CN116640199A - 促进枇杷开花和结果时间提前的EjFUL基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷花期调控相关的EjFUL基因及其编码的蛋白质和应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明中所述EjFUL基因在二倍体和三倍体枇杷早、晚花品种中均有表达，在三倍体早花品种‘无核早玉’中表达量主要集中于花发育的前4个时期和露白期，且在露白期表达最高。EjFUL基因在烟草叶片细胞中瞬时表达，定位于细胞核，具有典型的FUL转录因子的亚细胞定位特性。通过农杆菌介导的花序侵染法将表达载体pFGC5941‑EjFUL导入野生型拟南芥中，转基因拟南芥35S::EjFUL超量表达，能显著促进拟南芥提早开花和结果时间。因此，本发明枇杷EjFUL基因可以促进植物的开花和结果时间，在枇杷和三倍体枇杷早花早果的新品种定向选育方面，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种枇杷EjFUL蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
枇杷是蔷薇科(Rosaceae)枇杷属亚热带常绿果树，原产我国东南部，目前已有2100多年的栽培历史。枇杷通常于每年的5月份成熟，此时正值水果淡季，枇杷果肉鲜嫩多汁，营养丰富，酸甜可口，具有化痰润肺清热止咳的功效，深受人们喜爱。近年来，枇杷已成为我国优势突出的特色水果。由于枇杷货架期较短直接影响着枇杷的经济效益，开花时间是决定经济果树价值的重要农艺性状之一，通过控制花期提前进而促进枇杷早熟是延长货架期的重要措施，因此解析花期调控关键基因在调控枇杷花发育过程中的功能具有重要意义，并能为枇杷品种的花期定向遗传改良积累基因资源。
MADS-box基因家族几乎参与植物的每一个发育过程，其中被子植物特有的APETALA1/FRUITFULL(AP1/FUL)亚家族成员在开花和果实发育过程中起关键作用。在核心真双子叶植物中，AP1/FUL-like基因亚家族为被子植物所特有，而且在进化过程中发生了多次基因复制事件，产生了euAP1、euFUL和FUL-like三个进化系。FUL基因同AP1序列相似性较高，可通过C末端的基序加以区分。FUL基因具有更广泛作用，FUL调节拟南芥开花的许多方面，包括开花时间，抑制花序分生组织、花序结构、腋生花序生长。在广泛的被子植物中，FUL-like基因调节开花和果实发育。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)，水稻(Oryzasativa)、番茄(Solanum lycopersicum)中，过量表达FUL基因会导致其表现出早花现象。但是，FUL基因调控枇杷花期的分子机制和应用的尚未见报道，其相关机制尚不清楚。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种枇杷EjFUL蛋白及其编码基因和应用。
首先，本发明提供枇杷EjFUL蛋白，其为：
1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
本发明还提供编码所述的枇杷EjFUL蛋白的基因。
优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。
本发明还提供所述基因在促进植物提前开花中的用途。
在本发明一个具体实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，提早植物的开花结果时间。
本发明从枇杷花芽中分离了1个枇杷花发育调控密切相关的EjFUL基因，发现其定位于细胞核。通过实时荧光定量PCR证实了EjFUL基因在二倍体和三倍体枇杷早、晚花品种中均有表达，在早花品种‘无核早玉’中表达量主要集中于花发育的前4个时期和露白期表达量均较高，而在晚花品种EjFUL的表达量均较低。可以推断EjFUL在调控枇杷早花发育中发挥着关键作用。本发明利用基因工程手段构建了EjFUL基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能提早拟南芥开花时间，进而促进结果时间。本发明为植物花期的改造提供了很好的应用前景。
附图说明
图1所示是枇杷EjFUL基因的编码区序列验证的电泳照片。其中，M为DL2000 DNAmarker，1、2、3分别为EjFUL基因在‘常白1号’、‘无核早玉’、‘华玉无核1号’中扩增出来ORF的PCR产物；箭头指示为PCR扩增的目的基因条带。
图2所示是枇杷EjFUL编码蛋白质的氨基酸序列与苹果、梨、拟南芥等与FUL-like同源的氨基酸序列，均具有高度保守的MADS结构域(M区)、特异的I结构域(I区)、较为保守的K结构域(K区)、特异的C末端结构域(C区)。
