CN117701589A - 水稻基因OsBi1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻基因OsBi1及其应用。本发明提供水稻OsBi1基因在提高水稻对褐飞虱抗性及抗旱性中的应用，高表达水平的OsBi1基因可以同时显著提高水稻对褐飞虱的抗性及抗旱性。OsBi1基因为改良水稻的抗虫性及抗旱性提供了新的途径，对培育抗褐飞虱和抗旱的水稻新品种材料具有重要的理论和实践意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及水稻基因OsBi1及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是我国和亚洲国家最重要的粮食作物之一。褐飞虱(BPH；Nilaparvata lugens Stal.)，属半翅目飞虱科(Homoptera；Delphacidae)，是水稻单食性害虫，它常常群集于稻丛基部，刺吸水稻韧皮部汁液消耗植株养分，还可以传播水稻草状丛矮病和齿叶矮缩病。当褐飞虱大量爆发，会造成水稻植株的枯萎死亡，在农业生产上俗称“虱烧”现象，造成水稻减产甚至绝收。褐飞虱还是一种迁飞性的害虫，每年3-5月份从中南半岛迁入我国，由于迁入虫源的生物型和数量很难控制，因此褐飞虱又具有隐蔽性、暴发性和毁灭性等特点。目前，褐飞虱已经成为水稻生产中发生面积最大、造成危害最严重的害虫。因此，遏制褐飞虱的发展和危害是保障我国及亚洲水稻生产安全的重大需求。长期以来，化学防治是控制褐飞虱的常见策略。但是化学农药的长期使用，不仅费时费力，污染环境，诱发褐飞虱产生抗药性。同时，化学农药会杀死褐飞虱天敌，使得化学农药的防治效果有限。因此，发掘水稻内源的抗褐飞虱基因、进行育种实践，是防止褐飞虱危害更为经济有效的方法，对保证粮食安全和环境安全具有重要意义。
植物在生长发育的各个阶段，还会受到各种外界环境因素的胁迫，其中，干旱已成为全球范围内对农业负面影响最大的非生物胁迫(Turral et al.,2011)。水稻作为一种高耗水农作物，缺水是限制水稻等大田作物产量最严重的因素之一(Hu and Xiong,2014)。挖掘抗旱基因，提高作物的抗旱性，培育作物抗旱新品种对保障水稻高产稳产和粮食安全生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供水稻基因OsBi1及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供水稻OsBi1基因，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
水稻OsBi1基因为：
i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％ SDS的0.1×SSPE或含0.1％ SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供含有水稻OsBi1基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第三方面，本发明提供水稻OsBi1基因在提高植物对褐飞虱抗性及抗旱性中的应用。
进一步地，所述应用包括：在植物中过表达水稻OsBi1基因，获得抗褐飞虱及抗旱的转基因植株。
第四方面，本发明提供一种提高水稻对褐飞虱抗性及抗旱性的方法，所述方法包括：在水稻中过表达OsBi1基因。
进一步地，所述过表达的方式可选自以下1)～5)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒；
2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
5)通过导入增强子。
进一步地，所述方法包括：将含有所述基因的表达载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的转化方法将所述基因转入水稻，使所述基因在水稻植株中过表达。
第五方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因水稻在植物育种中的应用。
进一步地，育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
第六方面，本发明提供OsBi1基因在植物种质资源改良中的应用。
