CN110317250B - Myb6基因及其编码蛋白在调控植物对黄萎病抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MYB6蛋白及其编码基因在调控植物对黄萎病抗性中的应用。本发明通过免疫共沉淀和萤火虫荧光素酶互补实验证明MYB6与全长的PUB25和PUB26在体内互作，且通过表型实验证明MYB6突变后的myb6突变体对黄萎菌更敏感，过表达MYB6的转基因植物对黄萎病抗性提高。说明MYB6参与调控植物对黄萎菌的免疫反应，在改良植物抗病性尤其是黄萎病抗性，及植物育种中具有重要价值。

Description

MYB6基因及其编码蛋白在调控植物对黄萎病抗性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及MYB6基因及其编码蛋白在调控植物对黄萎病抗性中的应用。

背景技术

黄萎病是一种对植物危害极其严重的病害，黄萎菌侵染植物后引起叶片萎蔫、变黄等症状，甚至导致植物死亡。黄萎病属于土传系统性侵染病害，目前统计有400多种双子叶植物会受其侵染，其中包括一些常见农作物，如棉花、茄子和番茄，黄萎病发生后引起农作物减产甚至绝产，造成重大经济损失。黄萎病的危害在棉花上显得更为突出，在我国每年因为黄萎病造成的经济损失达数十亿元，并且发病趋势逐年加重，因此攻克黄萎病具有重大现实意义。

虽然众多科学家致力于该病害的研究，但至今还没能从根本上研究清楚其发病机制，且目前也没有高效、经济的防治方法，近年来，分子生物学的飞速发展，为解析植物的抗病机制、培育抗病品种带来了希望，从分子生物学的角度了解黄萎菌的发病机制，进而通过基因工程技术增强植物对黄萎病的抗性成了解决这一难题的希望。

发明内容

本发明的目的是提高植物对黄萎病的抗性。

本发明首先提供了MYB6蛋白质的新用途。

本发明提供了MYB6蛋白质在调控植物对黄萎病抗性中的应用。

上述应用中，所述MYB6蛋白质来源于拟南芥Arabidopsis thaliana，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

上述c)中，所述一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中，所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中，所述蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

本发明又提供了与MYB6蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与MYB6蛋白质相关的生物材料在调控植物黄萎病抗性中的应用；

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码MYB6蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码MYB6蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码MYB6蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码MYB6蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码MYB6蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码MYB6蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。

上述应用中，所述调控为提高或降低。所述调控具体体现在：当植物中的MYB6蛋白质的表达量和/或活性降低时，所述植物对黄萎病的抗性降低；当植物中的MYB6蛋白质的表达量和/或活性提高时，所述植物对黄萎病的抗性提高。

上述应用中，所述MYB6蛋白质可与PUB25蛋白质全长和PUB26蛋白质全长互作。在正常情况下，植物通过PUB25和PUB26泛素化降解免疫正调控因子MYB6，抑制免疫正调控因子MYB6，使植物不会出现过度免疫反应而正常生长；在应对病原菌(如黄萎病病原菌)侵染时，部分PUB25和PUB26泛素化病原菌蛋白VDAL，释放免疫正调控因子MYB6，使其参与调控植物对病原菌的免疫反应。

本发明还提供了上述MYB6蛋白质或上述生物材料在培育黄萎病抗性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述MYB6蛋白质或上述生物材料在培育黄萎病抗性降低的转基因植物中的应用。

上述MYB6蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种培育黄萎病抗性降低的转基因植物的方法。

本发明提供的培育黄萎病抗性降低的转基因植物的方法包括降低受体植物中MYB6蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对黄萎病的抗性低于所述受体植物。

进一步的，所述降低受体植物中MYB6蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过沉默或抑制受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除MYB6蛋白质的编码基因来实现；

所述MYB6蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

更进一步的，所述沉默或抑制受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除MYB6蛋白质的编码基因为突变受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因使受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因表达量降低或使受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换；

所述使受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方法可为CRISPR/Cas9或TELLEN或T-DNA插入或EMS诱变。

