGACTCTTGACCATGATGGAG AGGGTCGAGGAC-3'；
下游引物(SEQ ID NO.4)：5'-GGAAATTCGAGCTGGTCACCCTACG TACTAGTGGCTCGGTCG-3'。
在本发明中，将ZmHB53目的片段插入步骤(1)中的线性化初始表达载体35S-pCAMBIA3301中，得到过表达玉米ZmHB53基因的表达载体35S-pCAMBIA3301-ZmHB53。在本发明中，将ZmHB53目的片段、线性化初始表达载体35S-pCAMBIA3301和反应液混合后进行反应得到表达载体35S-pCAMBIA3301-ZmHB53，所述反应液包括2×Super Fusion Cloning Mix和ddH2O。
本发明还提供了上述玉米ZmHB53基因或上述过表达玉米ZmHB53基因的表达载体在提高植物耐旱性中的应用。
在本发明中，所述植物包括玉米。
在本发明中，将表达载体利用农杆菌介导法转入植物植株中以提高植物耐旱性能。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1基因克隆及载体构建
取三叶期玉米幼苗叶片，液氮速冻研磨，使用全能型植物RNA提取试剂盒(OminiPlant RNA Kit，康为世纪，北京，中国)提取总RNA。使用EasyScript一步法去除gDNA，使用cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国)，以总RNA为模板进行cDNA的合成。
以cDNA为模板设计扩增引物，进行PCR扩增反应，得到ZmHB53目的片段。引物序列具体如下：
上游引物(SEQ ID NO.3)：5'-CGGGGGACTCTTGACCATGATGGAG AGGGTCGAGGAC-3'；
下游引物(SEQ ID NO.4)：5'-GGAAATTCGAGCTGGTCACCCTACG TACTAGTGGCTCGGTCG-3'。
PCR扩增反应的体系见表1，PCR扩增反应的扩增程序为：95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，变性、退火、延伸进行35个循环后；72℃最终延伸10min。对PCR产物进行回收。
表1.PCR扩增反应体系
根据植物表达载体35S-pCAMBIA3301(购买自陕西博瑞德生物科技有限公司)多克隆位点，在其上游引入NcoI酶切位点，下游引入BcuI酶切位点。将PCR回收产物、35S-pCAMBIA3301质粒进行双酶切，按表2反应体系进行加样。将酶切体系混匀，置于37℃水浴锅中，酶切2h，酶切产物加入上样缓冲液后电泳，回收酶切产物，按表3进行酶切片段连接。
表2.双酶切加样体系
表3.连接反应体系
将连接产物转化入大肠杆菌中，并进行菌落PCR检测。提取重组质粒经限制性内切酶双酶切鉴定之后，将重组质粒菌液送测序公司进行DNA的序列测序鉴定，经测序正确的质粒35S-pCAMBIA3301-ZmHB53将于下一步玉米过表达转化。
实施例2玉米遗传转化及阳性鉴定
使用农杆菌介导的花絮浸染法将35S-pCAMBIA3301-ZmHB53载体转化玉米B104自交系，具体步骤如下：
1.消毒及取幼胚
去掉玉米外壳，放置于容器中进行消毒处理，取玉米幼胚，放入加有悬浮液的2mlEP管中。
2.农杆菌侵染及共培
挑取农杆菌于侵染液中，制备OD600＝0.2的农杆菌重悬液，吸出EP管中的悬浮液液体，加入制备好的农杆菌菌液进行侵染。将侵染完成的幼胚连同菌液一起倒入共培养培养基中(购买自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)，吸干菌液。将胚放到25℃暗培养箱中培养3天，培养过程图见图1。
3.愈伤诱导及筛选
将共培养后的胚转移到诱导培养基(购买自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)上，28℃培养箱中暗培养10天。将诱导好的愈伤转移到筛选培养基(购买自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)上进行筛选培养，28℃暗培养2周，筛选培养过程见图2。取第一次筛选存活的愈伤进行第二次筛选，筛选过程见图3。
4.分化及生根
取筛选后长出的胚性愈伤组织放到预分化培养基(购买自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)上，28℃暗培养10天。然后放入分化培养基(购买自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)中进行培养，放置于25℃光照培养箱进行光照培养，直到分化出幼苗，培养过程见图4。将分化好的幼苗转移到生根培养基(购买自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)中，25℃光照培养，直到根系发育完全，培养过程见图5。将发育好的幼苗进行炼苗，并移栽至温室基质内。
5.阳性苗检测