进一步地，改良目的为提高植物对褐飞虱抗性及抗旱性。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供水稻OsBi1基因在提高水稻对褐飞虱抗性及抗旱性中的应用，高表达水平的OsBi1基因可以同时显著提高水稻对褐飞虱的抗性及抗旱性。OsBi1基因为改良水稻的抗虫性及抗旱性提供了新的途径，对培育抗褐飞虱和抗旱的水稻新品种材料具有重要的理论和实践意义。
附图说明
图1为本发明实施例4中OsBi1过表达转基因植株抗褐飞虱表型分析结果；其中，A为对照日本晴及OsBi1单拷贝纯合过表达转基因植株Nip OsBi1-9、Nip OsBi1-11、Nip OsBi1-16和Nip OsBi1-22中OsBi1表达量分析结果；B为单拷贝纯合OsBi1过表达转基因植株Nip OsBi1-9、Nip OsBi1-11和Nip OsBi1-16苗期抗褐飞虱鉴定结果。
图2为本发明实施例4中OsBi1 CRISPR/Cas9基因敲除植株bi1抗褐飞虱表型分析结果；其中，A为OsBi1 CRISPR/Cas9基因敲除类型；B为OsBi1 CRISPR/Cas9基因敲除植株bi1苗期抗褐飞虱鉴定结果。
图3为本发明实施例4中OsBi1过表达转基因植株抗旱性表型分析结果；其中，A为OsBi1过表达转基因植株和对照日本晴在正常条件下生长至4叶期、干旱胁迫下生长14天及复水6天后的表型结果；B为复水6天后的存活率统计结果。*表示P<0.05。
图4为本发明实施例4中OsBi1 CRISPR/Cas9基因敲除植株bi1抗旱性表型分析结果；其中，A为OsBi1 CRISPR/Cas9基因敲除植株bi1和对照日本晴在正常条件下生长至4叶期、干旱胁迫下生长10天及复水6天后的表型结果；B为复水6天后的存活率统计结果。*表示P<0.05。
具体实施方式
本发明提供OsBi1基因及其编码蛋白在提高水稻抗褐飞虱抗性及抗旱性中的应用。
本发明提供OsBi1基因在提高水稻褐飞虱抗性中的应用，所述OsBi1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
具体地，所述OsBi1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
具体地，所述提高水稻对褐飞虱抗性，是通过在水稻中过表达OsBi1基因，提高水稻对褐飞虱的抗性。
本发明还提供OsBi1基因在提高水稻抗旱性中的应用，所述的OsBi1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
具体地，所述提高水稻抗旱性，是通过在水稻植株中过表达OsBi1基因。
本发明还提供一种提高水稻对褐飞虱抗性及抗旱性的方法，在水稻中过表达OsBi1基因，优选是将含OsBi1基因的过表达载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的转化方法将OsBi1基因转入水稻，使所述OsBi1基因在水稻植株中过表达。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1褐飞虱OsBi1基因的克隆
1、以水稻品种日本晴叶片cDNA作为模板，以Bi1 CDS-F、Bi1 CDS-R为引物，利用KOD Plus Neo(Toyobo)高保真聚合酶进行PCR扩增OsBi1基因编码的CDS序列，得到PCR扩增产物。
Bi1 CDS-F:5’-ATGGCCTGCATCAACACATTC-3’
Bi1 CDS-R:5’-CTAAACCTCCAGCAGGGCTTC-3’
2、将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测大小正确后，切胶纯化回收。加A后连入pMD18-T(Takara)载体，转化Top10大肠杆菌感受态细胞，经菌液PCR鉴定并测序后得到OsBi1基因ORF核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白序列如SEQ ID NO:2示。
实施例2OsBi1基因过表达遗传转化载体的构建