图3所示是枇杷EjFUL基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，显示该基因的表达产物定位于细胞核。GFP：绿色荧光蛋白；RFP(核marker)：Mcherry；BF：明场成像；Merged：GFP，RFP和BF的合并后的图像。
图4所示是枇杷EjFUL基因在在二倍体和三倍体枇杷早、晚花品种中的表达显示出显著差异性。其中，同一品种中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。S1:花芽的生理分化期；S2:花芽形态分化期；S3:花序主轴分化期；S4:花序支轴分化期；S5:花序侧生支轴快速伸长期；S6:小花分化期；S7:花蕾露白期；S8:盛花期。
图5所示是转基因拟南芥FUL阳性植株的PCR鉴定。其中，M为DNA分子质量标准(DL2000)，WT为野生型拟南芥阴性对照，P为EjFUL-pFGC5941质粒。
图6所示是转基因前后的野生型拟南芥的开花时间照片与EjFUL基因表达分析。其中，A是与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjFUL基因能导致转基因拟南芥开花时间提早14天左右；B是转基因拟南芥EjFUL基因表达量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本专利在实施过程中，也得到了重庆市南开中学校教师和学生(魏艺丛，郝雅雯，袁子钧)的协助。
实施例1枇杷EjFUL基因cDNA序列的克隆
采集‘常白1号’、‘无核早玉’、‘华玉无核1号’，新鲜长度约0.5cm的枇杷分化期的花芽，迅速取样后，放入冻存管中，放入液氮中速冻2h后，然后放入-80℃超低温冰箱中待用，采用RNA提取试剂盒提取枇杷花芽中的总RNA。
以枇杷花芽总RNA为模板，使用Oligo DT18引物进行逆转录反应，合成第一链cDNA，以逆转录产物为模板，使用高保真酶Ex-taq。基于本团队前期的枇杷花芽不同发育时期的转录组测序数据，在枇杷EjFUL基因编码区序列全长两端设计特异引物EjFUL-F:ATGGGAAGAGGTAAGGTGCAGATGA-3'和EjFUL-R:TCATTCAAATGGCGAAAGCATCCAC-3'，反应条件为95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，进行35个循环；72℃10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD19-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjFUL基因的编码区序列进行验证。
使用Snapgene软件对编码区序列验证实验的PCR测序结果，进行序列拼接分析，得到枇杷EjFUL基因cDNA的编码区序列(SEQ ID No.1)。
使用NCBI-ORF网站，对枇杷EjFUL基因的cDNA的编码区序列进行蛋白质序列翻译(SEQ ID No.2)。进一步，将枇杷EjFUL基因编码蛋白质的氨基酸序列与苹果、梨、拟南芥的FUL蛋白进行氨基酸的特异性分析。发现这些序列均具有高度保守的MADS结构域(M区)和较为保守的K结构域(K区)。与这些FUL同源蛋白序列相比，枇杷EjFUL蛋白序列具有特异的FUL-like motif(图2)。其中，M区有73个氨基酸，I区有13个氨基酸，K区有86个氨基酸，C区有98个氨基酸。其中，C区包含特有的FUL-like基序(图2)。
实施例2枇杷EjFUL基因的亚细胞定位分析
利用软件Snapgene对EjFUL基因的ORF序列进行酶切位点分析，并设计两端的同源重组引物，EjFUL-KpnI：5'-aattcgagctcggtaccATGGGAAGAGGTAAGGTGCAG-3'；EjFUL-XbaI：5'-tgcctgcaggtcgactctagaTTCAAATGGCGAAAGCATCCA-3'。以测序正确的pMD19-EjFUL质粒为模板用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase酶进行扩增，得到含有KpnI和XbaI酶切位点以及pCAMBIA1300载体同源臂的EjFUL基因ORF序列。分别提取目的基因和改造的载体pCAMBIA1300质粒，用限制性内切酶KpnI和XbaI分别进行双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用Single Assembly Cloning Mix连接酶将双酶切后的目的基因EjFUL和改造的pCAMBIA1300载体进行连接，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101感受态细胞。