采用CTAB法提取玉米基因组DNA，进行PCR检测，结果见图6，图6中从左到右分别为Marker、阴性对照(NC)和前期获得的不同株系的玉米幼苗，其中株系1、2、3、4、5、6条带清晰，长度正确。这些能够在培养基上正常生长分化，且用CTAB法提取DNA并进行PCR实验条带单一清晰，长度为684bp的植株即为筛选到的阳性植株，这些玉米株系将被用于进一步的筛选鉴定。
6.qRT-PCR检测目的基因表达量
总RNA提取及反转录：使用液氮研磨方法提取玉米总RNA，使用全能型植物RNA提取试剂盒(OminiPlant RNAKit，康为世纪，北京，中国)提取总RNA，取溶解的RNA样品，用核酸蛋白测定仪测定总RNA的浓度，检测其纯度，并用1％的琼脂糖凝胶快速检测其质量。使用EasyScript一步法去除gDNA，使用cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国)，以总RNA为模板进行cDNA的合成，反应体系如表4所示，反应条件为42℃15min，85℃5s，4℃保持。
表4.反转录反应体系
以cDNA为模板设计qRT-PCR引物，引物序列具体如下：
qRT-PCR-F(SEQ ID NO.5)：5’-GAGGTGTGGTTCCAGAACAG-3’；
qRT-PCR-R(SEQ ID NO.6)：5’-CATGTGCATGTAGAGGTGC-3’。
按表5所示反应体系加样，进行qRT-RCR反应，反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸20s，变性、退火、延伸进行40个循环。利用软件LC96和算法，计算分析转基因玉米中ZmHB53的相对表达量。结果见图7，由图7可知，经过qRT-PCR检测，挑选纯合转基因株系OE2和OE3用于后续研究。
表5.荧光定量反应体系
实施例3纯和株系耐旱性分析
将表达量高的玉米株系OE2、OE3和野生型B104(WT)用2％次氯酸钠溶液消毒后，将它们放在含有0％、5％、10％和20％PEG6000的湿滤纸上，观察根长变化。并测定地上地下部长度。结果见图8，由图8可知，在正常条件下，OE2、OE3和野生型B104(WT)根长差异不显著。在含有不同浓度PEG6000的湿滤纸上，转基因株系OE2、OE3地上地下部显著长于野生型，表明转基因株系OE2、OE3耐旱性增强。
将OE2、OE3和野生型B104(WT)播种在营养土和蛭石质量比为3:1的土壤中，放置于培养室培养。于三叶期时开始干旱处理，观察各株系的存活率及其他相关指标。结果见图9，由图9可知，干旱处理后，野生型严重萎蔫干枯，表现出对干旱更敏感，而转基因株系长势相对良好，表现出耐旱性显著增强。
将OE2、OE3和野生型B104(WT)播种在营养土和蛭石质量比为3:1的土壤中，放置于培养室培养，正常培养4周后干旱处理21天。观察V12期各株系玉米的耐旱性。结果见图10，由图10可知，转基因玉米根系发达，根冠比显著高于野生型。以上研究结果证实，转化ZmHB53基因的过表达株系OE2、OE3耐旱性增强，表明转化ZmHB53基因可以提高转基因植物的耐旱性。
由以上实施例和实验例可知，本发明提供了过表达玉米ZmHB53基因的表达载体和构建方法及其在提高植物耐旱性中的应用，所述ZmHB53基因可提高植物的耐旱性，为培育抗干旱转基因植物提供了新思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.过表达玉米ZmHB53基因的表达载体在提高玉米耐旱性中的应用，其特征在于，
所述ZmHB53基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；
所述过表达玉米ZmHB53基因的表达载体的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将过表达玉米ZmHB53基因的表达载体利用农杆菌介导法转入玉米植株中。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN113186219A (zh) * | 2013-10-09 | 2021-07-30 | 孟山都技术公司 | 干扰基因表达的hd-zip转录因子抑制以产生具有增强的性状的植物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张湘博.玉米幼苗干旱响应转录组研究及微生物CRISPR-Cas系统分析.中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑.2022,(第2期),D047-70. * |
| 闫慧萍.玉米HD-Zip转录因子Zmhdz13和Zmhdz14的抗旱功能研究.中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑.2016,(第8期),D047-129，参见摘要，第11页，表2-1，第24页"玉米茎尖转化植株的获得"，第41页"Zmhdz13、Zmhdz14过量表达玉米植株的获得". * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115960952A (zh) | 2023-04-14 |
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