CN111424049B - 基因TaPT13在提高植物对白粉菌抗性方面的应用 - Google Patents

基因TaPT13在提高植物对白粉菌抗性方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物领域,具体涉及基因TaPT13在提高植物对白粉菌抗性方面的应用。本发明的丛枝菌根特异的磷转运蛋白基因TaPT13可用于提高植物抗病性,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明确定TaPT13基因为一种丛枝菌根特异的磷转运蛋白基因,在植株接种白粉菌后,TaPT13基因表达量显著提高;而植株中沉默TaPT13基因后,植物的感病性增加,且抗病标志基因表达量下降。因此,TaPT13基因可用于提高小麦对白粉菌抗性,在植物育种、栽培具有广阔的应用空间。

Description

基因TaPT13在提高植物对白粉菌抗性方面的应用
技术领域
本发明属于农业生物领域,具体涉及基因TaPT13在提高植物对白粉菌抗性方面的应用。
背景技术
磷是植物生长发育所必需的第二大元素,它广泛参与了能量的转移、信号转导、大分子的生物合成、光合作用以及调控呼吸和其他的代谢过程,对植物生长具有重 要作用。磷在土壤中主要以复合体、不溶物及有机形式存在,而植物主要以无机磷 形式获取磷,因而土壤中的磷难以被植物吸收利用。植物应对低磷环境的胁迫进化 出了一系列有效的策略来促进磷的吸收和利用,包括改变根系结构、根系分泌有机 酸和磷酸酶、改变生物膜结构及代谢途径,以及与丛枝菌根建立共生关系促进磷的 吸收等。
丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)是自然界中最古老且分布最广泛的植物共生体。作为活体共生菌,AM真菌从植物体内吸收碳源维持自身的生长,同时AM 真菌促进植物吸收矿质元素,植物根系获取的磷几乎都是通过菌根吸收。AM真菌 促进植物对磷的吸收和利用有以下三个原因:第一,菌根的根外菌丝扩大了磷的吸 收范围;第二,AM真菌在生长过程中可分泌质子和酸性磷酸酶,加快土壤中有机磷 的酸化,提高有机磷的含量;第三,AM真菌在低磷条件下激发了菌根特异性植物高 亲和力磷转运蛋白的表达,从而提高植物对磷的吸收。
植物为了适应低磷的环境,进化出了低亲和力磷转运系统和高亲和力磷转运系统。低亲和力转运蛋白在高磷浓度时发挥作用,高亲和力转运蛋白在低磷浓度时发 挥作用,已发现的磷转运蛋白基因主要分为4个家族:PHT1、PHT2、PHT3、PHT4。 PHT2、PHT3和PHT4的大部分家族成员为低亲和力磷转运蛋白,而PHT1大部分成 员为高亲和力转运蛋白。目前,通过基因组测序和同源基因克隆的方法,已分离鉴 定出多个PHT1蛋白。拟南芥的PHT1家族包括9个成员。在番茄、土豆、辣椒和茄 子等茄科植物也分别已经分离到了5个成员,PHT1;3受菌根诱导增强表达,PHT1; 4和PHT1;5是菌根特异的磷转运蛋白基因,马铃薯的StPT3在菌根共生的根系表达 量显著升高,该基因是第一个被克隆并进行功能验证的菌根诱导磷转运蛋白。在单 子叶模式植物水稻的13个PHT1家族成员中,OsPT11是第一个鉴定的菌根特异磷 转运蛋白,主要在丛枝细胞中表达且蛋白定位在围丛枝膜上;OsPT13是菌根诱导的 磷转运蛋白,它参与了菌根共生水稻磷的吸收。双子叶植物苜蓿中发现了OsPT11的同源基因MtPT4,它定位在围丛枝膜上,是AM共生所必需的。
以往对磷转运蛋白的研究主要集中在植物对无机磷酸盐的吸收和再分配中的作用,磷转运蛋白在植物防御中的作用鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因TaPT13的应用。
本发明的再一目的在于提供蛋白TaPT13的应用。
根据本发明具体实施方式的丛枝菌根特异的磷转运蛋白基因TaPT13的应用,其可提高植物抗病性,尤其是提高小麦对白粉菌抗性,并且还能够同时促进小麦对磷 的高效吸收。
根据本发明具体实施方式的基因TaPT13,其为植物丛枝菌根特异的磷转运蛋白,来源于普通面包小麦(Triticum aestivum),在NCBI的Genbank中登录号为 KX130942.1,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示:
