CN107653258B

CN107653258B - 棉花GhLecRK1基因在植物抗黄萎病中的应用

Info

Publication number: CN107653258B
Application number: CN201711136716.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡应繁; 龙璐; 高巍; 何琳; 张慧; 孙全; 张骁
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2037-11-16
Also published as: CN107653258A

Abstract

本发明公开了棉花GhLecRK1基因在植物抗黄萎病中的应用。本发明棉花GhLecRK1基因核苷酸基序列如SEQ ID NO.1、氨基酸序列如SEQ ID NO.1；本发明GhLecRK1基因在棉花根中表达较其它组织高，且受黄萎病菌诱导表达，通过将棉花中的该基因进行沉默，黄萎病菌更易侵染植株，棉花抗黄萎病能力降低，表明其具有抗黄萎病的作用，可以应用于创制抗病新种质，从而进行植物品种改良。

Description

棉花GhLecRK1基因在植物抗黄萎病中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及棉花GhLecRK1基因在植物抗黄萎病中的应用。

背景技术

凝集素类受体激酶LecRKs是植物类受体激酶的一大类亚家族，其包含四大结构域，即N端的信号肽(Signal peptid)、胞外凝集素结构域(Lectin domain)、跨膜结构域(Transmembrane domain)和C端丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域(Ser/Thr kinasedomain)，凝集素类受体激酶含有一个疏水的凹形的配体结合域，主要是用来结合糖类、植物激素如细胞分裂素(Cytokinin，CTK)等疏水性分子。前期研究表明LecRKs在植物生理生化反应中扮演了非常重要的角色，尤其在植物的生长发育和病原菌侵袭等方面。

植物是一种多细胞真核生物，由于其特性被限制在特定的生存环境中而无法自由移动，因此会无法避免地时刻遭受到来自方方面面的不利因素的影响。以土壤为传播媒介的病原体大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)是一种严重的真菌类维管束病害。由于能够导致植物叶片萎蔫且伴有黄化现象，剖杆检验维管组织发现有黄褐病变现象，因此将此病症称之为黄萎病。据统计，全球每年要有超过百万亩的棉花遭受黄萎病的侵害而损失惨重。棉花中的黄萎病主要由大丽轮枝菌导致，是棉花中分布范围广，非常严重又极难防治的病害，堪称棉花的“癌症”。棉花黄萎病致病菌在土壤中通过根系损伤部位进入到棉花中，通过植物蒸腾作用经维管束组织和木质部输导系统由根部向上运输。黄萎病菌在棉花的木质部及导管处不断增殖，产生的菌丝和孢子造成植物运输途径的堵塞，阻碍棉花各项生理活动所需营养物质的运输，造成棉花机体受损。随着棉花黄萎病菌对棉花生产损害的日益严重，科学家们开始把目光投向了对棉花抗黄萎病的研究，期望能够找到有效防治棉花黄萎病的相关措施。由于大丽轮枝菌在植物维管中独一无二的生态位，使得黄萎病很难通过杀菌剂、化学农药和栽培措施进行控制，且杀菌剂、化学农药还容易导致环境污染。随着分子生物学和生物信息学技术的迅猛发展，通过植物基因工程技术来提升植物对病害的抗性成为现目前棉花抗黄萎病研究的重要内容之一。

LecRK基因在植物生长发育和病原菌侵袭中发挥重要作用，但在棉花中还未见LecRK基因功能的报道。因而棉花抗黄萎病相关LecRK基因的筛选、鉴定和功能研究将对棉花抗病新品种的育种具有重要意义。

发明内容

鉴于此，本发明的目的之一是提供棉花GhLecRK1基因在植物抗黄萎病中的应用，所述GhLecRK1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1的序列相似性在90％以上或所述GhLecRK1基因的氨基酸序列与SEQ ID NO.2的序列相似性在80％以上；

优选地，所述GhLecRK1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1相同或所述GhLecRK1基因的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同；