在本发明的一个具体实施例中，所述使受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因发生插入突变的方法为T-DNA插入。

上述培育黄萎病抗性降低的转基因植物方法中，所述转基因植物对黄萎病的抗性低于所述受体植物具体体现在所述转基因植物在接种黄萎菌后的病情指数高于所述受体植物。

上述培育黄萎病抗性降低的转基因植物方法中，所述黄萎病抗性降低的转基因植物为myb6突变体。所述myb6突变体具体为myb6-1突变体和myb6-2突变体，均是ABRC种子中心的产品，产品编号分别为SALK_074789C和CS403018。

本发明最后提供了一种培育黄萎病抗性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育黄萎病抗性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中MYB6蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物。

上述培育黄萎病抗性提高的转基因植物方法中，所述提高受体植物中MYB6蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达MYB6蛋白质。

进一步的，所述过表达的方法为将MYB6蛋白质的编码基因导入受体植物。

所述MYB6蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

更进一步的，所述MYB6蛋白质的编码基因通过载体Super1300-MYB6-MYC导入受体植物。所述载体Super1300-MYB6-MYC为将序列1所示的MYB6蛋白编码序列(CDS)构建到Super1300载体中得到的。载体Super1300-MYB6-MYC表达C端带有MYC标签的MYB6蛋白。

上述培育黄萎病抗性提高的转基因植物方法中，所述转基因植物对黄萎病的抗性高于所述受体植物具体体现在所述转基因植物在接种黄萎菌后的病情指数低于所述受体植物。

上述应用或方法中，所述黄萎病的病原菌可为大丽轮枝菌；所述大丽轮枝菌具体为大丽轮枝菌菌株Vd991。

所述对黄萎病的抗性为对黄萎病病原菌(如大丽轮枝菌，具体如大丽轮枝菌菌株Vd991)的抗性。

上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体可为拟南芥或棉花或茄子或番茄；所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)或myb6突变体。所述myb6突变体具体为myb6-1突变体和myb6-2突变体，均是ABRC种子中心的产品，产品编号分别为SALK_074789C和CS403018。

本发明通过免疫共沉淀和萤火虫荧光素酶互补实验证明MYB6与全长的PUB25和PUB26在体内互作，且通过表型实验证明MYB6突变后的myb6突变体对黄萎菌更敏感。说明MYB6参与调控植物对黄萎菌的免疫反应，在改良植物抗病性尤其是黄萎病抗性，及植物育种中具有重要价值。

附图说明

图1为酵母筛库鉴定到与PUB26-ARM互作的蛋白。

图2为PUB25和PUB26与MYB6互作。A为PUB25-ARM和PUB26-ARM与MYB6在酵母双杂交实验中存在相互作用。B为PUB25-ARM和PUB26-ARM与MYB6在萤火虫荧光素酶互补实验中存在相互作用。C为PUB25-ARM和PUB26-ARM与MYB6在原生质体免疫共沉淀实验中存在相互作用。D为PUB25和PUB26与MYB6在萤火虫荧光素酶互补实验中存在相互作用。E为PUB25和PUB26与MYB6在原生质体免疫共沉淀实验中存在相互作用。

图3为myb6突变体的MYB6基因表达量检测。

图4为转MYB6拟南芥株系和转MYB6回补株系的鉴定结果。A为转MYB6拟南芥株系的鉴定结果，泳道1为转MYB6拟南芥株系MYB6-OE3^#提取的蛋白样品、泳道2和3分别为转MYB6拟南芥株系MYB6-OE3^#的两个不同植株提取的蛋白样品(蛋白样品中添加蛋白酶体抑制剂MG132)；B为转MYB6回补株系的鉴定结果，HB-l21(下文中MYB6/myb6-1^#2)、HB-l8(下文中MYB6/myb6-1^#8)、HB-l2(下文中MYB6/myb6-1^#2)均为转MYB6回补株系。

