CN116004660A - 与甜瓜白粉病抗性相关基因CmVDAC及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供与甜瓜白粉病抗性相关基因，所述基因为CmVDAC。本发明还提供上述的与甜瓜白粉病抗性相关基因在制备白粉病抗性甜瓜中的应用。目前甜瓜白粉病抗性基因大多为针对某一种生理小种，广谱性抗白粉病的基因较少，在甜瓜线粒体上和白粉病有关的基因很少有相关报道。本发明首次在甜瓜中发现CmVDAC基因，是位于甜瓜线粒体上的具有保守功能域并可以响应白粉病菌的抗性反应，经过甜瓜叶片VIGS和模式植物过表达正反验证了甜瓜CmVDAC基因在甜瓜白粉病抗性中的作用，为甜瓜广谱性抗性改良和育种奠定基础。

Description

与甜瓜白粉病抗性相关基因 CmVDAC及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程及分子生物学技术领域，具体涉及与甜瓜白粉病抗性相关基因 CmVDAC及其应用。

背景技术

甜瓜白粉病是世界性病害，严重影响产量和品质，抗病品种选育是解决这一问题的有效途径。但由于白粉菌生理小种多、小种分化速度快，使得抗性材料不能保证对白粉病的持久抗性，因此利用分子生物学技术开展甜瓜白粉病广谱抗性研究，鉴定提高白粉病抗性的基因，解析基因功能，对于创制优良抗病材料，对白粉病防治工作具有重要的意义。

VDAC是电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channel）蛋白，是一种由一个小的多基因家族编码的位于线粒体外膜的离子通道蛋白，依赖电压来调节其对阴阳离子的选择性。线粒体中的VDAC通道蛋白起着“开关”的作用，决定线粒体的命运方向：正常呼吸或抑制线粒体新陈代谢（后者引起细胞凋亡和细胞死亡）。VDAC是一种高度保守的蛋白，目前在所有经检测的真核生物物种中都存在。VDAC异构体在许多植物中被鉴定出来，如拟南芥、水稻、小麦和葡萄等。VDAC在植物的生长发育（生长、叶片和花粉发育）、生物或非生物胁迫（病害、低温、干旱、盐胁迫等）引起的细胞程序性死亡等都发挥重要的作用。VDAC在甜瓜上有关白粉病抗性的方面还未见报道，甜瓜VDAC基因功能的开发应用，将为创制和筛选甜瓜特色种质资源，改善甜瓜白粉病抗性，减少农药施用，保证舌尖上的安全提供帮助，具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了与甜瓜白粉病抗性相关基因 CmVDAC及其应用。

本发明包含甜瓜 CmVDAC基因对甜瓜白粉病抗性改进的功能验证。本发明首次发现甜瓜 CmVDAC基因响应白粉病侵染，采用VIGS技术在甜瓜叶片上瞬时表达，结合过表达转化拟南芥，验证了 CmVDAC基因对甜瓜白粉病菌的抗性响应。在甜瓜上瞬时沉默表达 CmVDAC基因降低了甜瓜对白粉病的抗性，在拟南芥上过表达则增加了拟南芥对白粉病的抗性。本发明首次发现甜瓜 CmVDAC基因，且进一步验证了甜瓜 CmVDAC基因在白粉病抗性中的作用，为获得广谱性白粉病抗性甜瓜改良和育种提供思路和依据。

本发明提供与甜瓜白粉病抗性相关基因，所述基因为 CmVDAC。

作为优选，所述 CmVDAC的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

作为进一步优选，所述 CmVDAC的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1。

本发明还提供上述的与甜瓜白粉病抗性相关基因在制备白粉病抗性甜瓜中的应用。

作为优选，所述应用为在甜瓜中过表达 CmVDAC基因。

本发明的有益效果为：目前甜瓜白粉病抗性基因大多为针对某一种生理小种，广谱性抗白粉病的基因较少，在甜瓜线粒体上和白粉病有关的基因很少有相关报道。本发明首次在甜瓜中发现 CmVDAC基因，是位于甜瓜线粒体上的具有保守功能域并可以响应白粉病菌的抗性反应，经过甜瓜叶片VIGS和模式植物过表达正反验证了甜瓜 CmVDAC基因在甜瓜白粉病抗性中的作用，为甜瓜广谱性抗性改良和育种奠定基础。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为抗病材料野生甜瓜和感病材料厚皮甜瓜分别接种白粉病菌后 CmVDAC基因的表达量。