优选地，所述植物为棉花。

本发明的目的之二是提供一种提高植物抗黄萎病能力的方法，所述方法包括将GhLecRK1基因核苷酸序列连入植物表达载体得到重组植物表达载体，所述GhLecRK1基因核苷酸序列与SEQ ID NO.1的序列相似性在90％以上，所述重组植物表达载体通过根癌农杆菌转化法转化入植物中得到转基因植物，所述转基因植物与未进行转基因的植物相比，具有更强的抗黄萎病能力；

优选地，所述GhLecRK1基因核苷酸序列与SEQ ID NO.1的序列相同。

优选地，所述植物为棉花。

本发明通过前期棉花转录组数据分析，获得一个LecRK家族基因，该基因序列如SEQ ID NO.1，该基因在棉花根中表达较其它组织高，且受黄萎病菌诱导表达，通过将棉花中的该基因进行沉默，黄萎病菌更易侵染植株，棉花抗黄萎病能力降低，表明该基因具有抗黄萎病的作用，可以应用于创制抗病新种质，从而进行植物品种改良。由于棉花物种较多，不同棉花中该基因的序列不会完全相同，因此与SEQ ID NO.1序列和SEQ ID NO.2序列相似性较高(相似性分别大于90％和80％)的基因也具有抗黄萎病能力。

附图说明

图1为本发明陆地棉GhLecRK1基因与其它物种中已知的部分LecRK家族基因的进化关系图；

图2为本发明陆地棉GhLecRK1基因的亚细胞定位图；

图3为本发明GhLecRK1基因在棉花中的组织表达谱图；

图4为本发明在黄萎病菌处理下棉花中GhLecRK1基因的表达变化图；

图5为本发明GhLecRK1基因在棉花中被沉默的半定量PCR验证图；

图6为本发明GhLecRK1基因沉默的棉花与对照棉花间在黄萎病菌侵染下的叶片黄化、萎蔫水平比较图；

图7为本发明GhLecRK1基因沉默的棉花与对照棉花间在黄萎病菌侵染下的植株发病率与病情指数比较图；

图8为本发明GhLecRK1基因沉默的棉花与对照棉花间在黄萎病菌侵染后经剖杆处理下的褐化比较图；

图9为本发明GhLecRK1基因沉默的棉花与对照棉花间在黄萎病菌侵染后经黄萎病菌恢复培养下的黄萎病菌数量比较图；

图10为本发明GhLecRK1基因沉默棉花与对照棉花间黄萎病菌病斑和菌丝在离体叶片上的扩散比较图。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。

实验例1：棉花GhLecRK1基因的克隆和生物信息学鉴定

1、陆地棉GhLecRK1基因的克隆

①按照Aidlab公司的EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒说明书上的提取步骤提取陆地棉TM-1品种的总RNA并反转录为cDNA，将cDNA浓度稀释至50-60ng/μL。陆地棉TM-1品种种子由中国农业科学院棉花研究所提供。

②在南京农业大学释放的陆地棉基因组数据库(http：//mascotton.njau.edu.cn/)中对L-type LecRK家族基因进行鉴定和在陆地棉转录组数据进行表达分析，筛选出一个在根中表达量较高的编号为Gh_A09G2414的L-type LecRK家族基因，在本发明中将其命名为GhLecRK1，根据GhLecRK1基因序列，用引物设计软件PrimerPremier 5.0设计一对扩增引物：

F：ATGGCTTTCCTTCTCTTCTGGTTTATCTTC

R：CTATCTGCCGCTGCTCATGGAACTG，

采用PCR技术，用高保真酶(TaKaRa)，以陆地棉TM-1品种的cDNA为扩增模板进行序列扩增。PCR产物大小与预期一致，即1929bp。

③对PCR扩增产物进行平末端加A反应，反应体系为：扩增产物14.5μL，10×PCRBuffer 2μL，Mix dNTP 3μL，rTaq酶0.5μL。在PCR仪中72℃加热20min。

