CN110093353B - 一种普通野生稻芽期耐冷相关编码基因及其应用 - Google Patents

一种普通野生稻芽期耐冷相关编码基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种普通野生稻芽期耐冷相关编码基因，所述普通野生稻芽期耐冷相关编码基因名称为WRCT‑1，所述普通野生稻芽期耐冷相关编码基因WRCT‑1在调控水稻在遭遇低温下的发芽率中的应用，或在培育芽期耐冷的转基因水稻中的应用。本发明首次鉴定了与普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT‑1，普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT‑1在功能增强或表达量上升的条件下水稻芽期具备耐冷特性，证明普通野生稻芽期耐冷相关基因蛋白或其蛋白在控制水稻芽期耐冷中发挥重要作用。

Description

一种普通野生稻芽期耐冷相关编码基因及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种普通野生稻芽期耐冷相关编码基因及其应用。
背景技术
水稻是人类最重要的粮食作物之一，世界上以稻米为主食的人口约占50％。亚洲地区对稻米的需求量逐年增加，由于经济快速发展、人口压力增大、工业用地剧增、耕地面积减少，水稻生产面临巨大的压力。因此持续提高和挖掘水稻的高产潜力，是科学家们的主要研究方向。水稻芽期耐冷与品质、产量有着密切的关系。
低温是影响水稻产量的一个重要限制因子，水稻在芽期对低温敏感，粳稻和籼稻分别在15℃和18℃以下就发生冷害。水稻在芽期遭受冷害，会引起水稻种子萌发受到阻碍，生长点停止生长，长期的低温会导致种子的死亡，高纬度和高海拔地区播种期温度，使得许多品种的推广都受到了限制。
野生稻在复杂的自然环境中生长，蕴含着大量优异基因，在广西桂林北部生长的野生稻，能够在零下温度正常越冬、发芽、生长，蕴含着大量耐冷基因。近年来，使用分子生物学方法克隆水稻芽期耐冷基因成为研究的热点，克隆的野生稻芽期耐冷基因对水稻抗逆性改良有着重要的理论和现实指导意义。
水稻耐冷机制尚未得到深入和系统研究，前人通过正向克隆获得4个基因，分别是qLTG3-1，COLD1，LTG1,LTT7,ctb1，CTB4a，4个耐冷基因广泛参与了信号转导的过程。Fujino克隆了其中一个QTL qLTG3-1，该基因在胚中表达，编码一个未知蛋白；Liu等利用强耐冷材料IL112和冷敏感材料桂朝2号进行杂交，在后代群体中定位了7个耐冷QTL，结合表达谱分析，获得了一个耐冷基因LTT7基因编码伸展类蛋白，与播种后低温下植株鲜重相关，诱导CBF类基因的表达来提高水稻的耐冷性；Lu等从耐冷的粳稻中克隆了耐冷基因LTG1，LTG1编码酪蛋白激酶，参与IAA的合成与调控，与低温下生长速率，抽穗期，产量相关(Lu,2014)；Ma等克隆了重要耐冷基因COLD1，COLD1与G蛋白α亚基RGA互作，激活Ca2+通道，而后增强G蛋白GTP酶活性，触发下游耐寒防御反应，而后加速G-蛋白GTP酶活性以平衡G-蛋白动态活性；Chen等揭示了水稻MADS-box家族转录因子OsMADS57协同其互作蛋白OsTB1，参与调控水稻的低温耐受性。
当今水稻耐冷育种的主要问题是可应用的耐冷基因太少，如何突破瓶颈应用新的耐冷基因显得尤为关键。广西普通野生稻中蕴藏着丰富的基因，挖掘普通野生稻的有利基因，从野生稻中发掘并鉴定耐冷新资源，深入探究调控耐冷的分子机制，将有助于水稻育种家在育种过程中为分子设计育种改良水稻抗逆性提供理论依据，最终实现高效育种。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明针对上述技术问题，发明一种普通野生稻芽期耐冷相关编码基因及其应用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种普通野生稻芽期耐冷相关编码基因，名称为WRCT-1，来源于稻属普通野生稻(Oryzarufipogon Griff.)的Y12株系的DNA序列。
其中，所述普通野生稻芽期耐冷相关编码基因WRCT-1为a)或b)：
a)DNA序列如SEQ ID No.1所示的基因序列，由1419个碱基组成；
b)将SEQ ID No.1所示的基因序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有水稻芽期耐冷相关基因编码的WRCT-1蛋白活性的由a)衍生的蛋白质。
一种普通野生稻芽期耐冷相关编码基因，名称为WRCT-1，在调控水稻在遭遇低温下的发芽率中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1相关的生物材料在培育芽期耐冷的转基因水稻中的应用。