图2为VIGS介导的抗病材料野生甜瓜 CmVDAC基因沉默株的白粉病发病率。

图3为在拟南芥上过表达 CmVDAC基因后白粉病发病率。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1 甜瓜 CmVDAC基因的克隆及特征分析

通过GENE BANK中拟南芥的基因数据库，发现拟南芥中有四个 VDAC基因，然后通过同源克隆方法，从甜瓜中克隆甜瓜 CmVDAC同源基因序列；再通过特征序列检索，在甜瓜基因组数据库中，比对出甜瓜的 CmVDAC基因；通过聚类分析，确定甜瓜的 CmVDAC基因和拟南芥的 VDAC4基因高度相似，同源性在70%；进一步利用DNAman软件，比对了拟南芥 VDAC1-4、甜瓜 CmVDAC基因，发现甜瓜 CmVDAC基因和拟南芥的 VDAC4基因，拥有较多的保守域相似区。

甜瓜的 CmVDAC基因mRNA序列如下：

ATGGGCAGTTCTCCAGCGCCATTTTCAGATATTGGCAAAAAGGCCAAAGACCTCTTAACCAAAGACTACAACTTCGATCACAAGTTTACCCTGTTGCTACCGAACTCCGATGGAATGGGACTAACTGCCACCGGTTTGAAGCGGGATCAAATTTTTATTGGTGATATCAGTACCCTGTACAAGAGTGGAAAGACAACCGTGGATGTGAAAGTTGATACGTATTCAAACGTTTCTACAAAAGTGACCGTGACTGATATTTTACCAACTACCAAGGCCACGCTTAGCTTCAGAGTACCTGATCACAAGTCGGGCAAGCTGGATGTTCAGTACTTCCACCCTCATGCAGCTATTGATTCGAGTATTGGTCTCCACCCCAGTCCACTTTTGGAATTTTCAGCTGCAATCGGTAGCAAGAATTTTAGTTTAGGTGGTGATGTGGGATTTGATACTACTTCTGCTTCATTCACAAAATACAATGCCGGAATCAGCTTGAATAAGTCAGACTTTTCTGCGGCTCTTATGCTAACTGACAAAGGACAGGCTCTGAAGGCATCTTATATTCATTCATTGGATCCTCTTAATGAGACTATGGTAGCGGCTGAAATGACTCACAAGTTCTCCACCTCTGAAAACTCCTTTACCATTGGAAGTTCTCATGTTCTGGATCCAGTTACGCTCATGAAAACACGATTCTCCGACAAAGGAAAAGCAGCTATGCTTTTCCAACGAGAGTGGAGGCCAAAATCTTTGGTGACTCTGTCAGCTGAGTATGACTCAAAAGCTATCGATTCATCTCCCAAGATAGGCCTTGCTATTGCTCTGAAGCCTTGA

甜瓜的 CmVDAC氨基酸序列如下：

MGSSPAPFSDIGKKAKDLLTKDYNFDHKFTLLLPNSDGMGLTATGLKRDQIFIGDISTLYKSGKTTVDVKVDTYSNVSTKVTVTDILPTTKATLSFRVPDHKSGKLDVQYFHPHAAIDSSIGLHPSPLLEFSAAIGSKNFSLGGDVGFDTTSASFTKYNAGISLNKSDFSAALMLTDKGQALKASYIHSLDPLNETMVAAEMTHKFSTSENSFTIGSSHVLDPVTLMKTRFSDKGKAAMLFQREWRPKSLVTLSAEYDSKAIDSSPKIGLAIALKP

实施例2 甜瓜 CmVDAC基因对白粉病胁迫的表达响应

选用抗白粉病菌的野生甜瓜（RM，以下简称“抗病材料野生甜瓜”）和易感白粉病菌的厚皮甜瓜（HM，以下简称“感病材料厚皮甜瓜”）为实验材料。

以浓度为10⁶/mL的孢子悬浮液对上述两种甜瓜叶片分别采用毛刷法接种白粉病菌（ Podosphaera xanthii），同时分别设置空白对照组，取接种白粉病菌0h、12h、24h、2d、3d、4d、5d和6d的叶片样品并提取RNA，使用2^-ΔΔCt 法检测感病材料厚皮甜瓜和抗病材料野生甜瓜VDAC基因对白粉病的表达响应。具体方法如下：