④使用TIANGEN产品编号为DP209-02的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，并按照其操作说明书的步骤对平末端加A反应产物进行回收纯化。

⑤T载体连接反应，反应体系为：pMD18-T(TaKaRa)0.5μL，solution I 5μL，纯化产物3μL，ddH₂O 1.5μL。放置在16℃恒温水浴锅中过夜连接，随后通过热激反应将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，培养过后挑取单菌落获得GhLecRK1基因片段，单菌落送到华大公司测序获得陆地棉GhLecRK1基因序列，即SEQ ID NO.1，该序列与陆地棉基因组测序结果中Gh_A09G2414序列一致。

2、陆地棉GhLecRK1基因的生物信息学鉴定

①利用在线网站(http：//web.expasy.org/protparam/)分析GhLecRK1蛋白的理化性质，该蛋白含有642个氨基酸(即SEQ ID NO.2)，分子量为71.3kD，等电点pI为5.57。

②利用所得的序列在NCBI网站进行在线序列比对，其属于L-type LecRK蛋白家族。利用在线网站(http：//ffas.burnham.org/XtalPred-cgi)预测了蛋白质的三级结构，可知大约22％的氨基酸形成α-螺旋，26％的氨基酸形成β-折叠片，4％形成跨膜结构。

③将GhLecRK1蛋白与其它物种中已知的部分L-type LecRK蛋白家族成员利用DNAMAN软件进行序列比对并使用MEGA4软件进行序列的进化分析。结果如图1所示，GhLecRK1蛋白在进化关系上与拟南芥的LecRK家族蛋白遗传距离最近，但相似度较低为65％左右。

实验例2：GhLecRK1的启动子序列分析

在陆地棉基因组数据库中提取GhLecRK1上游2kb的序列，用在线网站Plant CARE预测其顺式作用元件，发现其启动子区段转录起始位点上游含有很多响应病原菌和逆境胁迫的顺式作用元件。如：TC-rich repeats，该元件在响应抗逆、抗病等方面起重要的作用；响应和调节低氧或无氧条件的AREmotif；还有响应真菌的元件Box-W1；响应激发子的顺式元件EL1-box1。此外该基因启动子区还含有许多响应激素和光照等胁迫相关的元件。说明GhLecRK1可能参与多种生物、非生物和激素的调控。

实验例3：GhLecRK1亚细胞定位

①通过PSORT在线软件进行亚细胞定位预测知GhLecRK1定位于细胞质膜；通过TMHMM Server v.2.0在线软件预测知GhLecRK1蛋白具有跨膜结构域。

②GFP融合表达亚细胞定位

设计引物PCR扩增GhLecRK1序列，引物为：

F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAATGGCTTTCCTTCTCTTCTGGTTTATCTTC

R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTCTGCCGCTGCTCATGGAACTG。

将获得的GhLecRK1序列连入亚细胞定位载体pK7FWG2.0中构建GhLecRK1：：GFP融合表达载体，为了避免影响N端的信号肽引导蛋白的跨膜转移作用，该载体中的GFP是与GhLecRK1片段的C端连接。以35S-GFP为阳性对照，通过农杆菌注射瞬时转化烟草，烟草瞬时转化方法为：将农杆菌菌液在注射前两天活化，取10L于加抗生素的1mL的液体LB培养基中，28℃下转速为180-220rmp摇8-12h，抗生素为壮观霉素和利福平，终浓度均为50mg/L；然后将活化好的菌液按1∶100的比例分别加到新鲜的液体LB培养基中(壮观霉素50mg/L，利福平50mg/L，乙酰丁香酮0.02mmol/L，MES 10mmol/L)，转速为180-220rmp的28℃摇床中摇至OD值为0.6-0.8；然后将各个菌液在常温4500rmp离心10min，并用重悬液悬浮菌液OD至0.6-0.8，重悬液浓度为MES 10mmol/L、乙酰丁香酮0.8mmol/L、MgCl 210mmol/L，并将菌液在25℃放置1h，并用2.5mL的注射器对烟草叶子注射，注射时用针头微微划伤烟草叶子的背面，慢慢注满整个叶片，叶片尽量选用较嫩的叶片；注射后的植株25℃暗培养48h后，在激光共聚焦显微镜下观察GFP在亚细胞器上的定位情况。如图2所示，35S-GFP转化的绿色荧光在烟草表皮细胞的细胞膜、细胞质、细胞核都能观察到，GhLecRK1：：GFP的绿色荧光只在细胞膜上观察到，表明GhLecRK1定位在细胞膜，与预测结果一致，与凝集素类受体激酶结构特征相符。