图5为myb6突变体和野生型拟南芥(Col-0)在接菌两周后的病级和病指统计结果。**表示差异极显著(P<0.01)。

图6为野生型拟南芥(Col-0)、myb6突变体、转MYB6拟南芥株系和转MYB6回补株系对黄萎菌处理的表型。A为野生型拟南芥和转MYB6拟南芥株系在接菌两周时的表型；B为野生型拟南芥和转MYB6拟南芥株系在接菌两周时的病级统计结果；C为野生型拟南芥和转MYB6拟南芥株系在接菌两周时病指统计图；D为野生型拟南芥、myb6突变体和转MYB6回补株系在接菌两周时的表型；E为野生型拟南芥、myb6突变体和转MYB6回补株系在接菌两周时的病级统计结果；F为野生型拟南芥、myb6突变体和转MYB6回补株系在接菌两周时的病指统计图。其中，myb6-1和myb6-2均为myb6突变体；MYB6-OE3^#和MYB6-OE6^#均为T₃代阳性转MYB6拟南芥株系；MYB6/myb6-1^#8、MYB6/myb6-1^#21和MYB6/myb6-1^#2均为T₃代阳性转MYB6回补株系。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的主要试剂如下：MS培养基、琼脂粉、氨苄青霉素(Amp)、卡那青霉素(Kan)、蛋白胨、酵母提取物、牛肉粉、IPTG、还原型谷胱甘肽等均是Sigma-Aldrich公司的产品。常用抗体如MYC、GFP等均是Sigma-Aldrich公司的产品，二抗是康为世纪公司的产品。NiSepharose 6Fast Flow、Glutathione Sepharose 4B、PVDF膜均是GE公司的产品。

下述实施例中的主要菌生长培养基配方如下：

LB培养基：称取酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，pH调至7.0，定容至1L。若配制固体培养基则加入15g琼脂。高温高压灭菌15min。

SOC液体培养基：称取酵母提取物1g，蛋白胨20g，NaCl 0.5g，MgCl₂ 0.95g，KCl0.186g，高温高压灭菌后冷至大约50℃时，加入20mL 1M葡萄糖母液。

YEB培养基：称取酵母粉1g，蛋白胨5g，牛肉粉5g，蔗糖5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，调pH至7.0，若配制固体培养基则加入15g琼脂。高温高压灭菌15min。

察氏培养基：称取NaNO₃ 3g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄0.01g，蔗糖30g，溶于ddH₂O，定容至1L。其中FeSO₄需单独配成溶液过滤除菌后加入。若配固体培养基加入琼脂20g，高温高压灭菌15min。

下述实施例中的主要溶液配方如下：

溶液I：1L中加入9g葡萄糖，25mL 1M Tris-HCl(pH 8.0)，20mL 0.5M EDTA(pH8.0)，ddH₂O定容。

溶液II：1L中加入8.2g NaOH，10g SDS，ddH₂O定容。

溶液III：1L中加入294.2g乙酸钾，115mL冰醋酸，ddH₂O定容。

蛋白提取缓冲液配方：500mL中加入10mM HEPES(KOH调pH至7.5)，1mM EDTA，100mMNaCl，10％甘油，0.5％Triton X-100，使用时加入蛋白酶抑制剂。

酶解液配方(每30mL用量)：cellulase R10(Yakult Honsha，Tokyo，Japan)0.5g、macerozyme R10(Yakult Honsha，Tokyo，Japan)0.1g、Mannitol 2.43g、2M KCl 0.3mL、0.5M MES(pH 5.7)1mL，55℃水浴10min，冷却到室温再加入以下试剂：1M CaCl₂0.3mL、BSA0.03g。

W5溶液配方(每500mL需要量)：NaCl 4.5g、CaCl₂6.94g、2M KCl 1.25mL、0.5M MES(pH 5.7)2mL、ddH₂O补齐至500mL。

