CN110862996B

CN110862996B - 一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用

Info

Publication number: CN110862996B
Application number: CN201911334194.8A
Authority: CN
Inventors: 郭晓黎; 杨超; 曾倩; 张磊
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN110862996A

Abstract

本发明属于生物学及基因工程相关技术领域，具体涉及一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用。本发明通过qRT‑PCR技术和GUS染色实验分析GmNIG1基因表达水平，发现GmNIG1基因在敏感品种W82和抗性品种PI88788受大豆孢囊线虫显著诱导，防御激素SA和JA处理后明显上调表达，将GmNIG1基因构建到过表达载体上，转入感病品种Williams 82中，发现过表达GmNIG1基因使大豆对大豆孢囊线虫抗性增加。GmNIG1基因在提高大豆对大豆孢囊线虫抗性利用方面具有新用途，为后续利用植物基因工程方法改良大豆的抗性、创造新的孢囊线虫抗性材料提供有效的基因资源。

Description

一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用

技术领域

本发明涉及生物学及基因工程相关技术领域，具体涉及一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用。

技术背景

大豆(Glycine max)是重要的经济作物之一，可用作蛋白质膳食、食用油及可再生燃料的重要来源。大豆起源于中国，在我国已有5000年左右的栽培历史。很遗憾的是我国大豆种植面积不断萎缩，国产大豆自给率严重不足，仅2018年进口大豆8803.1万吨，占进口粮食总量的比例超过80％，严重威胁到我国大豆产业。

大豆从种子萌发到开花结实过程中遭受各种病原物的侵袭，其中大豆孢囊线虫(Soybean Cyst Nematode,Heterodera glycines Ichinohe,SCN)是引起大豆产量损失的最严重病害之一。在我国主要分布在东北和黄淮海大豆种植区，经济损失达100亿元。大豆孢囊线虫的存在能够加重大豆猝死病的危害并引起更大的产量损失(Xing L et al.,Interaction of Fusarium solani f.sp.glycines and Heterodera glycines inSudden Death Syndrome of Soybean,Phytopathology,2006)，导致严重减产并造成较大经济损失。

目前针对SCN主要进行的化学防治尽管有效，但是成本较高，且对环境造成较大污染。因此，培育抗性品种是抗SCN的最经济环保方式。提高大豆对各种生物及非生物胁迫的抗性，达到增产目的迫在眉睫。传统的育种方法虽然取得了一定的进展，但由于大豆抗逆性状本身的复杂性及其与数量性状位点连锁关系的复杂性，使其常受到周期长、优异种质资源缺乏的制约，往往难以达到预期目标。随着分子生物学的发展和植物基因工程育种技术的成熟，应用基因工程方法改良大豆对生物和非生物胁迫的抗性成为可能。

对大豆孢囊线虫抗性基因的研究主要集中在数量性状位点候选基因的研究以及利用反向遗传学克隆关键的抗病基因。早期研究表明大豆对SCN抗性由两个主效位点Rhg1(Resistance to H.glycines)和Rhg4控制(Concibido et al.,Adecade of QTL mappingfor cyst nematode resistance in soybean,Crop Sci,2004)。rhg1-b位点包含3个与SCN抗性相关的基因，分别编码氨基酸转运蛋白、α-SNAP蛋白和损伤诱导蛋白，该位点拷贝数目变异介导了对孢囊线虫的抗性(Cook et al.,Copy number variation of multiplegenes at Rhg1 mediates nematode resistance in soybean,Science,2012)。Rhg4编码丝氨酸羟甲基转移酶(GmSHMT08)，抗感品种等位基因的区别在于两个氨基酸变化P130R和N358Y，改变其酶学特性，可能导致过敏反应及细胞死亡(Liu et al.,A soybean cystnematode resistance gene points to a new mechanism of plant resistance topathogens,Nature,2012)。另外通过反向遗传学方法人们发现大豆CLE受体GmCLV1和GmCLV2、水杨酸甲基转移酶(SAMT)、大豆WRKY转录因子以及氨基酸转运蛋白GmAAT等可以减少线虫侵染，增强对SCN的抗性(Guo et al.,Enhanced resistance to soybean cystnematode Heterodera glycines in transgenic soybean by silencing putative CLEreceptors,Plant Biotechnology Journal,2015；Lin et al.,Overexpression of asoybean salicylic acid methyltransferase gene confers resistance to soybeancystnematode,Plant Biotechnology Journal,2013；Yang et al.,Characterization ofSoybean WRKY Gene Family and Identification of Soybean WRKY Genes thatPromote Resistance to Soybean Cyst Nematode,Scientific Reports,2017；Guoetal.,The soybean Rhg1 amino acid transporter gene alters glutamate homeostasisand jasmonic acid-induced resistance to soybean cyst nematode,Molecular PlantPathology,2018)。这些新鉴定出的QTL和抗性基因对研究大豆抗SCN的分子机制和大豆抗病品种选育具有重要价值，为后续研究提供了方向。