从固体LB培养基平板上挑取农杆菌的单克隆菌落，接种至10mL液体培养基(含Rif+kan)中，28℃，250rpm培养至OD600＝0.5。取5mL培养液离心10min收集菌体，然后加入2mL渗透液重新悬浮菌体，接着离心10min加入2mL渗透液(10mM MgCl2、10mM MES-KOH，pH＝5.6，100μM乙酰丁香酮)重新悬浮菌体。最后稀释成OD600＝0.1～0.3后进行烟草叶片的转化，转化后的烟草暗培养1-2d后，进行GFP荧光的观察(图3)。结果表明，该基因的表达产物定位于细胞核。
实施例3枇杷EjFUL基因的实时荧光定量PCR分析
分别提取‘常白1号’、‘无核早玉’和‘华玉无核1号’3个品种中的顶芽分化、花序分化和花器官分化等8个不同时期材料的总RNA，每个采集材料分别包含8个时期：花芽生理分化期(S1)、花芽形态分化期(S2)、花序主轴分化期(S3)、花序支轴分化期(S4)、花序侧生支轴快速伸长期(S5)、小花分化期(S6)、花蕾露白期(S7)、盛花期(S8)。检测其完整性和浓度后，逆转录成cDNA。根据枇杷cDNA为模板，利用NCBI-primer-BLAST网站设计实时荧光定量PCR引物qEjFULF:5'-GAGCATGATCAGGTGCAGGT-3'和qEjFULR:5'-GGAATCCCCCACTGCATGAT-3'。以枇杷Ejactin基因为内参基因，引物为qRTEjactinF：5'-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3'和qRTEjactinR：5'-TGCCAGATCTTCTCCATGTCATC-3'，用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可进行实时荧光定量PCR实验，每个反应设置3个生物学重复。PCR反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，58℃20s，72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。结果显示：在枇杷花发育过程中，在早花品种'无核早玉'中EjFUL的表达量主要集中在花发育的花序侧生支轴分化期(S4)和花蕾露白期(S7)，而在花发育的其他时期表达量均较低(图4)，可以推断EjFUL在花发育的后期发挥着重要作用。
实施例4枇杷EjFUL基因的植物转基因载体pFGC5941-EjFUL构建
采用PCR扩增手段，在枇杷EjFUL基因的CDS区两端引入酶切位点以及pFGC5941载体的同源臂。以测序正确的pMD19-EjFUL质粒为模板，以EjFUL-F：5′-acaattaccatggggcgcgccATGGGAAGAGGTAAGGTGCAG-3′(引入AscI酶切位点)和EjFUL-R：5′-ctctagactcacctagga tccTCATTCAAATGGCGAAAGCAT-3′(引入BamHI酶切位点)为引物，使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase酶，进行PCR扩增。PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，进行35个循环；72℃10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。使用AscI和BamHI限制性内切酶双酶切pFGC5941载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。将回收的PCR产物与双酶切的pFGC5941载体用Single Assembly Cloning Mix连接酶进行同源重组，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆后，进行测序。根据测序结果分析，提取质粒。将目的质粒转入大肠杆菌感受态细胞，获得植物转基因表达载体pFGC5941-EjFUL。
实施例5转基因表达载体pFGC5941-EjFUL转入拟南芥
取5μL的pFGC5941-EjFUL质粒，加入50μL农杆菌感受态细胞，混合均匀；冰浴5min，转入液氮迅速冷冻5min，快速置于37℃，水浴5min；加入700μL的YEB液体培养基，28℃、250rpm振荡2～3h；将菌液转移至YEB(50mLYEB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，涂布均匀，在28℃条件下倒置培养48h。
挑取培养皿上的单菌落至5mL YEB液体培养基(50μg/mL Kan和50μg/mL Rif)，在28℃摇床中，200rpm振荡培养15-20h，取100μL菌液至50mL YEB液体培养基的锥形瓶中(含50μg/mL Kan和50μg/mL Rif)培养至OD600＝0.8～1.5，将菌液转至50mL离心管，在4℃，5000rpm离心10min，倒掉上清液，每管加入侵染缓冲液(0.5％Silwet L-77，5％蔗糖，1/2MS培养基)50mL。