1、转基因骨架载体构建：选用含有糊粉层特异启动子LTP2驱动DsRed红色荧光蛋白表达的质粒模板pCAMBIA1300-DsRed(Song et al.,2021)，用KOD Plus Neo(Toyobo)高保真聚合酶，引物CE Red-F和CE Red-R(CE Red-F：5’-TGTCGTTTCCCGCCTTCAAACCGTCTCTTCGTGAGAATAAC-3’；CE Red-R：5’-GTCAAACACTGATAGTTTAAACGGCCGCATTCGCAAAACACAC-3’；下划线标注的区域为上下游载体末端同源序列)，扩增获得糊粉层特异启动子LTP2-DsRed基因-Pin2终止子的片段，并将条带单一的PCR产物直接纯化回收。
将pCAMBIA1300-Ubi1载体(将玉米Ubi1强启动子插入到质粒pCAMBIA1300的多克隆位点构建而成)用PmeI酶切后回收，与带有pCAMBIA1300-Ubi1载体末端同源序列的糊粉层特异启动子LTP2-DsRed基因-Pin2终止子片段，应用Vazyme公司的II体系进行无缝克隆连接，在20μL体系中加入PmeI酶切后的pCAMBIA1300-Ubi1 200ng，带载体末端同源序列的糊粉层特异启动子LTP2-DsRed基因-Pin2终止子产物60ng，5×CE buffer4μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O补至20μL，于PCR仪中37℃反应30min。将产物转化Top10感受态细胞，经菌液PCR鉴定并测序后得到阳性克隆。提取阳性克隆的质粒即为构建好的转基因骨架载体pCAMBIA1300-Ubi1-LTP2-DsRed。
2、OsBi1 ORF序列扩增：用KOD Plus Neo(Toyobo)高保真聚合酶，引物CE OsBi1-F和CE OsBi1-R(CE OsBi1-F：5’-TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGGCCTGCATCAACACATTC-3；’CEOsBi1-R：5’-ACGATCTGCAGGTCGACGGATCCCTAAACCTCCAGCAGGGCTTC-3’；下划线标注的区域为上下游载体末端同源序列)，含有OsBi1基因全长cDNA的质粒模板，扩增OsBi1基因的ORF序列。将条带单一的PCR产物直接纯化回收。
3、将转基因骨架载体pCAMBIA1300-Ubi1-LTP2-DsRed用BamHI酶切后回收，与带有pCAMBIA1300-Ubi1-LTP2-DsRed载体末端同源序列的OsBi1基因ORF产物，应用Vazyme公司的II体系，在20μL体系中加入BamHI酶切后的pCAMBIA1300-Ubi1-LTP2-DsRed 200ng，带载体末端同源序列的OsBi1基因ORF产物60ng，5×CE buffer 4μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O补至20μL，于PCR仪中37℃反应30min。将产物转化Top10感受态细胞，经菌液PCR鉴定并测序后得到阳性克隆。提取阳性克隆的质粒即为构建好的OsBi1基因过表达遗传转化载体(OsBi1基因在玉米Ubi1强启动子控制下表达)。
实施例3OsBi1 CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建
利用华南农业大学刘耀光院士课题组构建的pYLCRISPR/Cas9多靶点载体(Maetal.,2015)，构建OsBi1基因的CRISPR/Cas9敲除载体。根据OsBi1基因的CDS序列，使用在线软件CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/home/)进行敲除位点的分析。为了确保打靶效率，对OsBi1设计两个靶点sgRNA1(5'-CCAAGATCGGAGGAGGGAGGGGA-3')和sgRNA2(5'-CCATCATCTCCGGTGAGTGGCCG-3')。设计合成下列引物：OsBi1-OsU6aT1：5’-AGATCGGAGGAGGGAGGGGACGGCAGCCAAGCCAGCA-3’；OsBi1-gRT2：5’-CGGCCACTCACCGGAGATGAGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’；OsBi1-OsU6bT2：5’-TCATCTCCGGTGAGTGGCCGCAACACAAGCGGCAGC-3’。
