CN113151320B

CN113151320B - 马铃薯StLecRK-VI.1与StTET8基因及其在改良晚疫病抗性中的应用

Info

Publication number: CN113151320B
Application number: CN202110301041.4A
Authority: CN
Inventors: 田振东; 郭磊; 戚烨通; 周晶
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-03-22
Filing date: 2021-03-22
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2041-03-22
Also published as: CN113151320A

Abstract

本发明提供了马铃薯StLecRK‑VI.1与StTET8基因及其在改良晚疫病抗性中的应用，在马铃薯中干涉凝集素类受体激酶StLecRK‑VI.1基因能够提高马铃薯晚疫病抗性，而且马铃薯中干涉该基因没有明显表型变化。StLecRK‑VI.1与正调控晚疫病抗性的蛋白StTET8互作且能导致互作蛋白StTET8的蛋白表达量降低。因此，通过干涉StLecRK‑VI.1基因和(或)过表达StTET8基因可提高马铃薯晚疫病抗性。

Description

马铃薯StLecRK-VI.1与StTET8基因及其在改良晚疫病抗性中的应用

技术领域

本发明属于马铃薯晚疫病抗性基因挖掘领域，具体涉及马铃薯StLecRK-VI.1与StTET8基因及其在改良晚疫病抗性中的应用。

背景技术

马铃薯是世界继水稻，小麦，玉米后的第四大粮食作物。是我国极为重要的粮菜兼用作物，我国马铃薯种植面积和产量均居世界第一，约占四分之一。马铃薯在保障世界和我国粮食安全中具有十分重要的作用。晚疫病是马铃薯的全球性严重病害，有着马铃薯“癌症”之称。晚疫病抗性是马铃薯育种的重要目标，选育持久抗性品种一直是国内外育种者努力攻克的难题。

目前世界上马铃薯晚疫病抗病育种严重依赖来自马铃薯野生种S.demissum的主效抗病基因R1-R11。由于晚疫病病原菌快速进化，这些抗病基因在生产中已被克服，几乎失去了利用价值(Vleeshouwers et al.,2011)。尽管人们努力在大量野生种中寻找和发掘具有持久和广谱抗性特点的R基因，只找到了为数不多的此类R基因，但从长远角度来看，此类R基因迟早会被快速进化的晚疫病菌克服(Ghislain et al.,2019；Vleeshouwers et al.,2011；Fry,2008)。在与病原协同进化过程中，植物体内也进化出不依赖病原小种，对多种病害具有防卫作用的基础防御系统，通过调控这些参与基础防御基因的表达，理论上可以提高植物的持久和广谱抗性，特别是利用干涉或基因编辑改造负调控基因的策略在马铃薯晚疫病抗性改良中已展现出良好应用前景(Kieu et al.,2021；Hegde et al.,2021；Sun etal.,2016)。

凝集素类受体蛋白激酶(Receptor like protein kinase，RLK)属于植物模式识别受体的一类，是构成植物基础免疫应答系统的重要组分(Couto and,Zipfel，2016；Bellande et al.,2017)。模式植物拟南芥中凝集素类受体蛋白激酶功能研究表明，这类蛋白参与对各种病害包括真菌、细菌、卵菌的抗性。凝集素类受体蛋白激酶基因在改良作物抗性中具有很大潜力(Wang and Bouwmeester,2017；Zhang et al.,2019)。生物信息学研究表明马铃薯中含有113个凝集素类受体蛋白激酶基因,但是绝大多数该类基因的功能未知，严重限制了这类基因在改良马铃薯晚疫病抗性中的应用步伐(Zhang et al.,2020)。

动植物中的四跨膜蛋白超家族(TM4SF)能联合家族内外的多种蛋白形成巨大的蛋白网络来调控细胞功能，参与病原体的识别与进入、胞间和胞内信号转导、细胞迁移、黏附，以及癌细胞转化、生长、侵袭及转移过程(Charrin et al.,2014)。研究证明拟南芥四跨膜蛋白TET8作为分泌体的组分，参与外泌体(extracellular vesicles)的形成(Liu et al.,2020)。TET8在拟南芥中参与对真菌Botrytis cinerea的抗性(Cai et al.,2018)。在茄科植物，包括马铃薯和番茄中尚未报道此类基因参与植物抗病性的报道。