MMg溶液(每50mL需要量)：1M MgCl₂0.75mL、0.5M MES(pH 5.7)0.4mL、Mannitol3.65g、ddH₂O补齐至50mL。

40％PEG溶液(每50mL需要量)：PEG4000(Fluka)20g、Mannitol 1.82g、1MCaCl₂5mL、ddH₂O补齐至50mL。

下述实施例中的myb6T-DNA插入突变体购自ABRC种子中心，编号为SALK_074789C和CS403018。

下述实施例中的Super1300载体记载于文献“Wang et al.,2018.EAR1NegativelyRegulates ABA Signaling by Enhancing 2C Protein Phosphatase Activity”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的菌株Vd991记载于文献“一种检测棉花黄萎茵毒素致萎性的新方法一叶片针刺涂抹法”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。菌株Vd991的培养方法具体如下：将大丽花轮枝孢Verticillium dahliae在察氏固体培养基上划线，28℃倒置培养。液体培养时，在超净台中挑一块大丽花轮枝孢菌块放入液体察氏培养基，28℃摇床中培养。

下述实施例中的MYB6蛋白编码序列(CDS)如序列表中的序列1所示；MYB6蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

下述实施例中的PUB25蛋白编码序列(CDS)如序列表中的序列3所示；MYB6蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。

下述实施例中的PUB26蛋白编码序列(CDS)如序列表中的序列5所示；MYB6蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列6所示。

实施例1、转录因子MYB6与PUB25和PUB26在体内互作

一、酵母双杂交文库筛选PUB25和PUB26的互作蛋白

为了寻找PUB25和PUB26在拟南芥体内的作用底物进行了酵母文库筛选。具体步骤如下：首先U-box型E3中的U-box结构域一般在泛素化过程中起介导作用，ARM结构域在介导蛋白之间互作时起作用，为了防止全长的PUB蛋白在与底物互作过程中导致底物被降解而影响筛选，将PUB26截段，只保留ARM结构域，构建诱饵载体BD-PUB26-ARM并转化gold酵母菌株，筛选酵母cDNA文库。转化产物全部涂在4D培养基上，菌落PCR之后将200个产物直接测序，根据有效读码框进行序列比对，得到可能与PUB26-ARM互作的基因，挑选可能与植物免疫反应有关和出现频率较高的基因，将其CDS构建到pGADT7载体中，再通过酵母双杂交实验进一步验证，发现了4个候选互作蛋白。验证结果如图1所示。MYB转录因子为4个候选互作蛋白之一，下面通过其他实验进一步验证MYB转录因子与PUB25和PUB26互作。

二、MYB6与PUB25-ARM和PUB26-ARM互作

1、酵母双杂交实验验证MYB6与PUB25-ARM和PUB26-ARM互作

步骤一中已经证实MYB6与PUB26-ARM互作，通过酵母双杂交实验验证MYB6与PUB25-ARM和PUB26-ARM的关系。

酵母双杂交实验的具体步骤如下：(1)构建所需载体：将MYB6的编码基因构建到AD(pGADT7)载体上，得到AD-MYB6；将PUB25蛋白的ARM结构域的编码基因和PUB26蛋白的ARM结构域的编码基因分别构建到BD(pGBKT7)载体上，分别得到BD-PUB25-ARM和BD-PUB26-ARM。(2)活化菌株：采用AH109或gold菌株在YPDA固体培养基上划线，28℃培养3天，如采用gold菌株，培养时间更长。(3)挑2-3个新鲜单克隆菌落接于2-3mL YPDA液体培养基中，28℃摇床200rpm过夜培养。(4)摇好的菌再接于200mL YPDA液体培养基中，28℃摇床200rpm培养至OD₆₀₀＝0.6。(5)室温1000g离心5min集菌，去掉上清。(6)用50mL ddH₂O重悬菌体，室温1000g离心集菌，去掉上清。(7)计算所需要的1×TE/LiAc体积，用其重悬菌体，此时制成酵母感受态细胞。(8)预先在1.5mL离心管中加入载体质粒(AD+BD，图1)各600ng，再加入10μL ssDNA，混匀后加入步骤(7)中的酵母感受态细胞100μL，混匀。(9)按照50％PEG:10×TE:10×LiAc＝8:1:1混好后加入600μL至步骤(8)中的混合物中，涡旋振荡混匀，30℃、200rpm振荡培养30min。(10)加入70μL DMSO，混匀，42℃水浴锅中热击15min，马上冰上静置5min，室温12000g离心集菌。(11)去掉上清，加入100μL1×TE重悬菌体，直接涂布于2D培养基上，28℃倒置培养3天。(12)挑取2D培养基上的单克隆，用100μL ddH₂O悬菌，混匀后再用ddH₂O稀释10倍和100倍，分别滴6μL在2D、3D和4D上，28℃倒置培养3天。观察酵母生长情况，若在4D上仍能正常生长而负对照不生长，则说明两个蛋白存在互作关系。