发明内容

本发明的目的在于提供了一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用，所述的大豆基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白的核苷酸序列。

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现：

一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用，所述的大豆基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白的核苷酸序列；

以上所述的应用中，优选的，所述的大豆基因为SEQ ID NO.1所示；

以上所述的应用中，其应用过程为，将本发明涉及的分离在大豆中进行过表达，即可提高大豆对孢囊线虫的抗性。

在本发明中，将上述分离的大豆基因称为GmNIG1基因。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

大豆是重要的粮油作物，营养价值高，需求量大，在农产品贸易领域扮演着举足轻重的角色。大豆孢囊线虫(Soybean cyst nematode)是危害大豆生产的最严重的病害之一，制约着大豆生产，利用基因工程手段提高大豆孢囊线虫抗性成为一个具有重要研究价值的科学问题。本发明通过qRT-PCR技术和GUS染色实验发现GmNIG1基因受大豆孢囊线虫以及防御激素SA和JA显著诱导表达。通过构建该基因的过量表达载体，利用农杆菌介导将目的基因转入大豆根中进行过量表达，然后接种大豆孢囊线虫，转基因根在一定程度上具有抗大豆孢囊线虫的表型，为后续利用植物基因工程方法改良大豆的抗逆性、创造新的抗逆材料提供有效的基因资源。

附图说明

图1是本发明涉及到的报告基因表达载体和过表达载体示意图。

其中，图1中A为构建的GUS报告基因表达载体pSM101-GmNIG1p-GUS质粒图谱，B为构建的过表达载体pSM101-OEGmNIG1图谱。

图2为qRT-PCR检测GmNIG1基因在大豆品种Williams 82、PI88788和PI548402受大豆孢囊线虫侵染3天和5天前后的转录水平。

图中Mock代表阴性对照，R3-3dpi和R3-5dpi代表三个品种接种大豆孢囊线虫3天和5天时的转录水平。

图3为GmNIG1基因启动子在转基因大豆根组织中的GUS染色示意图。

其中图中5dpi、8dpi分别代表接种大豆孢囊线虫5天和8天；p代表启动子；Syn代表合胞体；N代表大豆孢囊线虫；标尺为200μm。

图4是本发明GmNIG1基因在敏感大豆品种Williams82和抗性大豆品种PI88788受SA、JA处理后表达变化。

其中图A代表来自Williams82的根组织，图B代表PI88788根组织材料

图5GmNIG1基因在敏感大豆品种Williams82中过量表达后接种大豆孢囊线虫的表型鉴定及基因表达量分析。

其中，图5的A、B中Control代表阴性对照(转化空载体的Williams 82)；B中1、2、3代表随机挑选的3条大豆Williams 82转基因阳性根。

图6GmNIG1基因在敏感大豆品种Williams82中过量表达后抗病相关基因表达量分析。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂，所用引物和序列测序均由北京奥科鼎盛生物技术有限公司完成。

