CN115960190B - 枇杷EjGASA6基因及其编码的蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷赤霉素相关EjGASA6基因及其编码的蛋白质和应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列，如SEQ IDNo.2所示。本发明所述的EjGASA6基因通过增强赤霉素生物合成促进植物生长发育。采用根癌农杆菌Gv3101介导的浸花法将含目的基因的植物表达载体pLGN‑35S‑EjGASA6‑NOS‑BE转入到野生型拟南芥，转基因拟南芥35S:EjGASA6超表达增强活性赤霉素生物合成。本发明利用枇杷EjGASA6基因获得的转基因拟南芥植株材料，能够增强赤霉素生物合成，进而促进植物生长发育和提前开花，具有很好的应用前景。

Description

枇杷EjGASA6基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjGASA6基因、其编码的蛋白和应用。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica)是蔷薇科枇杷属亚热带常绿果树，其果实成熟于春末夏初的水果淡季，以其较高的食用及药用价值受到越来越多的青睐，赤霉素在枇杷优良品种选育进程中提升枇杷无核或少核化枇上取得良好成效，但其中分子生理机制尚待深究，因此研究赤霉素代谢相关基因在枇杷中的生理生化作用就十分重要，本研究为阐明GASA蛋白在枇杷赤霉素信号途径中的作用及其在枇杷发育中的生物学功能研究提供线索和依据。

GASA(Gibberellic Acid-Stimulated in Arabidopsis)蛋白(又称Snakin蛋白)是一类广泛受赤霉毒调控的小分子蛋白。现有研究表明GASA蛋白在植物生长发育以及胁迫响应中广泛发挥功能，如防御病原及线虫，调节花冠伸长、器官形成、果实成熟、茎干生长和开花时间，响应高温胁迫等。尽管赤霉素信号通路已经大致阐明，但GASA基因家族在赤霉素信号途径中的作用机制还知之甚少，以及这些基因编码的蛋白质在植物尤其是木本植物生长发育以及胁迫响应中的相关作用机制尚不清。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种枇杷EjGASA6蛋白及其编码基因和应用。

首先，本发明提供枇杷EjGASA6蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的枇杷EjGASA6蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在促进植物赤霉素生物合成中的用途。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，通过增强赤霉素生物合成进而促进植物生长发育。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，通过增强赤霉素生物合成进而促进植物提前开花。

本发明从枇杷中分离了1个拟南芥AtGASA6同源的EjGASA6蛋白，其广泛定位于核膜、内质网膜、细胞膜。利用基因工程的手段构建了EjGASA6基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中使其超量表达，证实了过表达EjGASA6能够增强拟南芥赤霉素生物合成，进而促进植物生长发育和提前开花。本发明为植物内源赤霉素含量的改造提供了很好的应用前景。

附图说明

图1所示是枇杷EjGASA6基因的克隆电泳照片。其中，M为DL2000 DNA marker，1为EjGASA6基因ORF的PCR产物。

图2所示是枇杷EjGASA6编码蛋白质的氨基酸序列与苹果、拟南芥的序列对比，均具有高度保守的GASA结构域。

图3所示是枇杷EjGASA6基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，表明EjGASA6蛋白定位于核膜、内质网膜、细胞膜。GFP：绿色荧光蛋白；RFP：红色荧光蛋白；BF：明场成像；Merged：GFP，RFP和BF的合并后的图像。

图4是枇杷EjGASA6转基因拟南芥阳性鉴定。(A)GUS染色鉴定；(B-C)PCR扩增鉴定。M:DL2000 DNA marker；P:阳性对照；N:阴性对照；(D)RT-qPCR鉴定。

图5所示是EjGASA6转基因拟南芥表型变化。(A)植株生长表型差异；(B-C)垂直培养后根生长差异；(D-E)暗培养后下胚轴生长差异。

图6所示是EjGASA6转基因前后的拟南芥内源活性赤霉素(GA1、GA3、GA4、GA7)含量测定。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枇杷EjGASA6基因cDNA序列的克隆及表达载体构建

本研究所用试材取自西南大学果树学重点实验室多倍体枇杷资源圃中的“龙泉1号”枇杷的花蕾。取样后，放入冻存管中，放入液氮中速冻2h后，然后放入-80℃超低温冰箱中待用，采用RNA提取试剂盒提取枇杷花蕾中的总RNA。。