结果表明：BD-PUB25-ARM与AD-MYB6共同转化酵母后也可以在四缺培养基上生长，说明MYB6与PUB25-ARM和PUB26-ARM均存在互作关系(图2A)。

2、萤火虫荧光素酶互补实验验证MYB6与PUB25-ARM和PUB26-ARM互作

通过萤火虫荧光素酶互补实验验证MYB6与PUB25-ARM和PUB26-ARM互作。首先将萤火虫荧光素酶基因作为报告基因截成两部分，分别连入pCAMBIA载体，即N-LUC和C-LUC，然后将目的基因的cDNA分别连入这两个载体，转化农杆菌后在烟草中瞬时表达两个蛋白，如果这两个蛋白有相互作用而靠近时即形成有功能的萤火虫荧光素酶蛋白，萤火虫荧光素酶遇见底物时可发生化学反应，用CCD可检测到光强度，若通过CCD收集到荧光信号，且对应的负对照没有发光，说明两个蛋白之间存在相互作用。

具体步骤如下：(1)将萤火虫荧光素酶基因作为报告基因截成两部分，分别连入pCAMBIA载体，即N-LUC和C-LUC；然后将MYB6的编码基因构建到N-LUC中，得到MYB6-NLUC；将PUB25蛋白的ARM结构域的编码基因和PUB26蛋白的ARM结构域的编码基因分别构建到C-LUC载体中，分别得到CLUC-PUB25-ARM、CLUC-PUB26-ARM，并转化农杆菌。(2)挑单克隆农杆菌，接于3-5mL液体YEB培养基中，28℃摇床中过夜培养。其他需要培养的农杆菌还有N-LUC、C-LUC和P19。P19的作用是抑制基因沉默。(3)用分光光度计测OD₆₀₀，一般OD₆₀₀＝4左右最适宜。计算配制转化液所需要的菌液体积，公式为：Vconstruct＝V_final×0.5/OD₆₀₀；Vp19＝V_final×0.3/OD₆₀₀；常用V_final＝2mL，若需要注射较多烟草叶片，则根据需要扩大体积。(4)将计算的所需要的农杆菌根据实验需求混于同一2mL离心管中，室温，12000g离心1min。(5)弃去上清保留菌体，用2mL转化液重悬菌体，转化液配方为10mM MES-KOH(pH 5.7)，10mM MgCl₂，150μM Acetosyringone(乙酰丁香酮)。(6)转化液置于28℃烘箱恢复培养2h即可用于注射烟草。(7)选取生长良好的烟草叶片，背面注射农杆菌，正常条件生长2-3天，剪取叶片，喷洒LUC底物，用CCD观察发光情况。

结果表明：MYB6与PUB25-ARM和PUB26-ARM均存在互作关系(图2B)。

3、原生质体免疫共沉淀实验验证MYB6与PUB25-ARM和PUB26-ARM互作

通过原生质体免疫共沉淀实验验证MYB6与PUB25-ARM和PUB26-ARM互作。首先将MYB6的编码基因构入末端含有MYC标签的Super1300载体，得到Super1300-MYB6-MYC；将PUB25-ARM的编码基因或PUB26-ARM的编码基因构入末端含GFP标签的Super1300载体，得到Super1300-PUB25-ARM-GFP和Super1300-PUB26-ARM-GFP载体；然后经过质粒提取和原生质体制备和转化步骤共同转化原生质体后进行免疫共沉淀实验。