实施例1：GmNIG1全长基因克隆

根据试剂盒说明，使用康为RNA提取试剂盒从大豆Williams 82植株根中提取总RNA并用琼脂糖凝胶电泳法检测RNA样品的质量，用Thermo分光光度计进行浓度测定。根据试剂盒说明，使用Vazyme公司的HiScriptII QRT SuperMix将总RNA转化为cDNA。从phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)上根据基因号查找对应基因CDS编码序列，设计引物以上述cDNA的为底物克隆GmNIG1全长CDS序列474bp(编码SEQ ID NO.2所示蛋白的核苷酸序列)并构建到pMD18-T载体上。扩增所用引物序列为：

GmNIG1-F：5'-TGgtcgacCTTATCATCACCATCATGGGTGTT-3'

GmNIG1-R：5'-AGtctagaGTTGTAATCAGGATTGGCCAAAA-3'

实施例2：qRT-PCR分析GmNIG1受线虫侵染的表达水平

通过qRT-PCR对GmNIG1基因的表达进行分析，提取受大豆孢囊线虫Race 3侵染3天和5天的三个大豆品种Williams 82、PI88788和PI548402及对照组(未被线虫侵染的生长3天和5天的大豆Williams 82、PI88788和PI548402)的根组织的RNA，反转录cDNA作为模板，以SKIP16基因作为内参照，分析GmNIG1的表达情况，具体实施步骤如下：

1)分别挑选大小一致的Williams 82、PI88788和PI548402大豆约20粒，在萌发纸上生长4d；

2)挑选根长度一致的苗，在根尖1cm处接种约250头大豆孢囊线虫Race 3二龄幼虫，每个处理三个重复，接种3d、5d后取材侵染部位上下1.5cm；

3)根据试剂盒说明，使用康为RNA提取试剂盒提取总RNA并用琼脂糖凝胶电泳法检测RNA样品的质量，用Thermo分光光度计进行浓度测定。根据试剂盒说明，使用Vazyme公司的HiScriptII QRT SuperMix将总RNA转化为cDNA；

4)得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测GmNIG1基因的表达量(试剂购自Vazyme公司，反应体系参见说明书)。qRT-RCR检测所用引物序列为：

qGmNIG1-F：5'-AGTGGCAAAGCCAAGGGTG-3'

qGmNIG1-R：5'-GCACACTGGATAATAAGCAAGCACT-3'

qRT-PCR结果如图2所示：在三个品种中，GmNIG1基因表达水平在受SCN侵染大豆中显著升高，且随着侵染天数增加基因表达量上升；在抗感病品种之间，大部分基因在抗性品种中的表达量高，并且在PI548402的表达水平最高。

实施例3：GmNIG1启动子GUS表达载体的构建以及转基因大豆根组织染色

1)从phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)上查找GmNIG1基因的上游启动子片段1997bp的DNA序列，设计引物扩增启动子序列，所用引物序列为:

GmNIG1p-F：5'-TGaagcttGTTCTTGTCACTACAATGAGTGCCA-3'

GmNIG1p-R：5'-ACgtcgacGATGGTGATGATAAGGGGAAATTAAC-3'

2)通过CTAB法提取大豆全基因组为模板，利用KOD FX高保真酶克隆GmNIG1基因的启动子，连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α；

3)利用Hind III和Sal I酶切目的片段和pSM101-GUS双元表达载体，通过T4连接酶将连接后转入大肠杆菌DH5α中。菌落检验正确后获得阳性表达载体pSM101-GmNIG1p-GUS(图1中A)。提质粒通过电转化的方法转化发根农杆菌K599中；

4)利用发根农杆菌K599通过伤口侵染无菌大豆子叶，转化到感病品种Williams82和PI548402中；

5)在得到的阳性转基因大豆根部距离根尖1cm处接种大豆孢囊线虫二龄幼虫320条，线虫接种5d、8d后，将毛根取出置于六孔板中，每孔放置5-6根，加入GUS染色液至浸没根组织，混匀后置于真空泵中，抽真空10min，分5min抽一次。于37℃保温16-24h，换70％乙醇脱色24h后即可在体视镜下观察照相。