本发明发现和确证了一个马铃薯凝集素类受体激酶基因StLecRK-VI.1及其互作蛋白StTET8协同调控马铃薯晚疫病抗性，StLecRK-VI.1负调控马铃薯晚疫病抗性，StTET8正调控晚疫病抗性，同时StLecRK-VI.1通过影响StTET8蛋白稳定性抑制其功能。因此，本发明提供了两个相关联的改良马铃薯晚疫病抗性的靶标基因。1.通过干涉StLecRK-VI.1降低该基因表达量或利用基因编辑敲除该基因，可以提高晚疫病抗性；2.提高StTET8基因表达量可提高马铃薯晚疫病抗性。

现有技术存在的问题：选育具有晚疫病广谱抗性的品种是马铃薯抗病育种的主要育种目标。目前，由主效抗病基因(R基因)控制的抗性很容易被快速进化的晚疫病菌克服，在马铃薯晚疫病广谱抗性改良中缺乏有效的抗病基因。理论上植物自身含有很多抗病防卫基因，尽管这些基因提供的抗性不如抗病基因强，但具有广谱持久特点。通过改造或利用这些基因可以提高马铃薯晚疫病广谱抗性，但此类靶标基因在马铃薯中报道较少。目前，在马铃薯晚疫病广谱抗性改良中缺乏有效的防卫相关靶标基因。凝集素类受体激酶基因是潜在的理想靶标，但目前未见有关StLecRK-VI.1与StTET8基因调控马铃薯晚疫病抗性的报道。

发明内容

本发明要解决的关键技术问题在于通过系统研究揭示一个晚疫病抗性负调控凝集素类蛋白激酶基因StLecRK-VI.1通过抑制一个正调控基因StTET8调控马铃薯晚疫病抗性的作用，研究结果为改良马铃薯晚疫病抗性提供了两个靶标基因。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

1.马铃薯StLecRK-VI.1基因，所述StLecRK-VI.1基因CDS序列如序列表SEQIDNo.1所示。

2.马铃薯StTET8基因，所述StTET8基因CDS序列如序列表SEQID No.2所示。

3.StLecRK-VI.1基因提高马铃薯晚疫病抗性的应用，利用干涉StLecRK-VI.1基因表达提高马铃薯晚疫病抗性，StLecRK-VI.1基因CDS序列如序列表SEQID No.1所示。

4.StTET8基因提高马铃薯晚疫病抗性的应用，利用过表达StTET8基因提高马铃薯晚疫病抗性，StTET8基因CDS序列如序列表SEQID No.2所示。

5.StLecRK-VI.1基因和StTET8基因同时提高马铃薯晚疫病抗性的应用，利用干涉StLecRK-VI.1基因表达，同时过表达StTET8基因提高马铃薯晚疫病抗性。

6.马铃薯StLecRK-VI.1互作降低StTET8蛋白稳定性的应用，互作筛选方法包括：

(1)酵母双杂交验证互作；(2)双分子荧光互补(BiFC)验证互作；(3)StLecRK-VI.1互作影响StTET8蛋白稳定性。

7.马铃薯StLecRK-VI.1基因提高马铃薯晚疫病抗性的验证方法，包括：(1)StLecRK-VI.1基因晚疫病胁迫表达分析；(2)StLecRK-VI.1基因克隆；(3)瞬时表达载体构建；(4)植物干涉表达载体构建。(5)马铃薯遗传转化；(6)转基因阳性株系检测；(7)转基因马铃薯抗性鉴定；(8)本氏烟草中验证StLecRK-IV.1功能。

有益效果：首次报道在马铃薯中干涉凝集素类受体激酶StLecRK-VI.1基因能够提高马铃薯晚疫病抗性，马铃薯中干涉该基因没有明显表型变化；StTET8正向调控晚疫病抗性。StLecRK-VI.1与正调控晚疫病抗性的蛋白StTET8互作且能导致互作蛋白StTET8的蛋白表达量降低，从而影响其功能的发挥。本发明提供了两个改良马铃薯晚疫病抗性的靶标基因。(1)通过干涉StLecRK-VI.1基因降低该基因表达量或利用基因编辑敲除该基因，可以提高晚疫病抗性；(2)通过增加其调控蛋白基因StTET8的表达量可提高马铃薯晚疫病抗性。

附图说明

图1为StLecRK-VI.1响应晚疫病菌诱导；

其中，用晚疫病菌接种马铃薯叶片后0,24,48,72小时后分别取样，抽提总RNA，反转录成cDNA，用qRT-PCR检测StLecRK-VI.1基因表达，发现该基因在接种24小时时表达显著下调。