基于本团队前期的枇杷花器官的转录组测序数据，在枇杷EjGASA6基因编码区序列全长两端设计同源重组引物。其中正向引物为EjGASA6-F(5′-tacggatccgtactagtcccAAAGAGGCAATGGCAATG GC-3′)，反向引物为EjGASA6-R(5′-ggtaccatgtcgacgggcccGATCAAGGGCATTTTGGTCC-3′)。

以枇杷花蕾cDNA为模板对EjGASA6基因编码区cDNA序列进行扩增。PCR扩增体系及反应条件如下：总体积20μL，模板1μL，上下游引物(10μmol/L)均为1μL，2×PrimerSTAR MAXPremix10μL，无菌ddH₂O 7μL；扩增程序为95℃预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，重组到用限制性内切酶SmaI线性化后的pLGN-35S-MCS-Nos-BE载体上，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjGASA6基因的编码区序列进行验证，获得植物转基因表达载体pLGN-35S-EjGASA6-NOS-BE。

使用DNAMAN软件对编码区序列验证实验的PCR测序结果，进行序列拼接分析，得到枇杷EjGASA6基因cDNA的编码区序列(SEQ ID No.1)。

使用DNAMAN软件，对枇杷EjAGL6基因的cDNA的编码区序列进行蛋白质序列翻译(SEQ ID No.2)。进一步，将枇杷EjGASA6基因编码蛋白质的氨基酸序列与苹果拟南芥的GASA6蛋白进行氨基酸的特异性分析，发现这些序列均具有高度保守的GASA结构域(图2)。

实施例2枇杷EjGASA6基因的亚细胞定位分析

设计同源重组引物，p2300-EjGASA6-eGFP-F：5'-ggacagggtacccggggatccAAAGAGGCAATGGCAATGGC-3'；p2300-EjGASA6-eGFP-R：5'-agtgtcgactctagaggatccAGGGCATTTTGGTCCTCCTT-3'。以测序正确的pLGN-35S-EjGASA6-Nos-BE质粒为模板进行扩增，得到含有同源片段的EjGASA6基因ORF片段，回收备用。同时提取载体pCAMBIA2300-35S-eGFP质粒，用限制性内切酶BamHI进行酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用同源重组酶将目的基因片段和线性化载体进行连接，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR和酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过冻融法(取1μg的质粒，加入100μL农杆菌感受态细胞，混合均匀；冰浴5min，转入液氮迅速冷冻5min，快速置于37℃，水浴5min；加入700μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡3h，将菌液涂布于筛选培养基培养)转入农杆菌GV3101感受态细胞，将菌液涂布于YRK(50mL YEB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，在28℃条件下倒置培养。

从固体培养基平板上挑取农杆菌的阳性单克隆菌落，接种至10mL液体YRK培养基中，28℃，250rpm培养至OD₆₀₀＝0.5。取5mL培养液离心10min收集菌体，然后加入2mL渗透液重新悬浮菌体，接着离心10min加入2mL渗透液(10mM MgCl₂、10mM MES，150μM乙酰丁香酮)重新悬浮菌体。最后稀释成OD₆₀₀＝0.03～0.1后进行烟草叶片的转化，转化后的烟草暗培养1-2d后，进行GFP荧光的观察(图3)。结果表明，表明EjGASA6蛋白定位于核膜、内质网膜、细胞膜。

实施例3将转基因表达载体pLGN-35S-EjGASA6-NOS-BE转入拟南芥

将构建好的pLGN-35S-EjGASA6-NOS-BE载体质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101感受态细胞，将菌液涂布于YRK固体选择培养基中，在28℃条件下倒置培养。

挑取阳性单菌落至5mL YRK液体培养基，在28℃摇床中，200rpm振荡培养15-20h，取100μL至100mLYRK液体培养基培养至OD₆₀₀＝0.8～1.5，将菌液转至2个50mL离心管，5000rpm离心5min，倒掉上清液，每管加入侵染缓冲液(0.5％ Silwet L-77，5％蔗糖)50mL重悬备用。

将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(珍珠岩：蛭石：营养土＝1:4:5)，在温度22℃，湿度70％，16h光照/8h黑暗条件下培养；转基因前将野生型拟南芥植株浇透水；在浸染时将待用的拟南芥植株上已有角果和已开的花剪掉，将花芽浸入农杆菌浸染液中60s；罩上黑色塑料袋，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养24h后，揭开黑色塑料袋，放置正常培养；上述方法侵染2次，间隔时间为7d。