GUS染色结果如图3所示：在抗感品种中，GUS在线虫取食位点高度表达，表明GmNIG1基因的启动子在线虫侵染位点高度诱导表达。

实施例4：GmNIG1基因受防御激素诱导上调表达

1)分别挑选大小一致的Williams 82和PI88788大豆约60粒，在萌发纸上生长4d；

2)挑选根长度一致的苗，将根浸没在浓度为100μM茉莉酮酸酯(JA)和100μM水杨酸(SA)水溶液中，分别处理0h、6h、12h、24h，每个处理各三条根，各时间点取样用液氮速冻；

3)根据试剂盒说明，使用康为RNA提取试剂盒从大豆根中提取总RNA并用琼脂糖凝胶电泳法检测RNA样品的质量，用Thermo分光光度计进行浓度测定。根据试剂盒说明，使用Vazyme公司的HiScriptII QRT SuperMix将总RNA转化为cDNA；

4)得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测GmNIG1的表达量(试剂购自Vazyme公司，反应体系参见说明书)。qRT-RCR检测所用引物序列同实施例2。

qRT-PCR结果如图4和图5所示：在敏感品种Williams 82中，水杨酸处理使GmNIG1基因在12h时明显上调表达，茉莉酸处理使GmNIG1基因在12h时有较弱上调；在抗性品种PI88788中，水杨酸处理使GmNIG1基因在12h时明显上调表达，茉莉酸处理使GmNIG1基因在12h、24h持续明显上调表达。

实施例5：植物过表达载体构建

将GmNIG1基因CDS区474bp的编码序列(SEQ ID NO.1所示序列的第79到555位碱基)克隆到pMD18-T载体中，利用Sal I和XbaI酶切位点连入pSM101载体得到目的基因过表达载体pSM101-OEGmNIG1(图1中B)。

所用构建载体的引物同实施例1，具体步骤如下：

1)利用KOD FX高保真酶克隆得到GmNIG1的CDS片段，连接到pMD18-T载体上，利用SalI和XbaI酶酶切扩增片段并线性化过表达载体pSM101，通过T4 DNA连接酶连入载体中；

2)连接产物通过热激转化的方法导入大肠杆菌DH5α，在含有50mg/ml卡那霉素的LB抗性培养基上涂皿培养；

3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入4ml含50mg/ml卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时，抽提质粒，用对应的限制性内切酶酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的过表达载体pSM101-OEGmNIG1。

实施例6：转基因大豆表型鉴定及基因表达量检测

1)将过表达载体pSM101-OEGmNIG1通过电击转化的方法导入发根农杆菌K599菌株中；

2)将过表达载体pSM101-OEGmNIG1用发根农杆菌K599通过伤口侵染无菌大豆子叶，转化到感病品种Williams82中；

3)在得到的阳性转基因大豆根部距离根尖1cm处接种大豆孢囊线虫二龄幼虫320条，无菌环境中培养基培养25-30天后，在体式镜下统计根部形成的孢囊数目，以转化空载质粒pSM101的相应大豆品种为对照，每个转基因毛根数量必须保证15-40条以符合统计学分析，进行三次生物学重复。利用统计学方法计算每个转基因根的孢囊的平均数，利用STDEV公式计算方差、T.TEST公式计算显著性系数p值。如图5所示，其中1、2、3代表转基因不同阳性根。“*”代表差异显著，P<0.05；“**”代表差异极显著，P<0.01。

结果如图5中A所示，与对照相比敏感品种Williams82中过表达GmNIG1后胞囊数目显著减少，表明过表达根系抗性增强。

4)为了检测过表达转基因根中GmNIG1基因以及抗病相关基因PR1、PR4的表达量，采用qRT-RCR的方法对转基因大豆根进行了表达分析。抽提大豆阳性根的总RNA，RNA抽提用的试剂是采用康为世纪公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；使用Vazyme公司的HiScriptII QRT SuperMix将总RNA转化为cDNA，得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测GmNIG1和PR1、PR4等基因的表达量(试剂购自Vazyme公司，反应体系参见说明书)。qRT-RCR检测所用引物序列为：