采用浸花法浸染拟南芥，将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(营养土：珍珠岩：蛭石＝3:1:1)，在温度22℃，湿度70％，14h光照/10h黑暗条件下培养；转基因前将野生型拟南芥植株浇透水；在侵染时将待用的拟南芥植株上已有角果剪掉，将花芽侵入pFGC5941-EjFUL农杆菌浸染液中60s；罩上黑色塑料袋，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养24h后，揭开黑色塑料袋，放置正常培养；上述方法侵染2次，间隔时间为7d。
实施例6枇杷EjFUL基因的转基因拟南芥筛选
收取EjFUL转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。置于4℃冰箱中进行春化处理14d；将春化的种子均匀播撒在培养土上，喷洒水后用保鲜膜覆盖保湿，发芽后揭去保鲜膜，按照常规的水肥管理。待苗子长至十天左右喷洒20mg/L的草铵膦，每三天喷洒一次，一共喷洒三次。将存活的的拟南芥植株培养20天左右，每一植株取一定量的叶片，提取EjFUL转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于200μL的eppendorf管中捣碎，加入8μL的裂解液(0.3M NaOH)混匀。将其置于PCR仪中95°孵育90S，加入170μL的中和液(0.3M HCl和1MTris-HCl混合液体)，最后将产物置于4度冰箱保存。
以未转基因野生型拟南芥的DNA作为对照，对转基因拟南芥的阳性植株进行EjFUL基因进行确证。根据枇杷EjFUL基因序列全长两端设计引物(EjFUL-F：5′-acaattaccatggggcgcgccATGGGAAGAGGTAAGGTGCAG-3′和5′-ctctagactcacctaggatccTCATTCAAATGGCGAAAGCAT-3′)，用2×Mix taq 10μL，8μL DNA，引物各1μL体系对抗草铵膦的拟南芥植株进行PCR鉴定，共获得5株阳性的EjFUL转基因野生型拟南芥植株(图5)。
实施例7枇杷EjFUL基因的转基因拟南芥的表型鉴定
对这些拟南芥的开花时间表型进行观察、统计和拍照。表型结果显示：与野生型拟南芥相比，过量表达EjFUL基因能导致转基因拟南芥开花时间提早11-12天(图6)。
以未转基因野生型拟南芥的cDNA作为对照，使用实时荧光定量引物qEjFULF和qEjFULF，以及拟南芥Tubulin基因作为内参基因，Tubulin引物对为：qAtActin-F：5′-TTACCCGATGGGCAAGTC-3′；qAtActin-R：5′-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3′。对转基因拟南芥的阳性植株进行EjFUL基因的表达量进行分析。
在这些转基因株系中，挑选了1、2和4号株系进行开花时间的表型鉴定，对这些拟南芥的开花时间表型进行观察、统计和拍照。表型结果显示：与野生型拟南芥相比，与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjFUL基因能导致转基因拟南芥开花时间提早11-12天(图6A，表1)。
表1转基因拟南芥植株观察记录
转基因拟南芥的EjFUL基因表达分析发现，与未转基因野生型拟南芥中相比，提前开花的转基因拟南芥的EjFUL基因显著高表达(图6B)。因此，EjFUL基因的转基因拟南芥材料可用于植物开花时间的改造，进而使植物提早开花及果实成熟时间，有利于早熟品种的选育。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.枇杷EjFUL蛋白，其为：
1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的枇杷EjFUL蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ IDNo.1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。
7.权利要求2或3所述基因在促进植物提前开花中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，提早植物的开花结果时间。
9.一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。
10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因植株与野生型相比，其花芽分化和开花时间提早，进而提早结果时间。
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