图2为pHellsgate8-StLecRK-IV.1-RNAi干涉载体示意图；

其中，LR，RB表示农杆菌左右边界，抗性筛选标记为卡那霉素(Kan)，干涉主体结构为烟草花叶病毒35S启动子驱动，反向插入的StLecRK-VI.1基因干涉片段，中间被内含子PDK分开，转录出RNA后，两个反向插入的干涉片段形成发卡结构，PDK形成环。attR为重组位点。

图3为干涉转基因马铃薯植株干涉效率检测与表型；

其中，A.以基因组DNA为模板，使用载体引物PDK-F：和反向基因引物：StLecRK-IV.1-ER PCR进行扩增，发现3个干涉转基因株系(Line11，13，20)为阳性。WT为非转基因对照。B.qRT-PCR检测干涉株系基因表达量，在p<0.5水平，干涉株系表达量显著降低。C.一个干涉株系与对照植株长势比较，没有发现明显的表型变异。

图4为干涉StLecRK-IV.1提高马铃薯晚疫病抗性；

其中，A.对照(E3)和干涉株系接种晚疫病菌后5天后的病斑症状。B.病斑面积统计显示，3个干涉转基因株系病斑面积显著小于对照。C.3个干涉转基因株系叶片产生的病菌孢子数显著小于对照。

图5为本氏烟中超表达StLecRK-VI.1降低晚疫病抗性，干涉NbLecRK-VI.1提高抗性；

其中，A.在本氏烟中超表达StLecRK-VI.1-GFP后病斑面积显著大于对照载体，表明晚疫病抗性显著降低。B.在本氏烟中利用病毒介导的基因沉默NbLecRK-VI.1导致病斑面积显著减小，表明晚疫病抗性显著增强。

图6为膜系统酵母系统点对点酵母双杂验证StTET8与StLecRK-VI.1互作；

其中，共转化pBT3-SUC-StLecRK-IV.1和pPR3-N-StTET8质粒的酵母可以在二缺(SD-Leu-Trp)和四缺(SD-Leu-Trp-His-Ade)培养基上生长，在X-gal上显蓝(黑白图无法显示)；阳性对照酵母(pTSU2-APP+pNubG-Fe65)在二缺和四缺培养基上生长，在X-gal上显蓝；阴性对照酵母(pTSU2-APP+pPR3-N)在二缺上粉色(黑白图无法显示)，四缺培养基上不生长，在X-gal上不显蓝。证明StLecRK-IV.1与StTET8在酵母中互作。

图7为黄色荧光互补实验证实StLecRK-IV.1与StTET8互作；

其中，在本氏烟中共表达StLecRK-IV.1-cYFP与StTET8-nYFP有黄色荧光，与nYFP或StHsp70-3-nYFP表达无黄色荧光，表明StLecRK-IV.1与StTET8互作。

图8为StLecRK-IV.1特异影响StTET8蛋白稳定性；

其中，A.无论蛋白酶体抑制剂MG132存在与否，StLecRK-IV.1与StTET8共表达都会导致StTET8蛋白表达减弱。B.StLecRK-IV.1与StTET8共表达导致StTET8蛋白表达减弱，而StTET8与对照GFP-EV共表达，StTET8蛋白表达未变化。C.StLecRK-IV.1与cMyc-GUS共表达不改变GUS表达。以上结果表明StLecRK-IV.1特异影响StTET8蛋白稳定性。+表示表达，-为不表达。PS为丽春红蛋白染色。Western Blot图片为利用所示特异抗体杂交信号。

图9为超表达StTET8提高晚疫病抗性，StLecRK-IV.1抑制StTET8的正调控功能；

其中，A.在本氏烟叶片中瞬时表达对照Myc-EV及Myc-StTET8接种6天后的病斑照片及B病斑面积统计，超量表达Myc-StTET8后病斑面积显著减小。C.StLecRK-IV.1与StTET8共表达抑制StTET8功能，D.病斑面积显著大于单独表达StTET8，小于单独表达StLecRK-IV.1。

具体实施方法

本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供马铃薯StLecRK-VI.1基因，包括：

1.马铃薯StLecRK-VI.1基因，CDS序列如序列表SEQID No.1所示，包含1998bp核苷酸。

2.马铃薯StTET8基因，CDS序列如序列表SEQID No.2所示，包含801bp核苷酸。

实施例2

本实施例提供马铃薯StLecRK-VI.1基因克隆和植物干涉载体构建方法，包括：

1.StLecRK-VI.1基因晚疫病胁迫表达分析

利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究发现，马铃薯中一个未知功能凝集素类受体激酶(Lectin receptor like kinase)基因(GenBank编号，XP_006341207.2)，响应晚疫病原菌诱导，在晚疫病抗性材料中诱导24小时下调表达，意味着该基因可能参与晚疫病抗性(图1)。StEF1α作为内参基因，正向引物为5’-ATTGGAAACGGATATGCTCCA-3’，反向引物为5’-TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3’。StLecRK-IV.1正向特异性引物为5’-CGATTTCACCTACAACGGGT-3’，反向特异性引物为5’-GACCCTCCTGCAATTGTGAA-3’。使用BlasTaqTM2×qPCR MasterMix(ABM)试剂盒推荐反应体系，反应程序为：95℃3min；95℃20s，58℃20s；40个循环(步骤2-3)，用2^-△△Ct法进行数据分析。