其中，与所述普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1相关的生物材料，在培育芽期耐冷的转基因水稻中的应用；所述普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)核酸分子1；所述核酸分子1为编码所述普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子1的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子1的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子1的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子1的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子1的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子1的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述与所述普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1相关的生物材料在调控水稻在遭遇低温下的发芽率中的应用或在培育芽期耐冷的转基因水稻中的应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述与所述普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1相关的生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达相应蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子，如A2)所述的含有编码所述水稻芽期耐冷生长发育相关蛋白WRCT-1的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1的DNA。
可用现有的植物表达载体构建含有所述WRCT-1基因表达盒的重组载体，如pET-28a、pCAMBIA2301、pSP72、pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。
上述生物材料中，A5)-A8)中任一所述重组微生物或B5)-B8)中任一所述重组微生物具体可为细菌、酵母、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌(Erwinia)、根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)等。A9)-A12)中任一所述的转基因细胞系，A13)-A16)中任一所述的转基因植物组织，A17)-A20)中任一所述的转基因植物器官不包括植物的繁殖材料。
本发明所提供的一种培育芽期耐冷的转基因水稻的方法，将SEQ ID No.1所示的普通野生稻芽期耐冷相关编码基因WRCT-1构建过表达载体，经过转基因导入水稻中，获得WRCT-1基因表达水平提高的转基因水稻。。
其中，所述过表达载体为重组表达载体PMDC32或载体pCAMBIA1301；所述重组表达载体PMDC32或载体pCAMBIA1301是将表达载体PMDC32/pCAMBIA1301的Asc I和PacI识别位点间的序列替换为SEQ ID No.1所示的DNA序列。
其中，所述重组表达载体PMDC32可通过使用农杆菌介导、Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞或组织。
其中，所述方法还包括从导入SEQ ID No.1所示的DNA分子的受体水稻中筛选所述普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1表达量升高的水稻，得到所述WRCT-1基因表达水平升高的转基因水稻的步骤。
其中，所述转基因水稻理解为不仅包含将所述基因转化受体水稻得到的第一代转基因水稻，也包括其子代。对于转基因水稻，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中；所述转基因水稻包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上文中，所述水稻具体可为籼稻测253。
本发明将如SEQ ID No.1所示的普通野生稻芽期耐冷相关编码基因WRCT-1导入水稻中，获得WRCT-1基因表达水平提高的转基因水稻。表达水平高于受体亲本水稻，而且该过表达转基因水稻出现了芽期耐冷的表现。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次鉴定了与普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1，普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1在功能增强或表达量上升的条件下水稻芽期具备耐冷特性，证明普通野生稻芽期耐冷相关基因蛋白或其蛋白在控制水稻芽期耐冷中发挥重要作用。本发明不仅为进一步阐明水稻芽期耐冷的分子机理提供基础，而且为水稻育种提供新的基因资源和育种资源。本发明获得的WRCT-1基因表达升高的转基因水稻，作为新的水稻种质材料，可用于研究水稻芽期耐冷的分子机理和发现更多的调控水稻芽期耐冷的基因。本发明对于通过遗传育种和基因工程方法利用该基因资源有效地调控水稻芽期耐冷具有重要的应用价值。
附图说明
图1为普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1基因表达水平升高的过表达转基因水稻的WRCT-1基因的转录水平的检测；其中，WT代表受体亲本籼稻测253植株，OEWRCT-1-1,OEWRCT-1-2,OEWRCT-1-3分别代表转入重组载体PMDC32-WRCT-1的过表达阳性植株不同转化事件(SEQ ID No.1)。