实验例4：GhLecRK1的表达分析

1、组织表达模式分析

植物的根部深入地下，直接接触细菌、真菌、原核生物和线虫等。棉花黄萎病是一种土传真菌病害，在自然环境中，黄萎病菌通过棉花根系入侵，向地上部分扩散，根系是感知病原菌，传递入侵信号的第一道防线。通过已知的陆地棉TM-1转录组数据知GhLecRK1在根中的表达特别高，为验证其正确性，提取了陆地棉幼苗根、茎、叶的总RNA，并反转录为cDNA后进行qRT-PCR分析。

qRT-PCR引物为：

GhLecRK基因：

F：AGATTGGGTGATAGAGTGCCAC

R：ATACGTTCATCCCCGTTGAGA；

内参基因泛素蛋白Ubiquitin7(UB7)：

F：GAAGGCATTCCACCTGACCAAC

R：CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG。

qRT-PCR所用的试剂盒是SYBR Green PCR master mix(

Ex Taq^TMII Tli RNaseH Plus)，反应体系为5μL酶，5μL cDNA产物，上下游混合引物0.2μL，反应总体积为10μL。每个基因4个技术重复。所用实时定量PCR仪型号是ABI 7500Fast Real-TimePCR，对应的程序为，定量程序为95℃1min，95℃5s和60℃40s 40个Cycles。采用2^-ΔCT法来计算目标基因的相对表达量。

分析结果如图3所示，GhLecRK基因在根中表达量最高，与陆地棉转录组数据分析结果一致。

2、GhLecRK1基因在黄萎病菌处理下的表达分析

在超净工作台中将保存在-80℃环境中的黄萎病菌(V.dahliae)菌种V991(由中国农业科学院植物保护研究所简桂良研究员提供)放置室温自然溶化，然后将黄萎病菌菌液涂在PDA固体培养基，待晾干之后倒置在28℃环境下培养至长出明显菌落后用无菌水吹打菌落得到孢子液。采用伤根法接种黄萎病菌，即种植一批陆地棉TM-1品种的棉花，将生长至两子叶平展并有一个真叶芽芯的棉花幼苗从种植的土壤中剥离，并将根部洗净，对洗净后的棉花幼苗进行伤根处理即用剪刀剪掉一些须根，然后将棉花根部浸入浓度为2×10⁶spores/mL的黄萎病病原菌孢子液中，浸染1min后，将棉花幼苗重新种植到土壤中。在接种后的0h、1h、6h、12h、24h和72h取棉花幼苗的真叶作为样品。对经黄萎病菌接种处理的样品提取RNA，并反转录为cDNA模板，利用qRT-PCR技术对GhLecRK1基因进行黄萎病菌诱导表达分析，结果如图4所示，参照对照组(Mock)，GhLecRK1在黄萎病菌V.dahliae接种后6h、12h和72h上调表达，表明GhLecRK1的表达受黄萎病菌的诱导调控，其可能参与棉花对黄萎病菌的抗性反应。