2.StLecRK-VI.1基因克隆

根据该基因编码区序列(1998bp)设计扩增引物：AttB1-StLecRK-IV.1-F:AAAAAAGCAGGCTTCATGGAGAAATTGTTTTTAGCCATG；AttB1-StLecRK-IV.1-R:CAAGAAAGCTGGGTTTCGACCACCGGAGAGAAG。

以马铃薯材料DM1-3抽提的RNA反转录cDNA作为模板，扩增该基因的CDS全长序列。PCR反应体系为：模板DM cDNA 2μl(100ng)，正反向引物各2μl(10μM)，dNTP Mix 1μl(10mM)，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，2×Phanta Max Buffer 25μl，灭菌蒸馏水补齐至50μl。反应程序为：95℃5min；95℃20s，58℃20s，72℃90S，35个循环；72℃，10分钟。再以获得的产物为模板，以AttB2-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT，AttB2-R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT引物扩增，得到的PCR片段用Magen公司的HiPure Gel Pure DNA Mini Kit试剂盒进行回收。

3.瞬时表达载体构建

回收基因片段利用BP重组酶(Gateway BP ClonaseTMⅡEnzyme mix,

)插入入门载体pDONR221，构建pDONR221-LecRK-IV.1；再将构建成功的pDONR221-LecRK-IV.1载体与目的载体pK7FWG2.0(融合C端GFP)进行LR重组反应(Gateway LR ClonaseTMⅡEnzyme mix,

)。通过测序确认插入目的基因。然后将融合载体质粒pK7FWG2.0-LecRK-IV.1(以下简称PK7-LecRK-IV.1)通过电击法转化农杆菌GV3101中备用。

4.植物干涉表达载体构建

利用Spud DB Search网站分析StLecRK-IV.1基因序列，在StLecRK-IV.1基因序列上找到适宜构建干涉载体的300bp大小的特异片段，命名为StLecRK-IV.1-RNAi，并用正向引物RNAi-F:5'-AAAAAAGCAGGCTTCGATCAAAGGGTATCGGACGAG-3’，反向引物RNAi-R:5'-CAAGAAAGCTGGGTTCCATGACATTGCAAAATGATCAAAG-3’，以pK7 FWG2.0-LecRK-IV.1质粒为模板进行PCR扩增，得到目标片段后用Gateway重组法将该片段构建到pHellsgate8干涉载体上，获得干涉载体pHellsgate8-StLecRK-IV.1-RNAi(图2)。将该干涉载体通过电击法转入到农杆菌LBA4404中。加入15％的甘油后-70℃保存待用。

实施例3

本实施例提供干涉马铃薯StLecRK-VI.1基因表达提高晚疫病抗性的应用，包括：

1.马铃薯遗传转化

以马铃薯试管薯薄片为外植体，马铃薯品种为‘鄂马铃薯3号’(以下简称‘E3’)。转化方法为农杆菌转化法，具体参照Si et al.(2003)。薯片与农杆菌在P1培养基上共培养2天，然后在筛选培养基P2(含有kan)上培养抗性芽，当筛选培养基上抗性芽长至大于0.5cm时，剪下转移至含有筛选抗生素(kan)和头孢霉素(cef)的生根培养基P3中进行生根培养，最终获得完整植株。转基因培养基见表1。