质粒提取的具体步骤如下：(1)将含有上述构建载体的菌株活化后，挑单克隆接小量LB培养基37℃摇床中过夜培养。(2)按1:1000的比例将培养的菌液接于1L液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养16-20h。(3)室温下高速离心机6000g收集菌体，用碱裂解法粗提质粒：加入40mL缓冲液I，充分振荡重悬菌体，加入40mL缓冲液II，上下颠倒混匀，室温放置5min。最后加入50mL缓冲液III，颠倒混匀后此时出现白色絮状沉淀。室温下高速离心机6000g离心15min，将上清移至新的瓶中。(4)加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀。(5)4℃，6000g离心15min，弃上清。此时沉淀即为质粒粗提物。(6)室温晾干残留的异丙醇，加入8mLddH₂O充分溶解质粒。转移至新的15mL离心管中，加入11g CsCl和200μL溴化乙锭(EB)，充分混匀溶解。(7)将离心管中的液体全部转移至超速离心管中，配平后，25℃，55000rpm离心16h，此时看到离心管中部有红色环状聚集物，即为质粒DNA。(8)将红色圆环吸至新的15mL离心管中，加入适量异戊醇，剧烈晃动，以萃取其中的EB，重复3-4次直到下层液体中无红色EB。(9)将上层液体去除干净后加入约4倍体积75％乙醇，颠倒混匀出现白色沉淀，此为纯净的质粒DNA。(10)4℃，6000g离心15min，弃上清，用75％乙醇洗一次沉淀，倒掉乙醇，彻底晾干沉淀，加入适量ddH₂O溶解，测定浓度待用。

原生质体制备和转化的具体步骤如下：(1)选取光照培养箱中生长约20天长势较好的拟南芥幼苗，用锋利刀片切碎幼苗，加入适量酶解液，室温黑暗中，40rpm酶解4h。(2)将酶解之后的产物用100目筛子过滤至新的50mL离心管中，加入适量W5溶液，轻轻颠倒混匀。(3)室温，100g水平离心3min，离心机升降速全部调为0。(4)弃上清，加入适量W5溶液，重悬原生质体，轻轻颠倒混匀，再次离心。(5)弃上清，再加入适量W5溶液，颠倒混匀后冰浴30min。室温100g离心后，保留底端原生质体沉淀。(6)计算所需原生质体体积，加入MMg溶液重悬原生质体，此时可以转化原生质体。(7)5mL离心管中事先加入所要转化的质粒约20μg，取400μL原生质体，缓慢吹打混匀，加入等体积40％PEG溶液，马上颠倒混匀，静置10-15min。(8)加入4mL W5溶液轻轻颠倒混匀以终止转化反应，室温，100g离心3min。(9)弃上清，加入4mL W5重悬原生质体，再次离心。(10)弃上清，加入1mL W5溶液重悬原生质体，放入光照培养箱弱光培养16h。

免疫共沉淀的具体步骤如下：(1)尽量吸去原生质体沉淀上的W5溶液，加入1mL蛋白提取缓冲液，涡旋振荡1min，置于冰上15min。(2)4℃，12000g离心15min，将上清转移至新的1.5mL离心管中。(3)重复一次。(4)取100μL上清液作为Input，加入25μL 5×SDS LoadingBuffer，煮沸3-5min。(5)将GFP beads用PBS缓冲液平衡3次，加入20μL至步骤(4)中剩余上清液，4℃混合孵育2-3h。(6)℃，1000g离心2min，弃去上清液，beads用PBS缓冲液洗4-5次。最后尽量除去PBS缓冲液。(7)加入100μL PBS缓冲液，再加入25μL 5×SDS Loading Buffer煮沸3-5min。(8)用10％SDS-PAGE胶进行蛋白电泳，分别用anti-MYC和anti-GFP的抗体检测两个蛋白之间是否能免疫共沉淀。