实验例5：VIGS技术沉默GhLecRK1基因对棉花抗黄萎病的影响

1、构建重组VIGS载体TRV：GhLecRK1

①通过与同源序列进行比对，找到GhLecRK1的非保守区域，设计引物扩增VIGS片段，且在VIGS片段的两端分别加上EcoRI和KpnI酶切位点。上下游引物分别为：

F：CGACGACAAGACCCTAAGGCATTGCTGCGGGACTA

R：GAGGAGAAGAGCCCTTTTCATCGCTAGAATCAAACGCC

②通过VIGS片段和pTRV2载体的EcoRI和KpnI双酶切与连接构建GhLecRK1的VIGS干涉载体TRV：GhLecRK1。

VIGS片段酶切体系为EcoRI 2μL、KpnI 2μL、10×Buffer 5μL、VIGS片段/pTRV2载体41μL，并放置在37℃水浴锅中酶切过夜。

连接体系为VIGS酶切片段1μL，TRV2酶切空载体3μL，T4连接酶1μL，T4Buffer 2μL，ddH₂O 13μL，将其放置于16℃恒温水浴锅中进行过夜连接。

将连接产物热激转化，转入大肠杆菌DH5α感受态中，将转化后的单菌落进行PCR阳性鉴定得到重组载体TRV：GhLecRK1。将测序正确后的菌落提取质粒后，转入农杆菌感受态GV3101。

2、棉花GhLecRK1基因沉默及棉花表型分析

通过携带TRV：GhLecRK1农杆菌进行棉花遗传转化。首先将分别含有TRV：GhLecRK1和TRV：00(对照空载体)的农杆菌加入新鲜的含有抗生素的LB液体培养基中过夜小摇；接着对经过小摇过的TRV：GhLecRK1和TRV1：00的农杆菌进行过夜大摇，大摇时除了加抗生素以外还要加MES和AS，第二天测其OD值，OD值在0.6-0.8之间即可；将OD值符合要求的TRV：GhLecRK1和TRV1：00的农杆菌，进行离心，并加入相同体积的VIGS buffer来吹打悬浮混匀；将TRV：GhLecRK1和TRV1：00的悬浮菌液在28℃条件下，按120rpm振荡活化1-2h后用医用注射器对两片子叶平展并有一个真叶芽芯的棉花苗的子叶进行注射菌液；注射后的苗子要在25℃条件下避光处理24h。得到TRV：00和TRV：GhLecRK1植株。同时将调控叶绿素合成基因CLA的VIGS载体同步注射入棉花幼苗子叶中去，以鉴定该VIGS体系的准确性。棉花植株生长两周左右，观察到CLA的VIGS植株的子叶出现白化现象表明该VIGS体系是准确的。提取TRV：00和TRV：GhLecRK1植株真叶的RNA反转录为cDNA模板进行GhLecRK1基因沉默效率的半定量PCR表达检测，结果如图5所示TRV：GhLecRK1植株中GhLecRK1基因的表达明显较对照组(GhUBQ7)低，表明GhLecRK1基因被成功沉默。

采用伤根法对生长15天的TRV：00和TRV：GhLecRK1棉花幼苗接种浓度为3×10⁵cell/mL的黄萎病菌孢子液，同时用灭菌水接种作为空白对照来鉴定棉花对黄萎病抗性的变化，以探究GhLecRK1的表达对棉花对黄萎病抗性的影响。灭菌水接种的空白对照显示TRV：00对照植株和TRV：GhLecRK1沉默植株的生长没有区别。在植株接种7天后，如图6所示，叶片开始出现了黄萎病菌发病的典型症状，例如叶片发黄萎蔫、呈现病斑、脱落，但沉默植株比对照植株出现病症更严重。病情指数和发病率统计如图7所示，沉默植株受黄萎病菌影响较对照更严重。由此表明沉默GhLecRK1基因后，棉花对黄萎病的抗性降低。