表1马铃薯转基因培养基

2.转基因阳性株系检测

在超净工作台中剪取待测苗1-2个小叶片于2ml离心管中。用CTAB法提取DNA。DNA提取完成后，以其作为模板进行PCR转基因株系检测，使用载体引物PDK-F：5'-CTAATGCTAATATAACAAAGCGCAAGATC-3’，反向引物为基因引物：StLecRK-IV.1-ER:5'-TCAAAGGGTATCGGACGAG-3’，用PCR进行扩增，电泳检测获得3个转基因植株(图3A)。利用植物RNA快速提取试剂盒(庄盟)进行RNA的提取转基因植株和对照植株总RNA，然后，利用RTMasterMix with AccuRT(ABM)试剂盒反转录产生cDNA。利BlasTaqTM2×qPCR MasterMix(ABM)定量PCR试剂，以StEF1α作为内参基因，正向引物为EF1α-F5’-ATTGGAAACGGATATGCTCCA-3’，反向引物为EF1α-R：5’-TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3’。qRT-StLecRK-IV.1-F正向特异性引物:qRT-StLecRK-IV.1-F：5’-CGATTTCACCTACAACGGGT-3’，反向特异性引物qRT-StLecRK-IV.1-R:5’-GACCCTCCTGCAATTGTGAA-3’进行荧光定量PCR，反应程序为：95℃3min；95℃20s，58℃20s；40个循环(步骤2-3)用2^-△△Ct法进行数据分析。结果显示3个干涉转基因植株中StLecRK-IV.1表达量显著下降(图3B)。转基因植株与对照植株表型没有明显差异(图3C)，块茎性状也无变化，表明该基因的干涉不会影响马铃薯植株的生长发育。

3.转基因马铃薯抗性鉴定

将阳性转基因植株和对照植株移栽至大棚内塑料钵中，取6-7周健壮植株上的上部充分展开叶片用于晚疫病抗性鉴定。晚疫病菌株为强毒力菌株HB09-14-2，先在燕麦培养基上18℃黑暗培养2周，接种前用无菌水将培养基上的孢子囊洗下，孢子囊浓度调整到70-80个/μl，然后置于4℃下2小时释放游动孢子。每次每个株系至少20片叶(三次重复)。将叶片叶背朝上平铺在垫有吸水纸的接种箱内，吸水纸提前用喷壶喷湿，然后用移液枪滴10μl菌液于叶片背面，接种完毕，用喷壶轻轻喷湿叶面，盖上盖子密封保湿，湿度控制在70％-80％，接种第一天遮光，放在20℃，光/暗：16h/8h环境下培养。第6天测量病斑直径并拍照。用3ml ddH₂O洗下叶片上产生的孢子，用血球计数板统计孢子数。用GraphPad软件统计数据并作图。结果如图4所示，三个StLecRK-IV.1干涉转基因株系不论病斑面积(图4A,B)，还是叶片上形成的孢子都显著少于对照(图4C)，表明干涉转基因株系晚疫病抗性显著增强。

4.本氏烟草中验证StLecRK-IV.1功能

瞬时超量表达StLecRK-IV.1验证基因功能：为了进一步验证StLecRK-IV.1的功能，首先在本氏烟中利用农杆菌瞬时超量表达技术表达StLecRK-IV.1基因。将含有表达载体pK7FWG2.0-StLecRK-IV.1的农杆菌GV3101悬浮于3ml MES(10mM MES，10mM MgCl2，pH5.6，灭菌)溶液，用分光光度计调整农杆菌OD600浓度为0.1，加入1‰的乙酰丁香酮(AS)，以pK7FWG2.0空载菌液为对照，静置两小时后，用一次性注射器将菌液注射入本氏烟叶片(4周左右的本氏烟，每个叶片以叶脉为分界线，一侧对照组，一侧处理组)，一天后将叶片摘下放入培养箱内进行接种鉴定，选用晚疫病菌88069菌株接种，孢子数调整到150-160个/μl，每个接种点接10μl。6天后统计测量病斑直径。结果表明本氏烟叶片中超表达StLecRK-IV.1基因能够显著增加晚疫病病斑面积(图5A)。

本氏烟草中沉默StLecRK-IV.1同源基因NbLecRK-IV.1:通过网站https://solgenomics.net在线设计大小为400bp的特异片段，以本氏烟cDNA为模板，用正向引物：NbLecRK-IV.1-VF：5'-tgagtaaggttaccgaattcGGCTCAGTTGTTTCAACACAATA-3’，反向引物NbLecRK-IV.1-VR：5'-gtgagctcggtaccggatccCATGAGATACCCTCTTGACTGC-3’进行PCR扩增，PCR产物纯化后通过酶切(Eco RI和Bam HI)连接法插入病毒沉默载体TRV2，获得TRV2-NbLecRK-IV.1载体。载体质粒电击转化农杆菌GV3101中。将OD600＝0.3的TRV2-NbLecRK-IV.1：RV1农杆菌菌液1:1等体积混匀，注射苗龄为10d的本氏烟，PDS为沉默表型指示对照，注射完3周后，利用qRT-PCR检测沉默效率，正向引物为NbLecRK-IV.1-qF:5'-TGTGGGAGAAGGCCAATAGA-3’，反向引物为NbLecRK-IV.1-qR：5'-TGGTCTAGCTGTTGGTTGTG-3’。检测结果显示沉默效率良好，达到70％以上。剪取沉默叶片用晚疫病菌88069接种，具体方法同上，三次重复实验的病斑统计结果分析得知，干涉NbLecRK-IV.1后，叶片病斑面积显著减小，说明本氏烟叶片晚疫病抗性增强(图5B)。