将Super1300-MYB6-MYC载体分别和Super1300-PUB25-ARM-GFP载体、Super1300-PUB26-ARM-GFP载体共转入原生质体表达，再用GFP beads孵育后可以分别将PUB25-ARM和PUB26-ARM共沉淀(图2C)。说明MYB6的确与PUB25-ARM和PUB26-ARM互作。

三、MYB6与PUB25和PUB26-ARM全长互作

1、萤火虫荧光素酶互补实验验证MYB6与PUB25和PUB26全长互作

通过萤火虫荧光素酶互补实验验证进一步验证MYB6与PUB25和PUB26全长的互作关系。将PUB25-ARM和PUB26-ARM分别替换为PUB25全长和PUB26全长，其他步骤同步骤二中的2。

结果表明：MYB6与PUB25全长和PUB26-ARM全长均存在互作关系(图2D)。

2、原生质体免疫共沉淀实验验证MYB6与PUB25和PUB26全长互作

通过原生质体免疫共沉淀实验验证MYB6与PUB25和PUB26-ARM全长的互作关系。将PUB25-ARM和PUB26-ARM分别替换为PUB25全长和PUB26全长，其他步骤同步骤二中的3。

结果表明：MYB6与PUB25全长和PUB26-ARM全长均存在互作关系(图2E)。

实施例2、MYB6在调控植物对黄萎菌抗性中的应用

一、myb6突变体的获得及RT-PCR鉴定

1、myb6突变体的获得

从ABRC种子中心获得myb6 T-DNA插入突变体，分别将其记做myb6-1突变体和myb6-2突变体，产品编号分别为SALK_074789C和CS403018。

2、突变体的RT-PCR鉴定

对野生型拟南芥(Col-0)和myb6突变体中的MYB6基因的表达量进行RT-PCR检测。以ACTIN2基因作为内参基因。引物序列如下：

MYB6-RT-F：TGGTCATTGATAGCTGGAAGATTACC；

MYB6-RT-R：AGAATACTCAACGGCATCGTTTTGAATA。

结果表明：myb6-1突变体和myb6-2突变体中MYB6基因的相对表达量均低于野生型拟南芥(图3)。

二、转MYB6拟南芥株系和转MYB6回补株系的获得

分别在野生型拟南芥和myb6-1突变体中超量表达MYB6，分别获得MYB6超量表达的转MYB6拟南芥株系和转MYB6回补株系。具体方法如下：

1、重组载体的构建

将序列1所示的MYB6蛋白编码序列(CDS)构建到Super1300载体上，得到重组载体Super1300-MYB6-MYC。重组载体Super1300-MYB6-MYC表达C端带有MYC标签的MYB6蛋白。

2、重组菌的构建

将重组载体Super1300-MYB6-MYC导入农杆菌GV3101的感受态细胞中，得到重组菌。

3、农杆菌介导的转化

将步骤2构建的重组菌分别转化野生型拟南芥(Col-0生态型)花序和myb6突变体(myb6-1突变体)花序，分别得到转MYB6拟南芥株系和转MYB6回补株系。具体步骤如下：(1)挑取鉴定正确的农杆菌单克隆加入到2-3mL的YEB液体培养基中，置于28℃摇床，200rpm过夜培养。(2)按照1:1000的比例将农杆菌接于300mL的YEB液体培养基中，28℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝1.0。(3)室温下5500rpm收集菌体，用100mL的1/2MS溶液(1/2MS粉，5％蔗糖，40μLSilwet-77)重悬菌体。(4)刚开花的拟南芥花序浸泡在农杆菌中30sec，套上保鲜袋，黑暗中生长24h。然后置于正常条件下生长，直至收获T₀代转基因拟南芥种子。(5)将T₀代转基因拟南芥种子均匀铺在含有相应抗生素(本发明中的抗生素是潮霉素和氨苄霉素培养基，浓度分别是潮霉素40μg/mL和氨苄霉素50μg/mL)的MS培养基上，在光照培养箱中生长约2周后，选取能正常生长的幼苗，移至土中生长，直至收获T₁代转基因拟南芥种子。依此类推获得T₃代转MYB6拟南芥株系和T₃代转MYB6回补株系。