参照文献[程鸿]的方法，以浓度为10⁶/mL的白粉病菌孢子悬浮液对上述两种甜瓜叶片分别采用毛刷法接种白粉病菌；在接种白粉病菌的0h、12h、24h、2d、3d、4d、5d和6d时，分别取各组甜瓜叶片，液氮速冻。然后使用经典Trizol法分别提取各组甜瓜叶片的RNA；RNA反转录采用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)（RR047A）试剂盒。取RNA样品1㎍（根据RNA浓度加入相应体积），RNA样品加入反转录混合液，反转录混合液由PrimeScript RT Enzyme Mix I 1㎕、5×PromeScript Buffer 4㎕、RTPrimer Mix 1㎕、RNase Free dH₂O 补充至20㎕组成，37℃反应15min，85℃反应5sec，降至4℃得到反转录的cDNA。

利用特定引物进行PCR扩增，并使用ACTIN2为内参，荧光定量检测使用abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX试剂盒，具体为：冰上制备扩增混合液，扩增混合液由abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 10㎕、PCR Forward Primer（10μM）0.8㎕、PCR ReversePrimer（10μM）0.8㎕、cDNA模板1㎕，再加入RNase Free dH₂O 7.4㎕；使用定量PCR仪进行VDAC基因的表达量检测，PCR程序为95℃变性10min，循环变性94℃处理15sec重复40-45个循环，60℃退火延伸1min；使用2^-ΔΔCt 法检测VDAC基因的表达量。

引物序列为：

VDAC-F：AGGTGGTGATGTGGGATTTG；

VDAC-R：GAGCCTGTCCTTTGTCAGTTAG；

ACTIN2-F：CTACGAACTTCCTGATGGACAAG；

ACTIN2-R：CCAATGAGAGATGGCTGGAATAG。

结果如图1所示，接种白粉病前，抗病材料野生甜瓜（RM）的 CmVDAC基因的表达量是感病材料厚皮甜瓜（HM）的7.29倍。接种白粉病菌后，无论是感病和抗病甜瓜材料都显著降低了 CmVDAC基因的表达，但在接种后大多时期抗病材料的 CmVDAC基因的表达量均显著高于感病材料，在接种白粉病菌0.5d，抗病材料的基因表达量是感病材料基因表达量的3.35倍；在接种白粉病菌1d，抗病材料的基因表达量是感病材料基因表达量的2.61倍；在接种白粉病菌6d，抗病材料的基因表达量是感病材料基因表达量的2.89倍。

图1为抗病材料野生甜瓜和感病材料厚皮甜瓜分别接种白粉病菌后的 CmVDAC基因的表达量。

实施例3 VIGS介导的 CmVDAC基因在抗白粉病菌的野生甜瓜（RM）中的瞬时表达沉默

构建沉默表达载体pTRV2+gene，连接目的基因后转化感受态细胞，用注射法直接将含有表达载体的农杆菌液注射进抗白粉病菌的野生甜瓜（RM）叶片中，利用瞬时表达系统，沉默叶片中CmVDAC，从而观测严重缺失VDAC蛋白的叶片，对白粉病菌的抵抗能力变化。具体方法如下：

1 设计引物

引物序列为：

TRV2+VDAC-F：AGTAAGGTTACCGAATTCATTTGATACTACTTCTGCTTCATTCAC；

TRV2+VDAC-R：GAGCTCGGTACCGGATCCTACTCAGCTGACAGAGTCAC。

基因的扩增和胶回收

PCR反应液为：PrimesSTAR Max Premix 10㎕、Former primer 0.5㎕、Reverseprimer 0.5㎕、cDNA模板 1㎕，灭菌ddH₂O补充至20㎕；PCR反应程序为：95℃ 5 min，94℃30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min/kb、30 cycles，72℃ 8 min。

其中，PCR反应中使用的引物为步骤1中所述引物；cDNA模板为实施例2中抗白粉病菌的野生甜瓜叶片经提取和反转录得到的。

将PCR反应产物1%琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收，在紫外灯下快速切取含有目标条带的凝胶，转移到2ml的离心管，按照胶回收试剂盒（百泰克胶回收试剂盒）说明操作进行胶回收。