以上结果证明，NbLecRK-IV.1在本氏烟中也扮演负调控晚疫病抗性的功能，沉默后提高抗性，超表达降低抗性。

实施例4

本实施例提供马铃薯StLecRK-VI.1互作降低StTET8蛋白稳定性的应用，包括：

1.酵母双杂交验证互作

通过膜系统酵母文库筛选到StLecRK-IV.1的一个互作蛋白StTET8。点对点验证结果如图6所示，共转化pBT3-SUC-StLecRK-IV.1和pPR3-N-StTET8质粒的酵母可以在二缺(SD-Leu-Trp)和四缺(SD-Leu-Trp-His-Ade)培养基上生长，在X-gal上显蓝，与阳性对照酵母(pTSU2-APP+pNubG-Fe65)相似，而阴性对照酵母(共转pTSU2-APP+pPR3-N)在二缺上粉色，四缺(SD-Leu-Trp-His-Ade)培养基上不生长，在X-gal上不显蓝。证明StLecRK-IV.1与StTET8在酵母中互作(图6)。

2.双分子荧光互补(BiFC)验证互作

通过gateway重组法将StLecRK-IV.1装入pCL113(即StLecRK-IV.1-cYFP)，将StTET8装入载体pCL112(即StTET8-nYFP)。将黄色荧光互补载体电击法转化农杆菌GV3101。在苗龄4周左右本氏烟叶片上进行农杆菌瞬时表达(OD600为0.1)，利用激光共聚焦显微镜进行黄色荧光观察。结果显示，阴性对照无黄色荧光，而StLecRK-IV.1-cYFP和StTET8-nYFP共表达后出现明显黄色荧光(图7)。证明StLecRK-IV.1与StTET8蛋白在植物活细胞中能够互作。

3.StLecRK-VI.1互作影响StTET8蛋白稳定性

StLecRK-IV.1对StTET8的功能具有抑制作用(图9C，D)，为探讨StLecRK-IV.1是否影响StTET8蛋白稳定性，在四周苗龄的本氏烟幼嫩叶片左右两边分别瞬时表达Myc-StTET8，LecRK-IV.1-GFP+Myc-StTET8(OD600均为0.5)，注射两天后，用直径为9mm的打孔器进行取样，每个样品取四个小圆片放入2ml带有钢珠的离心管中，用磨样机磨碎样品，加入400μl的提取液(10％甘油,25mM Tris-HCL pH＝7.5,300mM NaCl,1mM EDTA,10mM DTT,protease inhibitor cocktail，1mM PMSF，0.2％Nonidet P40)并置于冰上待提取液浸润植物样品，然后涡旋震荡混匀，置于冰上30min，每10min涡旋震荡一次。然后4℃离心10min，吸取200μl上清液转移至新的离心管中，加入等体积的2×SDS loading Buffer(使用前加入200mM DTT)95℃变性10min，用于Western blot。

SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，然后转移至PVDF膜置上，用含5％脱脂奶粉的PBST中杂交封闭1-2h。根据蛋白融合的标签杂交相应的抗体，抗体按照1:2000-1:5000的比例加入，4℃杂交过夜或室温杂交2h，用PBST清洗4-5次(每次5-10min)。然后室温杂交二抗1h后PBST冲洗4-5次。采用化学发光染色法检测，拍照。用丽春红对膜进行染色3min后即可观察以确定蛋白上样量，拍照。

结果表明StLecRK-IV.1与StTET8共表达时，StTET8蛋白表达量明显低于StTET8单独表达，蛋白酶体抑制剂MG132不影响此过程(图8A)。而GFP与StTET8共表达时，StTET8蛋白表达量与StTET8单独表达时无差别(图8B)。另外，StLecRK-IV.1与GUS共表达时，GUS蛋白表达量不受StLecRK-IV.1影响(图8C)。证明StLecRK-IV.1与StTET8互作导致StTET8蛋白稳定性降低，促使StTET8被降解。综上所述，StLecRK-IV.1与正调控因子StTET8互作，促使StTET8稳定性降低，从而使其被降解，以此发挥负调控马铃薯免疫的功能。