为了进一步验证上述表型结果的准确性，本研究继续做了黄萎病菌恢复培养实验和病植剖杆处理。黄萎病菌恢复培养实验方法为：用剪刀将经黄萎病处理后的棉花幼苗的茎剪成1cm长的片段，接着用0.1％的HgCl₂溶液中消毒1min，然后用无菌水冲洗5次左右，最后将处理后的棉花茎片段放置于PDA培养基上培养，25℃条件下培养大约10-14d，即可观察黄萎病菌恢复培养的生长状况。病植剖杆处理方法为：取若干经黄萎病菌接种后的棉花茎秆，用刀对其进行横切或者纵切，暴露出其横切面或者纵切面，观察茎秆的维管束组织的表型，若茎秆维管束组织为褐色即表示已感染黄萎病菌并发病，若茎秆维管束组织无褐色而表型正常即表示未发病。实验结果如图8所示，沉默植株的剖杆材料褐化程度要高于对照植株材料；如图9所示，沉默植株材料在PDA培养基中培养出来的黄萎病菌菌落要多于对照植株材料。这些结果同样表明沉默GhLecRK1基因后，棉花对黄萎病的抗性降低。

进一步地，利用离体叶片接种带GFP荧光的V991黄萎病菌(该菌种由中国农业科学院戴晓枫惠赠)，观察病斑和菌丝在叶片上的扩散情况。取15μL黄萎病菌孢子液滴在TRV：00和TRV：GhLecRK1叶片中间叶脉上，避光保湿至病斑产生后观察。如图10所示，观察到病斑(Lesion)情况为接种后第4天TRV：GhLecRK1叶片开始出现病斑，TRV：00在第5天出现病斑，接种后第7天可以观察到TRV：00和TRV：GhLecRK1的病斑大小出现了明显差异，用荧光显微镜观察菌丝在叶片内的扩散情况，可见绿色荧光(GFP)面积与病斑面积一致。病斑统计结果说明，沉默GhLecRK1基因后病原菌在棉花中的扩散速度更快。

综上知沉默GhLecRK1基因后，棉花对黄萎病的抗性降低，表明GhLecRK1基因具有抗黄萎病能力。

需要说明的是，上述实验例中所涉及的实验操作，部分实验操作具有一定的通用性，因而未加详细描述，未详细描述部分内容参考其它实验例中相关操作或参考现有技术，不再赘述。

序列表

<110> 河南大学

<120> 棉花GhLecRK1基因在植物抗黄萎病中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1929