ATGCCATGGCGGCAGCCAACACAGGCATTGATGGCACGGAAGCAGCTCAA GGTGCTCCATGCCCTCGACATTGCGACGACGCAGGTGTACCACTTCACCGCCAT CGCAATCGCCGGCATGGGCTTCTTCACTGATGCCTACGACCTCTTCTCCATTTCC CTCGTCACCGACCTCCTCGGCCGCATTTACTACACGGACGGTGTCCTCCCTGTC GGCGTCTCGGCGCTTGTCAACGGTGTTGCACTATGCGGCACGGTGGTCGGGCA GCTCTTCTTCGGATGGCTCGGCGACAAGGTGGGCCGGCGGCACATCTATGGTGT CACCCTGAAGCTCATGGTCATCTGCTCCATCGCCTCCGGCCTCTCCTTCCACCG TTCACGCAAGAGCGTCATTACCACGCTCTGTTTTTTTCGTTTTTGGCTTGGCTTT GGCATCGGTGGCGACTATCCACTCTCCGCTACGATCATGGCGGAGTACGCAAAT AAGAAGACTCGTGGCGCCTTCATTGCCGCTGTATTCGCCATGCAGGGTCTAGGA AATCTTGCTGCTGGAATAGTTGCCATAATCGTCTCACAGTCATTCAAGCATGCAC CAGGATATGACCATGACCCACACTGGCACGCTGACTATGTGTGGCGTATAATTC TCATGGTAGGCGCCATCCCTGCTATCCTGACTTATTATTGGCGCATGAGGATGCC CGAGACGGCACGCTTTACGGCGCTCATAGCTAAGGACATCAAGAAAGCTTCTT CAAACATGGCCTTGGTCCTTAACATCGACATCGTGGCTGAAATAGAAGAGGCT GATGTGTTCAACAGAGAGCATGAGTTTGGTTTCTTCACCATGGAGTTCGTCCAT CGACATGGCCTCCACCTCCTTAGCACCATGATCTGTTGGTTTATGCTTGACATGT CATTTTACCTGCTCAACCTGTTCATGAAGAACATCTTTACCGAAGTTCGATTCAT CAAAGATGCAAGCACAATGAGCCCGCTTGACCAAACATACAACATAGCAAGAA CCCAAGCTCTCATTACCGTCATTGGCACGTTGCCGGGCTTCTTCTTTGCAGTCA AGTTCATGGACAGAATTGGTCGAATCAAGATGCAAATTGTAGGATTCATTATGAT GAGCGTCTTCATGCTCGGGCTTGCTATTCCACAAGTGTTATCGAAAACGATATGGTATTCTCGCTACGGGAACATCTACTTCATTGTCATTTACTCGGCAATAATGTTCT TCACTGACTTCGGCCCCAACTCGACCACTTTCATCCTTCCAGCAGAGATCTTCC CAGCACGTATGCGGTCAACATGCCACGGCATAGCCGGTGCTGGCGGGAAGGGT GGTGCTATCACTGGTGTGCTTTGGTTCCTATATGCCAATAAAGGTCTCCCAATTA TTCTCTTCGTGCTAGTTGGTTGCAACATAATTGGCTTGGTGTTCACGCTCATCTT ACCAGAAACCAAAAAGAGGTCCCTTGAAGAGGTCACTGGTGAAAGAGGAAAT GATGAGGACCAGGGAGGTTTTTCTCTTGTGAGAACACCTCTATTTACTATATAG
磷转运蛋白基因TaPT13编码的蛋白质,其氨基酸序列为SEQ ID NO.2:
MPWRQPTQALMARKQLKVLHALDIATTQVYHFTAIAIAGMGFFTDAYDLFSI SLVTDLLGRIYYTDGVLPVGVSALVNGVALCGTVVGQLFFGWLGDKVGRRHIYG VTLKLMVICSIASGLSFHRSRKSVITTLCFFRFWLGFGIGGDYPLSATIMAEYANKK TRGAFIAAVFAMQGLGNLAAGIVAIIVSQSFKHAPGYDHDPHWHADYVWRIILMVGAIPAILTYYWRMRMPETARFTALIAKDIKKASSNMALVLNIDIVAEIEEADVFNRE HEFGFFTMEFVHRHGLHLLSTMICWFMLDMSFYLLNLFMKNIFTEVRFIKDASTM SPLDQTYNIARTQALITVIGTLPGFFFAVKFMDRIGRIKMQIVGFIMMSVFMLGLAIP QVLSKTIWYSRYGNIYFIVIYSAIMFFTDFGPNSTTFILPAEIFPARMRSTCHGIAGA GGKGGAITGVLWFLYANKGLPIILFVLVGCNIIGLVFTLILPETKKRSLEEVTGERGNDEDQGGFSLVRTPLFTI