qPR1-F：5'-ATGGGGTTGTGCAAGGTTTCATT-3'

qPR1-R：5'-ACACCCACCTCTGATCTTGCA-3'

qPR4-F：5'-ATGCGGAGCGGCTTAAGATTG-3'

qPR4-R：5'-TGGCAGTGACCAAGTTCCAACC-3'

qRT-PCR结果如图5中B和图6中所示：在转基因根系中，过表达根OE-GmNIG1：1-3中NIG1有不同程度的过表达，转基因根系的过表达效果好；抗病相关基因PR1和PR4的表达量在转基因根系中表达量上升。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 764

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acacaaggca aaaatcctct tagtttcaca caagcaattt cactatcctt gtgttaattt 60

ccccttatca tcaccatcat gggtgttttt actttcgagg atgagaccac ctctactgta 120

gctccagcta ggctttacaa agctttggtt aaggatgctg ataacctcgt cccaaaggca 180

gttgaggcca tcaagagtgt tgaaatcgtt gaaggaaatg gtggccccgg aaccattaaa 240

aagctcactt ttgttgagga tgggcaaacc aagtacgtgt tgcacaaagt tgaagcaatt 300

gatgaggcta attggggata caactacagc gttgttgggg gtgtggggtt gccagacaca 360

gtggagaaga tctcatttga ggccaaattg gttgcagatc ccaatggagg gtccattgca 420

aaaatcactg tcaaatacca gaccaaaggc gatgctaatc ccagtgaaga ggaactcaag 480

agtggcaaag ccaagggtga tgctcttttc aaggcacttg agggctatgt tttggccaat 540

cctgattaca actaaataaa gactatagcc aaaccaagtg cttgcttatt atccagtgtg 600

cttaatttgg ttgccaatgt aataatgctc cttttccttt tatagaggaa gtgtgagatt 660

ccattacatg tgtatctcac ttcatcaata aattatgatg acaaaacatg ttatcagtat 720

catctaaaat aagttttatg tttaaggacc aaggtgttta atct 764

<210> 2

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Val Phe Thr Phe Glu Asp Glu Thr Thr Ser Thr Val Ala Pro

1 5 10 15

Ala Arg Leu Tyr Lys Ala Leu Val Lys Asp Ala Asp Asn Leu Val Pro

20 25 30

Lys Ala Val Glu Ala Ile Lys Ser Val Glu Ile Val Glu Gly Asn Gly

35 40 45

Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Leu Thr Phe Val Glu Asp Gly Gln Thr

50 55 60

Lys Tyr Val Leu His Lys Val Glu Ala Ile Asp Glu Ala Asn Trp Gly

65 70 75 80

Tyr Asn Tyr Ser Val Val Gly Gly Val Gly Leu Pro Asp Thr Val Glu

85 90 95

Lys Ile Ser Phe Glu Ala Lys Leu Val Ala Asp Pro Asn Gly Gly Ser

100 105 110

Ile Ala Lys Ile Thr Val Lys Tyr Gln Thr Lys Gly Asp Ala Asn Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Glu Leu Lys Ser Gly Lys Ala Lys Gly Asp Ala Leu Phe

130 135 140

Lys Ala Leu Glu Gly Tyr Val Leu Ala Asn Pro Asp Tyr Asn

145 150 155

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggtcgacct tatcatcacc atcatgggtg tt 32

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtctagagt tgtaatcagg attggccaaa a 31

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtggcaaag ccaagggtg 19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcacactgga taataagcaa gcact 25

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaagcttgt tcttgtcact acaatgagtg cca 33

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgtcgacga tggtgatgat aaggggaaat taac 34

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggggttgt gcaaggtttc att 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acacccacct ctgatcttgc a 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgcggagcg gcttaagatt g 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggcagtgac caagttccaa cc 22

Claims

1.一段分离的大豆基因在提高大豆孢囊线虫抗性中的应用，所述的大豆基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白的核苷酸序列。