线性化载体pTRV2+gene构建

载体pTRV2-K（上海鹿鸣生物）线性化：用EcoRI和BamHI双酶切质粒pTRV2-K，酶切后，琼脂糖凝胶电泳进行结果检测，切取载体大片段对应条带的凝胶，百泰克胶回收试剂盒回收酶切产物；双酶切反应体系为：2×Tango buffer 4㎕、EcoRⅠ 1㎕、BamHⅠ 2㎕、质粒1㎍、dH₂O补充至20㎕；37℃酶切2.5h；65℃ 20min失活。

目的片段与载体的连接

将步骤2的VDAC DNA 片段和步骤3的线性化载体以一定的摩尔比加到 EP 管中进行重组反应（目的片段与载体的摩尔比在3:1-10:1之间）；混匀后在 37℃放置20 min；立即进行转化，剩余连接液可保存在 4℃或-20℃待用。

转化感受态细胞

冰上融化一管 100㎕的DH5a感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来。加入10㎕步骤4的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育45 min；42℃水浴中热激90 s后快速放入冰上2 min；加入 500㎕的LB液体培养基，37℃孵育 60 min；5000 g离心1 min收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含Kana抗生素平板上，用灭菌的玻璃珠涂布，待菌液被琼脂吸收后，37℃倒置过夜；菌落PCR进行阳性单克隆鉴定，测序正确的即为TRV2+Gene质粒。

转化农杆菌Gv3101

利用 Plasmid Mini Kit I(OMEGA，货号:D6943-01)进行质粒提取。

提取测序正确的 TRV2+Gene质粒；质粒转化农杆菌：取出Gv3101感受态细胞，冰上融化；加入5-10㎕ TRV2+Gene质粒，轻微混匀，冰浴10 min；液氮速冻5min；37℃水浴5min、冰浴5min；加入800㎕无抗LB液体培养基，28℃摇3-4 h；4000 rpm离心1min，取适量菌涂布在含Kana+庆大的平板上(TRV2+VDAC抗性：Kana+庆大)，28℃倒置培养；待单菌落长出后，选3-6个单菌落做菌落PCR验证。

甜瓜苗子的种植

将抗白粉病的野生甜瓜种子泡水4h，然后在25-28℃的人工气候箱内催芽，3天后，播种在10 × 10cm的营养钵基质中。约半个月后，在第一片及以后的真叶上开展人工注射侵染液。

甜瓜叶片的侵染叶注射及白粉病菌的接种

用渗透缓冲液 10 mmol/L MES 和 MgCl₂ 作为重悬液，取该重悬液分别与步骤6制备的GV3101 农杆菌菌株重悬液按 1:1 体积充分混匀，使用 1 mL 注射器注射侵染于三叶一心的甜瓜叶片。黑暗处理24h后，开始接种白粉病菌，接种 7~10 d 后，观测白粉病菌对甜瓜叶片的感染情况。

结果见图2，由图2可知：注射后，抗病材料的野生甜瓜株，VIGS介导的 CmVDAC基因沉默表达，植株感染白粉病菌，发病率为65%，显示感病表现；而对照空载体株（没有注射菌液的抗病材料野生甜瓜对照株）的发病率不到3%，属于高抗白粉病。

结果说明：沉默表达 CmVDAC基因降低了甜瓜对白粉病的抗性。

图2为VIGS介导的抗病材料野生甜瓜 CmVDAC基因沉默株和对照株的白粉病发病率。

实施例4  CmVDAC基因过表达转拟南芥

由于甜瓜材料的特殊性，遗传转化尚不成熟，直接转化甜瓜较为困难，而拟南芥为模式植物，遗传转化体系已基本完善，因此本发明利用模式植物拟南芥来开展 CmVDAC基因的功能验证。构建过表达载体PART-CAM，连接目的基因后转化感受态细胞，用农杆菌介导的花序侵染法，通过花器官进行转化，转化胚珠，获得转基因种子，进行转基因拟南芥抗性筛选、PCR筛选等鉴定阳性转基因植株，进行白粉病接种抗性鉴定。具体方法如下：