图2为普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1过表达转基因株系与对照的低温下发芽率表现。其中，WT代表受体亲本籼稻测253植株，OEWRCT-1-1,OEWRCT-1-2,OEWRCT-1-3分别代表转入重组载体PMDC32-WRCT-1的过表达阳性植株不同转化事件。结果显示在低温处理下，过表达WRCT-1能显著提高水稻种子在低温下的发芽率。
图3为普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1过表达转基因株系与对照的低温下发芽率表型表现；其中，WT代表受体亲本籼稻测253植株，OEWRCT-1-1、OEWRCT-1-2、OEWRCT-1-3分别代表转入重组载体PMDC32-WRCT-1的过表达阳性植株不同转化事件。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的水稻籼稻测253(也称为野生型水稻，简称WT)为市售所得，公众也可从广西壮族自治区农业科学院水稻研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用表达载体PMDC32为市售所得，公众也可从中广西壮族自治区农业科学院水稻研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的农杆菌为根癌农杆菌EHA105(Agrobacterium tumefaciensEHA105)(New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer toplants.Hood,ElizabethE；Gelvin,StantonB；Melchers,Leo S；Hoekema,Andre.Transgenic research,2(4):p.208-218(1993))为市售所得，公众也可从广西壮族自治区农业科学院水稻研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1
普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1基因过表达载体的构建
1、WRCT-1基因的获得
以普通野生稻Y12-4(Oryzarufipogon Griff.)的DNA为模板，用如下引物primer1和primer2进行PCR扩增获得目的基因：
primer1：5'CGGGGTACCATGACGACAAAGACCTTT 3'；
primer2：5'CTTAATTAATCAGCTGCGAACTCCATT 3'。将PCR产物回收纯化后连接入Zero(购买自北京全式金公司)测序载体，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆后，进行测序。
测序结果表明，扩增得到的PCR产物序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，长度为1419bp，命名为WRCT-1基因，WRCT-1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2、普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1基因过表达载体(重组表达载体PMDC32-WRCT-1)的构建
1)用primer1和primer2扩增普通野生稻Y12-4DNA，获得WRCT-1基因的序列，并连接到重组载体Zero-WRCT-1，得到了Zero-WRCT-1的阳性克隆。用限制性内切酶Asc I和PacI酶切重组载体Zero-WRCT-1获得WRCT-1片段；
2)用限制性内切酶Asc I和PacI酶切表达载体PMDC32，得到线性表达载体PMDC32，回收该线性片段；将步骤1)中得到的片段WRCT-1采用同源重组定向克隆的方法整合到线性表达载体PMDC32上(具体方法参考PMDC32使用说明书)，得到同源重组产物1，再将同源重组产物1转入DH5α感受态细胞，37℃培养过夜，得到重组载体PMDC32-WRCT-1；
3)对步骤2)所得重组载体PMDC32-WRCT-1进行测序，结果表明该重组载体PMDC32-WRCT-1是在表达载体PMDC32的Asc I酶切位点正向插入了如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，即成功将PMDC32的Asc I和PacI识别位点(识别序列)间的DNA序列替换为如SEQ IDNo.1所示的DNA序列。
实施例2
培育普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1基因表达水平升高的过表达WRCT-1转基因植株及转基因植株的鉴定
一、培育普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1基因表达水平升高的过表达WRCT-1转基因植株将重组载体PMDC32-WRCT-1通过根癌农杆菌EHA105介导转化籼稻测253粳稻，具体方法如下：
1、将实施例1所得重组载体PMDC32-WRCT-1用热激法导入根癌农杆菌EHA105中得到含有重组载体PMDC32-WRCT-1的重组根癌农杆菌EHA105；将含有重组载体PMDC32-WRCT-1的重组根癌农杆菌EHA105在28℃培养16h，收集菌体；采用含有浓度为100μM乙酰丁香酮的N6液体培养基(Sigma，产品目录号为C1416)将菌体进行稀释，得到稀释菌液，稀释菌液的OD600≈0.5；