实施例5

本实施例提供马铃薯StTET8增强晚疫病抗性的应用，包括：

为了验证StTET8对于晚疫病抗性的功能，通过重组连接(One StepCloning Kit，

)将StTET8插入pH7LIC载体，构建植物表达载体pH7LIC-Myc-StTET8)。将其转入农杆菌GV3101中。在本氏烟中瞬时表达pH7LIC-StTET8及对照Myc-EV，1天后接种晚疫病菌88069，6天后统计发病面积，与对照相比，发现瞬时超量表达StTET8本氏烟病斑面积显著减小(图9A，B)

鉴于StLecRK-IV.1与StTET8在晚疫病抗性中起相反的功能。为了确定StLecRK-IV.1与StTET8之间的关系，在本氏烟叶片上四个点分别共注射StLecRK-IV.1与StTET8，Myc-EV，以及StLecRK-IV.1+StTET8，结果显示StLecRK-IV.1和StTET8共表达时StLecRK-IV.1抵消StTET8正调控晚疫病抗性的功能，但总体上病斑面积大于对照Myc-EV(图8C，D)。证明StLecRK-IV.1对StTET8的功能具有抑制作用。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

参考文献：

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<110> 华中农业大学

<120> 马铃薯StLecRK-VI.1与StTET8基因及其在改良晚疫病抗性中的应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1998