<212> DNA

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400> 1

atggctttcc ttctcttctg gtttatcttc ttcccagtta ttgctcaacc tcggcccaca 60

aatttcatct tccatggttt caatcgaagt gaacccaagc ttacccttga cggagcttct 120

attaggagtc ccagtggcgc cctagagctg acaaacgatt cacgtgacgc tattggccat 180

gcattctatt cagaaccaat acaaatgttg gacgacaagt cttcaccttc tcccaaatct 240

tcttctttta gcacaacttt cgtgttagct atcgttactc caagctcagg gagaggaggc 300

catggacttg ctttcacgtt atccccttcc aagcagttcc ccggagctct accagagcac 360

tacatgggaa tattcaactc ggagacggat gggtcatcct ccaaccatat tgttgcagtg 420

gaattcgata ctgtcaatgg atacaacgat cgtttagaca gcaaaggaaa tcatgttggg 480

attaacataa ataccatgta ttcgaacgcg acggaaccgg ctgcttatta tgtcaataac 540

acagagctaa aggaggatat gatattggag agcggtgatg ccatccaggc ctggatagaa 600

tatgatggca actttgtgaa tgaaaccatg tacgttggct tttctgcatc tacgggacaa 660

aagtcgagct ctcattacat cttaggatgg agcttctcca cgaatggaac agcggcccaa 720

ctcaatactt cccgaatacc tatggcaccg tcaaaacaaa acgatggatc ttcttttgat 780

actcgagtca ttggtcttat tgttgcttta tccaccgtga ctgttttatt gttgggaata 840

ttgatctatt ttacgttgta caaaaggaat gccaagtacg aggatcttga agattgggaa 900

ttagattatt gtcctcaccg gttccgatac aaggatcttt atgcagcaac aaggggtttc 960

cagctgagcg agataatagg agttggagga tttgctgcag tgtacaaagg tgtgttgcct 1020

acaactggaa ctgaagttgc tgttaaaaag ataactcaaa gttcaatcca aggtctgaga 1080

gaattcgtag cggagatcga aagcttagga agattaaggc acaagaattt ggtttatctc 1140

caaggatggt gcaagcgaaa gaatgatctt cttctggtct atgattacat tcccaacgga 1200

agcctttatt ccctcctttt caatcaagaa caaggctttg tgttaagctg ggaaaaaaga 1260

ttcaatatca ttaaaggcat tgctgcggga ctactgtatc tgcatgaaga atgggagttg 1320

gtggtaatcc acagagacgt gaagtctagc aatgttctca tagatgctga catgaatgcg 1380

cggctggggg actttggcct tgcaaggttg tacgatcatg gtacagattc gcacaccact 1440

aacattgtgg gcactgttgg gtatattgca ccagaactgg ctcgcaatgg caaggcttct 1500

accagctcag acgtttttgc atatggggtt ttgctccttg aaattgtttg cggaagaaag 1560

ccagttgatt cgaggaactt cttcttggta gattgggtga tagagtgcca ccaaatgggt 1620

catattcttg atgcaatgga ccctaagtta aattccagtt atgtaacgga agaggtgaag 1680

ctggtcctgc tgttgggtct tctttgttct catccaaagc ctgaagttag gcctagcatg 1740

agcaaaatcg tgcgctatct caacggggat gaacgtattc cttccattga taactgggag 1800

gcgtttgatt ctagcgatga aacttacttg aagttcttgg aaacagtttc ttctgatagt 1860

atcacaaaat cttatcgctt gtcttccatc gctggtttct cttccagttc catgagcagc 1920

ggcagatag 1929

<210> 2

<211> 642

<212> PRT

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400> 2

Met Ala Phe Leu Leu Phe Trp Phe Ile Phe Phe Pro Val Ile Ala Gln

1 5 10 15

Pro Arg Pro Thr Asn Phe Ile Phe His Gly Phe Asn Arg Ser Glu Pro

20 25 30

Lys Leu Thr Leu Asp Gly Ala Ser Ile Arg Ser Pro Ser Gly Ala Leu

35 40 45

Glu Leu Thr Asn Asp Ser Arg Asp Ala Ile Gly His Ala Phe Tyr Ser

50 55 60

Glu Pro Ile Gln Met Leu Asp Asp Lys Ser Ser Pro Ser Pro Lys Ser

65 70 75 80

Ser Ser Phe Ser Thr Thr Phe Val Leu Ala Ile Val Thr Pro Ser Ser

85 90 95