2、将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤1的稀释菌液混合侵染30min，采用滤纸吸干菌液后转入N6固体共培养培养基中，在24℃共培养3d，得到共培养处理后的愈伤组织；
3、将步骤2的共培养处理后的愈伤组织接种在含有质量浓度为150mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基(向N6固体培养基中加入潮霉素得到N6固体筛选培养基，N6固体筛选培养基中潮霉素的质量浓度为150mg/L)上进行第一次筛选；
4、在第一次筛选开始的第16天挑取健康愈伤组织转入含有质量浓度为200mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基(向N6固体培养基中加入潮霉素得到N6固体筛选培养基，N6固体筛选培养基中潮霉素的质量浓度为200mg/L)上进行第二次筛选，每15天继代一次，共继代1次；
5、挑取步骤4获得的抗性愈伤组织转入含有质量浓度为150mg/L潮霉素的分化培养基上(分化培养基：6-BA 2mg,NAA 0.2mg,N6 4g,水解酪蛋白1g,肌醇0.1g，蔗糖25g,山梨醇2.4g,琼脂粉7g，去离子水1L)进行分化，在24℃培养45d(此时植株地上部分高度约为15cm)，打开瓶口炼苗3天，然后移栽至温室栽培，即为转PMDC32-WRCT-1植株(T0代)。为不同的转化事件命名为OEWRCT-1-1,OEWRCT-1-2,OEWRCT-1-3分别代表转入重组载体PMDC32-WRCT-1的过表达阳性植株。
二、普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1基因表达水平升高的PMDC32-WRCT-1转基因植株的PCR鉴定提取
步骤一获得的转PMDC32-WRCT-1(OEWRCT-1-1,OEWRCT-1-2,OEWRCT-1-3)植株的T0代幼苗和受体亲本水稻籼稻测253植株的幼苗(简称为WT)的基因组DNA，并采用引物primer1：5'CGGGGTACCATGACGACAAAGACCTTT 3'；primer2：5'CTTAATTAATCAGCTGCGAACTCCATT 3'，进行PCR分子检测鉴定阳性苗，得到1419bp PCR产物的植株为阳性苗，即OEWRCT-1-1、OEWRCT-1-2、OEWRCT-1-3。
三、普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1基因表达水平升高的过表达转基因植株的WRCT-1基因表达水平的鉴定：
分别提取步骤二得到的OEWRCT-1-1,OEWRCT-1-2,OEWRCT-1-3植株和受体亲本水稻籼稻测253植株(简称为WT)叶片的RNA，设定内参为Actin，利用内参引物Actin-F和Actin-R，以及WRCT-1基因特异性定量引物WRCT-1-qRT-F和WRCT-1-qRT-R进行荧光定量PCR反应来检测不同转基因植株WRCT-1基因的表达水平的变化。结果表明(图1)，在转入重组载体PMDC32-WRCT-1的阳性植株中WRCT-1基因的表达水平均比对照(WT)的WRCT-1基因的表达水平的显著上升，上述引物如下：
Actin-F：5’-ATTTGGCACCACACATTCTAC-3’
Actin-R：5’-ATAACCTTCGTAGATTGGGACT-3’；
WRCT1-RT-F：5'CCCCGCCTACTTCTTCTTTC 3'
WRCT1-RT-:5'CGCCGCCTTATCCATCTC 3'。
四、普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1基因表达水平上升的WRCT-1过表达转基因植株的表型鉴定
分别将步骤二得到的OEWRCT-1-1,OEWRCT-1-2,OEWRCT-1-3植株和受体亲本水稻籼稻测253植株(简称为WT)种植并收获T2代种子，对种子做萌发实验，选择转基因植株种子与受体亲本水稻测253种子做萌发处理，待到芽长0.5mm时候，每个株系选择30粒萌发均一的种子，重复3次，放入光温培养箱做4℃6天处理。6天处理后，取出在室温下恢复4天，统计发芽率。观察测算转基因种子与测253种子在低温下的发芽率差异。观察结果如图2、图3、表1所示。图2是OEWRCT-1-1,OEWRCT-1-2,OEWRCT-1-3低温下发芽率具象化，图3为WT、OEWRCT-1-1,OEWRCT-1-2,OEWRCT-1-3低温处理后的表型表现。
与受体亲本水稻测253种子相比，OEWRCT-1-1、OEWRCT-1-2、OEWRCT-1-3植株的种子经过低温处理和恢复后，低温下的发芽率比测253高并达到显著差异，从而证明了WRCT-1基因参与控制野生稻芽期耐冷过程，即该WRCT-1基因为野生稻芽期耐冷基因。
表1.过表达转基因植株低温下发芽率表现
编号 低温下发芽率 低温下发芽率标准误
WT 2.22％ 1.11％
OEWRCT-1-1 98.89％ 1.11％
OEWRCT-1-2 63.33％ 8.39％
OEWRCT-1-3 40.00％ 9.62％
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Figure BDA0002012800060000121
Figure BDA0002012800060000131
Figure BDA0002012800060000141
Figure BDA0002012800060000151
Figure BDA0002012800060000161