1 设计引物

引物序列为：

CAM+VDAC-F：GGAGAGGACACGCTCGAGATGGGCAGTTCTCCAGCGCCATTTT；

CAM+VDAC-R：CATTAAAGCAGGACTCTAGATCAAGGCTTCAGAGCAATAGCAAG。

2 CmVDAC基因的扩增和胶回收

CmVDAC基因的扩增和胶回收的具体方法与实施例3步骤2中相同。

线性化载体PART-CAM构建

载体 pART-CAM 的线性化：用XhoI 和 XbaI 双酶切质粒 pART-CAM，酶切后，琼脂糖凝胶电泳进行结果检测，切取载体大片段对应条带的凝胶，百泰克胶回收试剂盒回收酶切产物；双酶切反应体系为：2×Tango buffer 4㎕、Xhol 1㎕、Xbal 2㎕、质粒1㎍、dH₂O补充至20㎕；37℃酶切2.5h；65℃ 20min失活。

目的片段与载体的连接

目的片段与载体的连接的具体方法与实施例3步骤4中相同。

转化感受态细胞

转化感受态细胞的具体方法与实施例3步骤5的不同之处为：筛选培养基的抗生素为链霉素 (Str)，其余均与实施例3步骤5相同。

转化农杆菌Gv3101

转化农杆菌Gv3101的具体方法与实施例3步骤6的不同之处为：筛选培养基为CAM+VDAC抗性：壮观+庆大，其余均与实施例3步骤6相同。

模式植物拟南芥植株的种植

常规方法种植拟南芥，待长出两片真叶后，选择长势好的拟南芥进行单株移栽，覆膜保湿一天，拟南芥抽苔开花后，剪去主苔花序，以促进腋生花序生长。当植株花蕾较多时，剪去已结果荚进行下一步转基因试验。

花絮侵染法转化拟南芥

取出本实施例步骤6制备的含阳性重组质粒的农杆菌菌液，按1:100 的比例接种于5 mL的含有抗生素的LB液体培养基中，在 28℃ 150rpm条件下活化1~2d；按1:50的比例将活化的农杆菌菌液接种在250 mL的LB液体培养基中（含抗生素），28℃150rpm过夜培养；5000 rpm 离心 10 min，弃掉培养液，用 500 mL 5%的蔗糖溶液（含有终浓度为0.03%的silwet L-77）重悬菌体，配成转化液混匀后待用。

转化前将拟南芥浇透水，剪去果荚。将花序浸入转化液中，轻轻摇动，浸染1 min后移出，抖掉植株上多余的转化液，用保鲜膜将植株包好，侧放于托盘中，避光共培养24h，去膜后直立放置培养，约7d后再转化第二次；在培养室中继续培养拟南芥，收集全部成熟的种子，记作 T0 代，干燥后放4℃冰箱保存。

转基因拟南芥抗性筛选

取少量 T0代转基因拟南芥种子于1.5 mL离心管中，加入1 mL蒸馏水，浸泡5min收集种子。加入1mL，75 %乙醇，振荡洗涤45s，收集种子。加入1 mL无菌水，振荡洗涤2min，重复2次，收集种子。加入1mL 2% 84消毒液，消毒种子10min，收集种子。加入1 mL无菌水，振荡洗涤2min，收集种子，重复5次。种子播种于含有Kana抗生素的MS培养基中。选取生长健壮，叶片绿色的拟南芥移载至培养基质中，置于拟南芥培养箱培养。采取相同方法进行抗性筛选直至T3代植株全部为绿色抗性植株，获得转基因拟南芥纯合植株。

对转基因拟南芥和未转基因拟南芥分别接种白粉病菌，接种 7~10 d 后，观测白粉病菌对拟南芥叶片的感染情况。

结果见图3，由图3可知：转基因拟南芥的白粉病发病率为2.1%，对照未转基因拟南芥的白粉病发病率为77.3%。

结果表明：过表达 CmVDAC基因可以提高拟南芥的白粉病抗性。

图3为过表达 CmVDAC基因拟南芥的白粉病发病率。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.与甜瓜白粉病抗性相关基因，其特征在于：所述基因为CmVDAC。

2.根据权利要求1所述的与甜瓜白粉病抗性相关基因，其特征在于：所述CmVDAC的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

3.根据权利要求1所述的与甜瓜白粉病抗性相关基因，其特征在于：所述CmVDAC的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1。

4.权利要求1-3任一项所述的与甜瓜白粉病抗性相关基因在制备白粉病抗性甜瓜中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为在甜瓜中过表达CmVDAC基因。

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