本发明确定TaPT13基因为一种丛枝菌根特异的磷转运蛋白基因,在植株接种白粉菌后,TaPT13基因表达量显著提高;而植株中沉默TaPT13基因后,植物的感病 性增加,且抗病标志基因表达量下降。所述植物为禾本科植物,包括小麦、水稻、 玉米、大麦或高粱等。因此,TaPT13基因可用于提高小麦对白粉病的抗性,在植物 育种、栽培中具有广阔的应用空间。
附图说明
图1显示在不同磷浓度下野生型小麦根系与丛枝菌根共生后TaPT13基因的表达量分析情况;
图2显示沉默TaPT13基因增强了白粉菌的感病性;A和B分别为对照植株和TaPT13-VIGS沉默植株接种白粉菌发病部位的显微分析;C为对照植株和 TaPT13-VIGS沉默植株接种白粉菌发病部位的表型分析;
图3显示TaPT13基因和抗病标志基因的表达量变化情况;A为对照植株和 TaPT13-VIGS沉默植株的根和叶中TaPT13基因的表达量变化;B为对照植株和 TaPT13-VIGS沉默植株中抗病标志基因的表达量变化。
具体实施方式
植物材料和病原菌培养
供试的小麦品种为周麦26;AM真菌为摩西球囊霉(Glomus mosseae,GM)和地表 球囊霉(Glomus versiforme,GV);病原菌为白粉菌。
载体:烟草脆裂病毒诱导基因沉默的pYL156载体。
将小麦种子置于放有吸水纸的培养皿上,加入适量蒸馏水,4℃春化处理1w, 然后将其放入25℃恒温光照培养箱中,光/暗周期:16h/8h,生长至三叶期。
摩西球囊霉和地表球囊霉在宿主植物苜蓿和三叶草中培养生长。
白粉菌培养在感病小麦周麦22上,在光照培养箱中培养(光周期16h/8h,温 度22℃/20℃,湿度80%)。
实施例1
1.1菌根及低磷处理
将三叶期小麦移植到分别加摩西球囊霉和地表球囊霉两种菌根的细沙、蛭石与珍珠岩1:1:1比例混合的培养基质中,菌根接种量为200个孢子/15g。在光周期 为16h/8h,温度为18℃/15℃的光照培养箱中生长,所有接种和对照植株每周浇 两次1/2的Hoagland营养液、5μM KH2PO4低磷处理、500μM KH2PO4高磷处理,6 w后取小麦根部,清水洗净,收获根部样本,液氮速冻后-80℃保存备用。
将菌根及低磷处理、高磷处理的样品采用TRIzol Reagent(invitrogen)分别提取总RNA。
以1μg总的RNA做模板,利用cDNA合成试剂盒合成第一链cDNA,并将提 取的RNA反转录为cDNA。
以上述不同处理材料的cDNA为模板,进行实时定量PCR反应。用相对定量 2-ΔΔCt法对表达量进行相对定量分析,以小麦的Actin(Gene Bank登录号KC775780) 基因作为参照基因。
TaPht-myc为已知的丛枝菌根特异的小麦磷转运蛋白,在不接种菌根时,几乎不表达,接种菌根后表达量显著升高。与TaPht-myc类似,在低磷没有菌根共生的条件 下(-P-M),TaPT13和TaPht-myc基因表达受到抑制,在不同磷浓度下接种摩西球囊 霉和地表球囊霉两种不同菌根后表达量显著升高,如图1所示,特别是在低磷条件 下(-P+GM和-P+GV)表达显著高于TaPht-myc对照基因,与对照相比,TaPT13基 因表达量升高了约120-160倍,因此,将TaPT13确定为丛枝菌根特异的小麦磷转 运蛋白基因。
1.2白粉菌的处理
白粉菌的接种方法采用叶片-叶片对接法,在周麦26小麦叶片上接种白粉菌后的0、24、48、60、72h取其叶片,液氮速冻后-80℃保存备用。
取上述样本进行实时qRT-PCR反应分析,同时以病原相关蛋白TaPR4A和 TaPR4B为标志基因。
在小麦叶片接种白粉菌后,抗病标志基因TaPR4A和TaPR4B在白粉菌侵染48h 后表达量均达到第一个高峰,表达量约是对照植株的20倍和16倍,之后表达量下 降,在侵染72h时表达量达到最高峰,TaPR4A和TaPR4B表达量提高了约22倍和 18倍,均达到了极显著的差异,表明白粉菌成功侵染了小麦叶片;同时,TaPT13基 因表达量在白粉菌侵染48h达到最高峰。
实施例2TRV病毒介导的TaPT13-VIGS植株的功能分析
以TaPT13基因全长为模板,根据TRV病毒载体pYL156的载体特点,选用EcoR I和BamH I位点构建至pYL156中,将重组载体pYL156-TaPT13和空载pYL156转 化到农杆菌GV3101(阴性对照)中,利用刚发芽的小麦种子抽提转化TRV载体实 现整株小麦的沉默。