实施例4枇杷EjGASA6基因的转基因拟南芥筛选

收取EjGASA6转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。在超净台通过以下步骤进行处理：75％酒精灭菌1min→1‰Tween80(75％酒精为溶剂)灭菌12min→无菌水冲洗5遍→平铺在无菌滤纸上晾干→均匀地撒在选择性1/2MS(含50μg/mL Kan)平板培养基上。将平板于4℃冰箱中进行春化处理2d；将春化后地平板置于光照培养箱进行培养大概14d左右，将板子上存活的的拟南芥植株挑取种植于营养土中培养，待长势良好后进行后续鉴定收种。

实施例5转基因拟南芥阳性鉴定(GUS染色、DNA扩增、实时荧光定量PCR)

GUS染色鉴定：

以5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-葡糖醛酸为底物，对转基因植株进行GUS活性组织化学测定。取少量植株叶片至适量GUS染液中，37℃反应1～2h，75％(V/V)酒精脱色3～5次，每隔30min更换一次酒精。拍照观察使用体视显微镜Olympus，SZX9(图4A)。

DNA扩增验证：每一植株取一定量的叶片，用DNA提取试剂盒按照说明书提取EjGASA6转基因拟南芥DNA。以未转基因野生型拟南芥的DNA作为对照，对转基因拟南芥的阳性植株进行EjGASA6基因进行确证。分别用载体通用引物搭配基因同源重组引物进行扩增，具体为：组合1正向引物为35S(5′-ACGACAGGACACACCCTCTTG-3′)，反向引物为EjGASA6-R(5′-ggtaccatgtcgacgggcccGATCAAG GGCATTTTGGTCC-3′)(图4B)；组合2正向引物为EjGASA6-F(5′-tacggatccgtactagtcccAAAGAGGCAATGGCAATG GC-3′)，反向引物为NOS(5′-GGATCTGAGCTACACATGCTC-3′)(图4C)，用2×Mix taq，1μL DNA，对拟南芥植株进行PCR鉴定。

实时荧光定量PCR分析：

利用RNA提取试剂盒提取转基因拟南芥叶片总RNA，逆转录成cDNA。利用Snapgene软件设计实时荧光定量PCR引物qEjGASA6-F:5'-AAAGAGGCAATGGCAATGGC-3'和qEjGASA6-R:5'-GATCAAGGGCATTTTGGTCC-3'，以拟南芥actin基因为内参基因，引物为qRTAtactin-F：5'-TATCGCTGACCGTATGAG-3'和qRTAtactin-R：5'-CTGAGGGAAGCAAGAATG-3'，进行实时荧光定量PCR实验，每个反应设置3个生物学重复。PCR反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，56℃20s，72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。结果显示：转基因拟南芥中均检测到EjGASA6不同程度的异源表达量(图4D)。

综上，共获得5株阳性的EjGASA6转基因野生型拟南芥植株(图4)。

实施例6枇杷EjGASA6基因的转基因拟南芥的表型鉴定

为分析异源过表达EjGASA6基因对拟南芥生长发育的影响，对其中两个转化子(OE-2/3)T3代转基因拟南芥进行表型观察。

结果表明：与野生型相比，转基因拟南芥的表现出抽薹提前的现象(图5A)，我们推测EjGASA6可能在促进植物叶片生长发育中具有重要作用。进一步，通过垂直培养观察根生长情况，结果表明，转基因拟南芥较野生型主根更长(图5B,C)，同时，暗培养观察发现，转基因拟南芥的下胚轴较野生型显著伸长(图5D,E)。

以上结果暗示EjGASA6基因可能主要影响转基因拟南芥内源赤霉素的合成，为了验证这一猜测，我们将样品送于公司进行内源赤霉素含量检测。以异丙醇-水-盐酸提取植物样品内源性激素(Endogenous Phytohormones)，以安捷伦(Agilent)1290高效液相色谱仪串联AB Sciex QTRAP 6500+质谱仪测定植物内源性激素GA1、GA3、GA4、GA7含量，并在提取过程中加入内标物质校正检测结果。

检测结果显示，转基因拟南芥中活性赤霉素GA4的含量显著高于野生型。因此，EjGASA6基因的转基因拟南芥材料可通过增强赤霉素生物合成，进而促进植物生长发育，具有很好的应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.枇杷EjGASA6蛋白，其为由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的枇杷EjGASA6蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在通过增强赤霉素生物合成促进植物生长发育中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，通过增强赤霉素生物合成促进植物生长发育。

8.权利要求2或3所述基因在通过增强赤霉素生物合成提前花期的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，通过增强赤霉素生物合成促进植物提前开花。