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum）

<400> 1

1 ATGGAGAAAT TGTTTTTAGC CATGATTTTT CAGTTTCTTG TTTTACTTTT TCATGCTCCA

61 TTAGGCTATG CAGCTGCAGA AGATCTCGAT TTCACCTACA ACGGGTTCCA CTCAACAAAC

121 TTGAGTCGTG ATGGAATAGC AGAGTTCACA TCAGATGGCT TGTTAAGGCT AACTAATGCT

181 TCACAATTGC AGGAGGGTCA TGCTTTTTAT CCTAGACCTA TCAATTTCAT GAATTTAGCA

241 TCTAATGGTT CAGATTTCTC TTTCTCAACC ACATTTGTCT TTGCCATAGT GCCTGAGTAC

301 TCGATTTTAG CTGGTCATGG TATGTCTTTT GTGATTGCAC CAGCTAGAAG GCTTCCAGAA

361 GCACTTCCAA GCTCTTATCT TGGCTTGTTT AATGATTCTA GCAATGGAAA TGCCACCAGC

421 CATGTTGTTG CGGTGGAGTT TGACACGCTA CAGAACCGTG AATTTGATGA TATTGACAGC

481 AACCATGTAG GCATTGACAT CAATGGCCTA AAATCTGTAA TAGCCAAGCC GGCCGGTTAT

541 TATACCAGTA ATGAGAAATC CTTCAATAAC TTAACTCTTG CTAGTGGCCA GCCAATGCAA

601 GTTTGGGTGG AATATGATTC TGTGGATAAG CATATGAATG TCACAATGGC TCCACTGCAC

661 GTTGCAAAAC CAGACCGTCC TCTCCTGTCC TTAGTCTACG ATCTTTCATC TGTCATGGAT

721 GAAAACGTGT CTATAGGCTT CTCAGCATCC ACCGGTGCAG TTGTTTCAAC ACATTATATC

781 CTTGGATGGA GCTTTAAAAT GAATGGAGTG GCTCAAGGGC TTGATCTCTC TCAACTTCCT

841 AAGCTTCCTC GAGTAGTACC TAAGAAAGAA TCCAAGCTTT TATTGCTTGG TTTGCCCGTG

901 ATTTCTTCAG TTTCATTTGT GATTGTAGTC CTGGTAATAA TTTATTACAT AGGAAAGAAG

961 ATGAAGTTTG CTGAATTGCA AGAAGAGTGG GAGCTTGATT ATGGACCACA CAGGTTCAAG

1021 TACAAGGATT TGTACACTGC CACAAAGGGC TTTAGCAGCA AGGATTTGTT GGGATCCGGG

1081 GGATTTGGCA GAGTCTACAG AGGGGTATTG CCCATATCCA ACATTCAGAT AGCAGTCAAG

1141 AGGGTCTCTC ATGAATCAAG ACAAGGGATG AGGGAATTTG TTTCAGAAAT TGTTAGTATT

1201 GGCCGGCTAC GCCACAGGAA TTTAGTACCA CTTTTGGGTT ATTGCAGGCG TAAAGGAGAG

1261 TTACTTCTGG TTTACGAATG CATGCCTAAC GGAAGCCTAG ACAAGTATTT GTTTGACAAA

1321 CCAAGCTGCA CTCTTGATTG GAACCAAAGA TTTCGAGTCA TCAAAGGCGT AGCATCAGGA

1381 CTAGTCTATC TTCATGAAGA GTGGGAACAA GTAGTGATTC ATAGAGATAT AAAAGCGAGT

1441 AACGTGTTGT TAGATGTTGA ATTAAATGGA AGATTAGGAG ATTTTGGGCT AGCAAGATTG

1501 TATGATCATG GGACAGATCC TCAAACTACG CATATCGTTG GAACTCTCGG ATACCTTGCC

1561 CCAGAGCATA CAAGAACAGG CAAAGCCACA ACTAGCACTG ATGTGTATTC ATTTGGGGCA

1621 TTTTTACTTG AGGTGGCTTG TGGGAGAAGG CCAATAGATC AAAGGGTATC GGACGAGGAC

1681 CTCGTTTTGG TTGACTATGT ATTCTCTTGT TGGACTAGAG GTGATATTGT TGAAGCCATT

1741 GATCCAAACT TGGGCAATAA CTATGTAAAA GAAGAGGTTG AGTTGGTACT AAAACTTGGA

1801 CTATTGTGCT CTCAGACAGA ACCAGCAGCT AGGCCAAATA TGAGGCAAGT GTTGATGTAC

1861 TTGGAAAATG CCCTGCCTTT GCCAGAGTTA TCACTGATGC AAACTTCAAA TATTAGCTTA

1921 ACTTTTGCAG GCTTTGATCA TTTTGCAATG TCATGGTCTT CTTCTGTTAC TGATTCCCTT

1981 CTCTCCGGTG GTCGATGA

<210> 2

<211> 801

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum）

<400> 2

1 ATGGTGCGTT GTAGCAACAA TTTAGTGGGG ATTCTGAATA TAGTGACCCT TTTGTTGTCG

61 ATCCCAATTA TAGGAGGAGG GATATGGTTG TCAAGACAAG CAAATACAGA GTGTGAGAGG

121 TTTCTTGAAA AGCCAGTAAT AGCAATAGGA GTTTTTATAT TGCTTGTTTC ATTGGCTGGT

181 ATAATTGGAT CTTGCTGTAG AGTGACTTGG TTACTTTGGG TTTATCTACT TGTTATGTTT

241 TTGTTGATTT TGCTACTTTT CTGTTTCACA ATCTTTGCTT TTGTGGTGAC TAATAAGGGT

301 GCTGGTGAAA AAATTTCTGG TAGAGGGTAT AAGGAGTATA GATTTGGGGA TTATTCTAAT

361 TGGTTGCAGA AAAGAGTTGA TAAGAATTGG AATAGAATTC ATAGTTGTTT GCAGGATAGT

421 AAGATTTGTG ATACCTTGAT TCAAGGATCT AATACTAAAG CTGATGATTT CTTCAAGGAA

481 CATCTATCTG CTCTTCAGTC TGGTTGCTGC AAGCCATCAA ATGACTGTAA CTTCCAGTAC

541 GTGAGCCCAA CAAACTGGAC AAAACCATCG ACCCCATCCG CTACCAATCC AGACTGTAAT

601 AGCTGGAACA ACGACCCGAA AGTATTGTGC TATGGCTGCC AATCCTGCAA AGCTGGGCTG

661 CTAGACAACG TCAAGAGTGA CTGGAAGAGG GTGGCTGTGC TCAACATCAT TTTCCTCGTC

721 TTCCTCATCA TCGTCTACTC TATCGGATGT TGTGCCTTCA GGAACAACCG AGAGGACAAT

781 GCTTGGAAGC GTTATCCTTA A

Claims

1.StLecRK-VI.1基因提高马铃薯晚疫病抗性的应用，其特征在于利用干涉StLecRK-VI.1基因表达提高马铃薯晚疫病抗性，StLecRK-VI.1基因CDS序列如序列表SEQID No.1所示。

2.StTET8基因提高马铃薯晚疫病抗性的应用，其特征在于利用过表达StTET8基因提高马铃薯晚疫病抗性，StTET8基因CDS序列如序列表SEQID No.2所示。

3.StLecRK-VI.1基因和StTET8基因协同提高马铃薯晚疫病抗性的应用，其特征在于利用干涉StLecRK-VI.1基因表达，同时过表达StTET8基因提高马铃薯晚疫病抗性，所述StLecRK-VI.1基因CDS序列如序列表SEQID No.1所示，所述StTET8基因CDS序列如序列表SEQID No.2所示。