取TaPT13-VIGS和对照植株生长16d后的叶片,放置于添加85μM苯并咪唑的 1%琼脂板上,将平板放置于20℃的气候培养箱中孵育4h,然后采用抖落法以适当 的密度(约250个分生孢子/cm2)轻轻摇动白粉菌新鲜分生孢子接种到叶片上,分别 进行接种白粉菌60h和7d取样。TaPT13-VIGS和对照植株叶片在22℃的气候培养 箱中培养60h后,将叶段在脱色液(乙醇/乙酸=1:1(v/v))中脱色12h,之后在考马 斯亮蓝R250染液(0.6%,w/v,溶于甲醇)中染色10s,在去离子水冲洗数次后置 于BX61显微镜下观察微菌落数指数(每个植株叶片上萌发的孢子大于1000)。同 时,用Canon EOS 600D对接种Bgt 7dpi的叶片表型进行观察拍照。
在TaPT13-VIGS和对照植株的叶片接种白粉菌60h后,显微镜下观察发现 TaPT13-VIGS沉默植株叶片上的白粉菌的菌丝数明显多于对照植株叶片,如图2中 A所示,对微菌落指数统计分析发现,TaPT13-VIGS沉默植株显著高于对照植株, 如图2中B所示,与显微观察结果一致,接种白粉菌7d后的表型分析表明 TaPT13-VIGS沉默植株叶片上的白色白粉菌丝多于对照植株,如图2中C所示。
为进一步分析TaPT13-VIGS沉默植株中TaPT13和抗病标志基因的表达变化, 提取TaPT13-VIGS不同株系的RNA,利用荧光定量PCR试验分析TaPT13和TaPR4A、 TaPR4B的表达量变化,参照基因选用小麦的TaActin基因。定量PCR,每次定量实 验中每个模板进行三次同步扩增与检测,且进行三次生物学重复,引物序列如下:
TaPT13-F:5’-AGCCAACACAGGCATTGA-3’,
TaPT13-R:5’-GAAGAGGTCGTAGGCATCAGT-3’;
TaPR4A-F:5’-CGTCTTCACCAAGATCGACA-3’,
TaPR4A-R:5’-GGCAGTCGACGAACTGGTA-3’;
TaPR4B-F:5’-CTTCACCAAGATCGACACCA-3’,
TaPR4B-R:5’-AGCAAGCTAGCCTTTGATCG-3’;
TaActin-F:5’-CCAGGTATCGCTGACCGTAT-3’,
TaActin-R:5’-GCTGAGTGAGGCTAGGATGG-3’。
如图3中A、B所示,荧光定量PCR结果表明,TaPT13-VIGS沉默植株的根和 叶中TaPT13基因的表达量显著低于对照植株,说明由TRV病毒可介导实现小麦全 株的沉默,且抗病标志基因TaPR4A和TaPR4B的表达量在TaPT13-VIGS沉默植株 中的表达量也明显低于对照植株,该结果与表型和显微观察结果一致,感病性增强 的植株中抗病标志基因表达量下降。
实施例3在拟南芥中过表达TaPT13的功能分析
为进一步分析TaPT13的功能,克隆TaPT13的全长构建至以35S启动子启动的 植物载体CTAPi-GW-3HA中,获得过表达重组载体CTAPi-GW-3HA-TaPT13,分别 将重组载体和空载体通过热激法转化农杆菌GV3101,通过蘸花方法将重组载体和空 载体转化至哥伦比亚生态型(Col-0)的拟南芥,经过筛选获得7个单拷贝纯合的转 基因株系,在野生型拟南芥和转基因植株根系同时接种拟南芥白粉菌。
结果发现,与野生型和转化空载体的转基因植株相比,过表达TaPT13的7个转 基因株系对拟南芥白粉菌抗性均明显增强,与其在小麦中沉默的结果一致,表明 TaPT13是白粉菌的正调控因子。
序列表
<110> 河南科技学院
<120> 基因TaPT13在提高植物对白粉菌抗性方面的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1566
<212> DNA
<213> 面包小麦(Triticum aestivum)
<400> 1
atgccatggc ggcagccaac acaggcattg atggcacgga agcagctcaa ggtgctccat 60
gccctcgaca ttgcgacgac gcaggtgtac cacttcaccg ccatcgcaat cgccggcatg 120
ggcttcttca ctgatgccta cgacctcttc tccatttccc tcgtcaccga cctcctcggc 180
cgcatttact acacggacgg tgtcctccct gtcggcgtct cggcgcttgt caacggtgtt 240
gcactatgcg gcacggtggt cgggcagctc ttcttcggat ggctcggcga caaggtgggc 300
cggcggcaca tctatggtgt caccctgaag ctcatggtca tctgctccat cgcctccggc 360
ctctccttcc accgttcacg caagagcgtc attaccacgc tctgtttttt tcgtttttgg 420