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 一种普通野生稻芽期耐冷相关基因及其应用
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<211> 1419
<212> DNA
<213> 水稻（Oryzarufipogon Griff.）
<400> 1
atgacgacaa acacgtttgt gctgttcccg tcgctgggcg tcggccacct gaaccccatg 60
gtggagctag ccaagcacct gcgccgccgc ggcctcggcg tcatcatcgc ggtgatcgat 120
ccgcccaaca acgacgccat gtcggccgac gcgatggcgc gcctcgccgc ggccaaccct 180
tccgtcacgt tccgcatcct gccggcgccg gccagcccgg accccggcgc gcaccatgtc 240
aagcgcaacc tcgacacgct ccggctcgcc aaccccgtgc tccgcgagtt cctccgctcc 300
ctgcccgccg tcgacgcact cctgctcgac atgttctgcg tcgacgcgct cgacgtcgcg 360
gccgagctcg ccatccccgc ctacttcttc tttccctccc cggccagcgt cctcgccgtc 420
ttttcccacc tcccgtatta ctaccgcaac gcgccgtcgt tgagggagat ggataaggcg 480
gcgctcatcc gatttcccgg cattccgccg atccgcaacg tcgacatgct ggccacggtg 540
aaggacaagg agagcgagac gaccaagatc aggttgtacc agttcaagcg gatgatggaa 600
gggaagggcg tgctggtgaa tagcttcgac tggctggagc ccaaggccct gaaagcgctc 660
gccgccggtg tctgcgtgcc cgacatgccc aagcccagag tctacttaat cgggccactg 720
gtcgacgccg gcaagaagat agggagcggc gccgagaggc acgcgtgcct cccgtggctt 780
gacgcccagc cgcggcggag cgtcgtgttc ctctgcttcg gcagccaggg cgcgttcccg 840
gcggcgcagc tgaaggagtt agctcatggg ctggagagct ccggccaccg attcctgtgg 900
accgtgagga gcccaccgga ggagcagtcc acatcaccgg agccggacct ggagcggctg 960
cttccggcgg ggttcttgga gaggacgaag ggcagaggca tggtggtcaa gaactgggtg 1020
ccacaggcgg aggtggtgca gcacgaggcg gtaggcgcgt tcgtgacgca ctgcgggtgg 1080
aactcgacgc tggaggcgat catgtcggcg ctgccgatga tatgctggcc gctgtacgcg 1140
gagcaggcga tgaacaaggt gatcatggtg gaggagatga agatcgccgt gtcgctcgac 1200
gggtacgagg agggagggtt ggtgaaggcc gaggaagtgg agacgaaggt gaggctggtg 1260
atggagaccg aggaagggag aaagctcagg gagaaactgg tggagacgag ggacatggcg 1320
ttgaatgccg tcaaggatag tgggtcttct gaagtggcat ttgataagtt catgagagat 1380
ttggagaaga gcagattgga gaatggagtt cgcagctga 1419
<210> 2
<211> 472
<212> PRT
<213> 水稻（Oryzarufipogon Griff.）
<400> 2
Met Thr Thr Asn Thr Phe Val Leu Phe Pro Ser Leu Gly Val Gly His
1 5 10 15
Leu Asn Pro Met Val Glu Leu Ala Lys His Leu Arg Arg Arg Gly Leu
20 25 30
Gly Val Ile Ile Ala Val Ile Asp Pro Pro Asn Asn Asp Ala Met Ser
35 40 45
Ala Asp Ala Met Ala Arg Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ser Val Thr Phe
50 55 60
Arg Ile Leu Pro Ala Pro Ala Ser Pro Asp Pro Gly Ala His His Val
65 70 75 80
Lys Arg Asn Leu Asp Thr Leu Arg Leu Ala Asn Pro Val Leu Arg Glu
85 90 95