以OsU6a和OsU6b启动子(GenBank编号分别为KR029105和KR029107)为模板用KODPlus Neo(Toyobo)高保真酶进行第一轮扩增，U-F(引物序列为5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’)/OsBi1-OsU6aT1引物对扩增U6a启动子，gRT1/GR-R引物对扩增sgRNA1；U-F/OsBi1-OsU6bT2引物对扩增U6b启动子，OsBi1-gRT2/GR-R引物对扩增sgRNA2；然后以第一轮扩增产物10倍稀释后作为模板进行第二轮扩增，分别用引物Pps-GGL/Pgs-GG2，Pps-GG2/Pgs-GGR产生2个片段合并的sgRNA表达盒片段。将上述片段经琼脂糖凝胶电泳检测并用试剂盒纯化回收。按下列连接体系将sgRNA表达盒连入pYLCRISPR/Cas9质粒。10×CutSmart Buffer1.5μL，10mM ATP 1.5μL，pYLCRISPR/Cas9质粒60-80ng，sgRNA表达盒混合物20-30ng，Bsa I-HF 10U，T4 DNA连接酶35U，ddH2O补至15μL。
用变温循环进行酶切连接约10-15循环(37℃5min；10℃5min，20℃5min)，将产物直接转化Top10感受态细胞。将测序正确的阳性克隆提取质粒，即为OsBi1CRISPR/Cas9基因敲除载体，用于后续的遗传转化实验。
实施例4OsBi1转基因功能验证
1、OsBi1过表达转基因植株抗褐飞虱表型鉴定
将OsBi1基因过表达遗传转化载体，送至武汉伯远生物科技有限公司，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei et al.,1994)，将上述载体转入日本晴水稻中。OsBi1基因过表达遗传转化载体中糊粉层特异启动子LTP2可以驱动DsRed红色荧光蛋白在种皮表达，红色种皮肉眼可见。通过观察种皮颜色判定是否为转基因植株，最终通过获得OsBi1基因过表达转基因植株28颗。
T0代转基因植株通常为杂合态的单拷贝或多拷贝转基因植株，其T1代会出现转基因分离。对独立来源的OsBi1基因过表达转基因植株T1代植株种子成熟期观察红色种皮，种皮为红色的T1代单株占该株系所有T1代单株3/4比例的，即为单拷贝转基因插入株系。进而对单拷贝株系中种皮为红色的T1代单株，观察统计其种子，所有种子均为红色种皮的即为单拷贝纯合植株，也即获得的纯合稳定的转基因材料。获得了4份OsBi1过表达单拷贝纯合转基因植株，分别命名为NipOsBi1-9、NipOsBi1-11、NipOsBi1-16和NipOsBi1-22。
提取单拷贝纯合OsBi1过表达转基因植株NipOsBi1-9、NipOsBi1-11、NipOsBi1-16和NipOsBi1-22三叶期叶片RNA，按照Takara的PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser(货号RR047A)说明书反转成cDNA。对这些植株中OsBi1基因的表达进行定量PCR检测，引物为OsBi1-qF和OsBi1-qR，内参为OsActin，引物为OsActin-F和OsActin-R。结果如图1A所示，OsBi1基因在转基因植株中得到高表达。
OsBi1-qF：5’-CTGCTCAAGCCGACAACC-3’
OsBi1-qR：5’-GCTGCCGCATCCATTAC-3’
OsActin-F：5’-GATCACTGCCTTGGCTCCTA-3’
OsActin-R：5’-GTACTCAGCCTTGGCAATCC-3’
选择OsBi1单拷贝纯合过表达转基因植株NipOsBi1-9、NipOsBi1-11和NipOsBi1-16，采用苗期集团法对它们进行了抗褐飞虱鉴定。接入褐飞虱5天后，转基因受体材料日本晴死亡时，OsBi1过表达载体转基因植株生长健康，无叶片受害(图1B)。根据苗期集团法评价标准，对OsBi1转基因株系的抗性水平进行评价，抗性级别越高表示抗性越低。实验结果表明，与感性材料日本晴的抗性级别(5.63)相比，NipOsBi1-9、NipOsBi1-11和NipOsBi1-16的抗性级别分别为3.85、3.07、2.88，表明OsBi1基因具有增强水稻抗褐飞虱的功能。因此，褐飞虱基因OsBi1可以在水稻中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。
2、OsBi1 CRISPR/Cas9基因敲除转基因植株抗褐飞虱鉴定