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cttgctgctg gaatagttgc cataatcgtc tcacagtcat tcaagcatgc accaggatat 600
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gcgctcatag ctaaggacat caagaaagct tcttcaaaca tggccttggt ccttaacatc 780
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ttcatgctcg ggcttgctat tccacaagtg ttatcgaaaa cgatatggta ttctcgctac 1200
gggaacatct acttcattgt catttactcg gcaataatgt tcttcactga cttcggcccc 1260
aactcgacca ctttcatcct tccagcagag atcttcccag cacgtatgcg gtcaacatgc 1320
cacggcatag ccggtgctgg cgggaagggt ggtgctatca ctggtgtgct ttggttccta 1380
tatgccaata aaggtctccc aattattctc ttcgtgctag ttggttgcaa cataattggc 1440
ttggtgttca cgctcatctt accagaaacc aaaaagaggt cccttgaaga ggtcactggt 1500
gaaagaggaa atgatgagga ccagggaggt ttttctcttg tgagaacacc tctatttact 1560
atatag 1566
<210> 2
<211> 521
<212> PRT
<213> 面包小麦(Triticum aestivum)
<400> 2
Met Pro Trp Arg Gln Pro Thr Gln Ala Leu Met Ala Arg Lys Gln Leu
1 5 10 15
Lys Val Leu His Ala Leu Asp Ile Ala Thr Thr Gln Val Tyr His Phe
20 25 30
Thr Ala Ile Ala Ile Ala Gly Met Gly Phe Phe Thr Asp Ala Tyr Asp
35 40 45
Leu Phe Ser Ile Ser Leu Val Thr Asp Leu Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr
50 55 60
Thr Asp Gly Val Leu Pro Val Gly Val Ser Ala Leu Val Asn Gly Val
65 70 75 80
Ala Leu Cys Gly Thr Val Val Gly Gln Leu Phe Phe Gly Trp Leu Gly
85 90 95
Asp Lys Val Gly Arg Arg His Ile Tyr Gly Val Thr Leu Lys Leu Met
100 105 110
Val Ile Cys Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ser Phe His Arg Ser Arg Lys
115 120 125
Ser Val Ile Thr Thr Leu Cys Phe Phe Arg Phe Trp Leu Gly Phe Gly
130 135 140
Ile Gly Gly Asp Tyr Pro Leu Ser Ala Thr Ile Met Ala Glu Tyr Ala
145 150 155 160
Asn Lys Lys Thr Arg Gly Ala Phe Ile Ala Ala Val Phe Ala Met Gln
165 170 175
Gly Leu Gly Asn Leu Ala Ala Gly Ile Val Ala Ile Ile Val Ser Gln
180 185 190
Ser Phe Lys His Ala Pro Gly Tyr Asp His Asp Pro His Trp His Ala
195 200 205
Asp Tyr Val Trp Arg Ile Ile Leu Met Val Gly Ala Ile Pro Ala Ile
210 215 220
Leu Thr Tyr Tyr Trp Arg Met Arg Met Pro Glu Thr Ala Arg Phe Thr