Gly Arg Gly Gly His Gly Leu Ala Phe Thr Leu Ser Pro Ser Lys Gln

100 105 110

Phe Pro Gly Ala Leu Pro Glu His Tyr Met Gly Ile Phe Asn Ser Glu

115 120 125

Thr Asp Gly Ser Ser Ser Asn His Ile Val Ala Val Glu Phe Asp Thr

130 135 140

Val Asn Gly Tyr Asn Asp Arg Leu Asp Ser Lys Gly Asn His Val Gly

145 150 155 160

Ile Asn Ile Asn Thr Met Tyr Ser Asn Ala Thr Glu Pro Ala Ala Tyr

165 170 175

Tyr Val Asn Asn Thr Glu Leu Lys Glu Asp Met Ile Leu Glu Ser Gly

180 185 190

Asp Ala Ile Gln Ala Trp Ile Glu Tyr Asp Gly Asn Phe Val Asn Glu

195 200 205

Thr Met Tyr Val Gly Phe Ser Ala Ser Thr Gly Gln Lys Ser Ser Ser

210 215 220

His Tyr Ile Leu Gly Trp Ser Phe Ser Thr Asn Gly Thr Ala Ala Gln

225 230 235 240

Leu Asn Thr Ser Arg Ile Pro Met Ala Pro Ser Lys Gln Asn Asp Gly

245 250 255

Ser Ser Phe Asp Thr Arg Val Ile Gly Leu Ile Val Ala Leu Ser Thr

260 265 270

Val Thr Val Leu Leu Leu Gly Ile Leu Ile Tyr Phe Thr Leu Tyr Lys

275 280 285

Arg Asn Ala Lys Tyr Glu Asp Leu Glu Asp Trp Glu Leu Asp Tyr Cys

290 295 300

Pro His Arg Phe Arg Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Ala Thr Arg Gly Phe

305 310 315 320

Gln Leu Ser Glu Ile Ile Gly Val Gly Gly Phe Ala Ala Val Tyr Lys

325 330 335

Gly Val Leu Pro Thr Thr Gly Thr Glu Val Ala Val Lys Lys Ile Thr

340 345 350

Gln Ser Ser Ile Gln Gly Leu Arg Glu Phe Val Ala Glu Ile Glu Ser

355 360 365

Leu Gly Arg Leu Arg His Lys Asn Leu Val Tyr Leu Gln Gly Trp Cys

370 375 380

Lys Arg Lys Asn Asp Leu Leu Leu Val Tyr Asp Tyr Ile Pro Asn Gly

385 390 395 400

Ser Leu Tyr Ser Leu Leu Phe Asn Gln Glu Gln Gly Phe Val Leu Ser

405 410 415

Trp Glu Lys Arg Phe Asn Ile Ile Lys Gly Ile Ala Ala Gly Leu Leu

420 425 430

Tyr Leu His Glu Glu Trp Glu Leu Val Val Ile His Arg Asp Val Lys

435 440 445

Ser Ser Asn Val Leu Ile Asp Ala Asp Met Asn Ala Arg Leu Gly Asp

450 455 460

Phe Gly Leu Ala Arg Leu Tyr Asp His Gly Thr Asp Ser His Thr Thr

465 470 475 480

Asn Ile Val Gly Thr Val Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Leu Ala Arg Asn

485 490 495

Gly Lys Ala Ser Thr Ser Ser Asp Val Phe Ala Tyr Gly Val Leu Leu

500 505 510

Leu Glu Ile Val Cys Gly Arg Lys Pro Val Asp Ser Arg Asn Phe Phe

515 520 525

Leu Val Asp Trp Val Ile Glu Cys His Gln Met Gly His Ile Leu Asp

530 535 540

Ala Met Asp Pro Lys Leu Asn Ser Ser Tyr Val Thr Glu Glu Val Lys

545 550 555 560

Leu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Cys Ser His Pro Lys Pro Glu Val

565 570 575

Arg Pro Ser Met Ser Lys Ile Val Arg Tyr Leu Asn Gly Asp Glu Arg

580 585 590

Ile Pro Ser Ile Asp Asn Trp Glu Ala Phe Asp Ser Ser Asp Glu Thr

595 600 605

Tyr Leu Lys Phe Leu Glu Thr Val Ser Ser Asp Ser Ile Thr Lys Ser

610 615 620

Tyr Arg Leu Ser Ser Ile Ala Gly Phe Ser Ser Ser Ser Met Ser Ser

625 630 635 640

Gly Arg

Claims

1.沉默GhLecRK1基因在降低植物抗黄萎病的抗性中的应用，所述GhLecRK1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1相同或所述GhLecRK1基因编码的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同，所述植物为棉花。