Phe Leu Arg Ser Leu Pro Ala Val Asp Ala Leu Leu Leu Asp Met Phe
100 105 110
Cys Val Asp Ala Leu Asp Val Ala Ala Glu Leu Ala Ile Pro Ala Tyr
115 120 125
Phe Phe Phe Pro Ser Pro Ala Ser Val Leu Ala Val Phe Ser His Leu
130 135 140
Pro Tyr Tyr Tyr Arg Asn Ala Pro Ser Leu Arg Glu Met Asp Lys Ala
145 150 155 160
Ala Leu Ile Arg Phe Pro Gly Ile Pro Pro Ile Arg Asn Val Asp Met
165 170 175
Leu Ala Thr Val Lys Asp Lys Glu Ser Glu Thr Thr Lys Ile Arg Leu
180 185 190
Tyr Gln Phe Lys Arg Met Met Glu Gly Lys Gly Val Leu Val Asn Ser
195 200 205
Phe Asp Trp Leu Glu Pro Lys Ala Leu Lys Ala Leu Ala Ala Gly Val
210 215 220
Cys Val Pro Asp Met Pro Lys Pro Arg Val Tyr Leu Ile Gly Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Ala Gly Lys Lys Ile Gly Ser Gly Ala Glu Arg His Ala Cys
245 250 255
Leu Pro Trp Leu Asp Ala Gln Pro Arg Arg Ser Val Val Phe Leu Cys
260 265 270
Phe Gly Ser Gln Gly Ala Phe Pro Ala Ala Gln Leu Lys Glu Leu Ala
275 280 285
His Gly Leu Glu Ser Ser Gly His Arg Phe Leu Trp Thr Val Arg Ser
290 295 300
Pro Pro Glu Glu Gln Ser Thr Ser Pro Glu Pro Asp Leu Glu Arg Leu
305 310 315 320
Leu Pro Ala Gly Phe Leu Glu Arg Thr Lys Gly Arg Gly Met Val Val
325 330 335
Lys Asn Trp Val Pro Gln Ala Glu Val Val Gln His Glu Ala Val Gly
340 345 350
Ala Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ala Ile Met
355 360 365
Ser Ala Leu Pro Met Ile Cys Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gln Ala Met
370 375 380
Asn Lys Val Ile Met Val Glu Glu Met Lys Ile Ala Val Ser Leu Asp
385 390 395 400
Gly Tyr Glu Glu Gly Gly Leu Val Lys Ala Glu Glu Val Glu Thr Lys
405 410 415
Val Arg Leu Val Met Glu Thr Glu Glu Gly Arg Lys Leu Arg Glu Lys
420 425 430
Leu Val Glu Thr Arg Asp Met Ala Leu Asn Ala Val Lys Asp Ser Gly
435 440 445
Ser Ser Glu Val Ala Phe Asp Lys Phe Met Arg Asp Leu Glu Lys Ser
450 455 460
Arg Leu Glu Asn Gly Val Arg Ser
465 470

Claims (5)

1.一种普通野生稻芽期耐冷相关编码基因WRCT-1在调控水稻在遭遇低温下的发芽率中的应用，其特征在于：所述普通野生稻芽期耐冷相关编码基因名称为WRCT-1；
其中，所述普通野生稻芽期耐冷相关编码基因WRCT-1 为a）：
a）DNA序列如SEQ ID No.1所示的基因序列，由1419个碱基组成。
2.一种如权利要求1所述的普通野生稻芽期耐冷相关基因WRCT-1在培育芽期耐冷的转基因水稻中的应用。
3.一种利用如权利要求1所述基因培育芽期耐冷的转基因水稻的方法，其特征在于：将SEQ ID No.1所示的普通野生稻芽期耐冷相关编码基因WRCT-1构建过表达载体，经过转基因导入水稻中，获得WRCT-1 基因表达水平提高的转基因水稻。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述过表达载体为重组表达载体PMDC32；所述重组表达载体PMDC32是将表达载体PMDC32的Asc I 和PacI识别位点间的序列替换为SEQ ID No.1所示的DNA 序列。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述水稻为籼稻测253。
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