225 230 235 240
Ala Leu Ile Ala Lys Asp Ile Lys Lys Ala Ser Ser Asn Met Ala Leu
245 250 255
Val Leu Asn Ile Asp Ile Val Ala Glu Ile Glu Glu Ala Asp Val Phe
260 265 270
Asn Arg Glu His Glu Phe Gly Phe Phe Thr Met Glu Phe Val His Arg
275 280 285
His Gly Leu His Leu Leu Ser Thr Met Ile Cys Trp Phe Met Leu Asp
290 295 300
Met Ser Phe Tyr Leu Leu Asn Leu Phe Met Lys Asn Ile Phe Thr Glu
305 310 315 320
Val Arg Phe Ile Lys Asp Ala Ser Thr Met Ser Pro Leu Asp Gln Thr
325 330 335
Tyr Asn Ile Ala Arg Thr Gln Ala Leu Ile Thr Val Ile Gly Thr Leu
340 345 350
Pro Gly Phe Phe Phe Ala Val Lys Phe Met Asp Arg Ile Gly Arg Ile
355 360 365
Lys Met Gln Ile Val Gly Phe Ile Met Met Ser Val Phe Met Leu Gly
370 375 380
Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ser Lys Thr Ile Trp Tyr Ser Arg Tyr
385 390 395 400
Gly Asn Ile Tyr Phe Ile Val Ile Tyr Ser Ala Ile Met Phe Phe Thr
405 410 415
Asp Phe Gly Pro Asn Ser Thr Thr Phe Ile Leu Pro Ala Glu Ile Phe
420 425 430
Pro Ala Arg Met Arg Ser Thr Cys His Gly Ile Ala Gly Ala Gly Gly
435 440 445
Lys Gly Gly Ala Ile Thr Gly Val Leu Trp Phe Leu Tyr Ala Asn Lys
450 455 460
Gly Leu Pro Ile Ile Leu Phe Val Leu Val Gly Cys Asn Ile Ile Gly
465 470 475 480
Leu Val Phe Thr Leu Ile Leu Pro Glu Thr Lys Lys Arg Ser Leu Glu
485 490 495
Glu Val Thr Gly Glu Arg Gly Asn Asp Glu Asp Gln Gly Gly Phe Ser
500 505 510
Leu Val Arg Thr Pro Leu Phe Thr Ile
515 520

Claims (2)

1.基因TaPT13在提高植物对白粉菌抗性方面的应用,其中,所述基因TaPT13编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质,所述植物为小麦或拟南芥。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述基因TaPT13的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
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Triticum aestivum cultivar Zhoumai 26 phosphate transporter 13 mRNA, complete cds,GenBank: KX130942.1;Zhang,Y.;《Genbank》;20161224;序列表 *
Zhang,Y..Triticum aestivum cultivar Zhoumai 26 phosphate transporter 13 mRNA, complete cds,GenBank: KX130942.1.《Genbank》.2016,序列表. *

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