将OsBi1 CRISPR/Cas9基因敲除载体，送至武汉伯远生物科技有限公司，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei et al.,1994)，获得OsBi1 CRISPR/Cas9基因敲除载体转基因植株22颗。根据OsBi1基因敲除位点两端的序列分别设计引物对这些转基因植株进行PCR扩增及测序鉴定，明确OsBi1基因的敲除突变类型以及是否纯合敲除。通过扩增测序，在T0代发现三个独立的纯合敲除突变株系。与转基因受体材料日本晴中OsBi1基因序列相比，bi1-3株系在sgRNA1位置有5个碱基的缺失，sgRNA2位置有一个碱基T的缺失；bi1-5株系在sgRNA2位置缺失8个碱基；bi1-18株系在sgRNA1位置存在一个碱基T的插入，sgRNA2位置有一个碱基A的缺失；这些插入和缺失都造成了OsBi1基因序列的移码(图2A)。
将OsBi1 T1代纯合敲除材料bi1进行苗期抗虫，当对照材料日本晴未出现死亡时，bi1材料出现死亡(图2B)，表明敲除OsBi1基因使得日本晴对褐飞虱表现更加敏感，即表现出增强的感虫性(日本晴本身为感虫材料)。同时根据苗期集团法评价标准，对bi1纯合敲除转基因株系的抗性水平进行评价，越低的数值代表越高的褐飞虱抗性。实验结果表明，与感性材料日本晴(抗性级别为5.03)相比，bi1-3、bi1-5和bi1-18的抗性级别分别为6.77、7.67和7.37。该结果进一步证实OsBi1基因正向调控水稻对褐飞虱的抗虫性。
3、OsBi1基因过表达及CRISPR/Cas9基因敲除植株抗旱表型鉴定
为了探究OsBi1基因在水稻抗旱方面的作用，对OsBi1过表达载体转基因植株进行苗期抗旱表型鉴定。正常生长条件下，OsBi1过表达载体转基因植株与对照日本晴植株生长状态一致。待这些植株材料生长至四叶期后，开始进行干旱胁迫，断水处理14d。干旱胁迫14d之后，对照日本晴叶片卷曲萎蔫，而OsBi1过表达载体转基因植株叶片卷曲不明显，绿叶面积相对较多(图3A)。复水6d后，统计这些植株的存活率，发现OsBi1过表达载体转基因植株存活率显著高于日本晴对照(图3B)。这些结果表明OsBi1过表达载体转基因植株比对照日本晴抗旱性增强，即OsBi1基因还具有增强水稻抗旱性的功能。
对OsBi1基因敲除材料bi1的苗期抗旱表型进行鉴定。干旱处理前bi1材料和对照Nip生长状态一致。干旱胁迫10d之后，当bi1材料叶片出现严重卷曲时，对照Nip绿叶面积相对较多(图4A)。复水6d后，bi1材料存活率显著低于Nip(图4B)，表明OsBi1敲除后使得水稻抗旱性减弱。进一步说明OsBi1基因正向调控水稻抗旱性。
上述实验结果表明，OsBi1基因既具有抗褐飞虱功能也具抗旱功能，可以用于培育具有既抗褐飞虱又抗旱的水稻品种。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (10)
1.水稻OsBi1基因，其特征在于，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，其为：
i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
3.含有权利要求1或2所述基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
4.权利要求1或2所述基因在提高植物对褐飞虱抗性及抗旱性中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：在植物中过表达所述基因，获得抗褐飞虱及抗旱的转基因植株。
6.一种提高水稻对褐飞虱抗性及抗旱性的方法，其特征在于，所述方法包括：在水稻中过表达权利要求1或2所述基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒；
2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
5)通过导入增强子。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将含有所述基因的表达载体转化入农杆菌中，通过农杆菌介导的转化方法将所述基因转入水稻，使所述基因在水稻植株中过表达。
9.根据权利要求6-8任一项所述方法获得的转基因水稻在植物育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
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