4、T₃代转基因拟南芥的鉴定

提取野生型拟南芥和T₃代转MYB6拟南芥株系幼苗的蛋白，定量相同后用MYC抗体进行Western blot检测。提取野生型拟南芥和T₃代转MYB6回补株系幼苗的总RNA，通过RT-PCR方法(MYB6-RT-F和MYB6-RT-R)检测MYB6基因的相对表达量。

部分检测结果如图4所示。结果表明：MYB6基因在T₃代转MYB6拟南芥株系和T₃代转MYB6回补株系中均正常表达。选取T₃代阳性转MYB6拟南芥株系MYB6-OE3^#和MYB6-OE6^#、T₃代阳性转MYB6回补株系MYB6/myb6-1^#8、MYB6/myb6-1^#21和MYB6/myb6-1^#2进行下述黄萎菌接菌实验。

三、黄萎菌接菌实验

将短日照温室中生长三周的野生型拟南芥Col-0、myb6突变体(myb6-1和myb6-2)、T₃代阳性转MYB6拟南芥株系MYB6-OE3^#和MYB6-OE6^#、T₃代阳性转MYB6回补株系MYB6/myb6-1^#8、MYB6/myb6-1^#21和MYB6/myb6-1^#2从土中取出，用黄萎菌Vd991孢子液浸泡处理十分钟后移回新的培养土中在同样的生长条件下培养。浸泡处理两周时观察发病情况，接菌后的拟南芥生长大约20天时统计发病情况，以病情指数表示。

黄萎菌接菌实验的具体步骤如下：(1)短日照温室中生长的拟南芥大约3周时进行黄萎菌接菌实验。(2)准备黄萎菌孢子液：培养黄萎菌的培养基上加入ddH₂O，毛笔轻轻刷洗黄萎菌，用擦镜纸过滤一遍，得到黄萎菌孢子液。计数板计数，调整ddH₂O的体积，使孢子液中孢子的密度为1×10⁶个孢子/mL，加入0.1％体积的吐温20。(3)将土中的拟南芥轻轻移出小盆，用水缓缓冲洗根部，去除残留的培养土。(4)将拟南芥浸泡于黄萎菌孢子液中10min，之后移栽至新的土中。

病情指数计算方法如下：根据发病叶片占总叶片的百分比，将拟南芥发病情况分为五级，没有发病的标为0，1％-25％标为1，26％-50％标为2，51％-75％标为3，76％-100％标为4。按以下公式计算病情指数：病情指数＝100×∑(各级病株数×病级)/(总株数×4)。

结果表明：与野生型拟南芥相比，在接菌处理一周时myb6突变体已经开始发病，在接菌两周时，myb6突变体的病情指数显著高于野生型拟南芥(Col-0)(图5)，统计结果达到了极显著差异水平(P<0.01)。与野生型拟南芥相比，myb6突变体的黄萎病抗性明显下降。

与野生型拟南芥相比，在接菌处理两周时转MYB6拟南芥株系(MYB6-OE3^#和MYB6-OE6^#)的病情指数低于野生型拟南芥(Col-0)，病级也低于野生型拟南芥(图6A、图6B和6C)。与野生型拟南芥相比，转MYB6拟南芥株系的黄萎病抗性明显提高。

与myb6突变体相比，在接菌处理两周时转MYB6回补株系MYB6/myb6-1^#8和MYB6/myb6-1^#21的病情指数低于myb6突变体，病级也低于myb6突变体(图6D、图6E和图6F)。与myb6突变体相比，转MYB6回补株系的黄萎病抗性明显提高。

上述实验结果表明MYB6突变后拟南芥对黄萎菌更敏感，过表达MYB6的转基因植物对黄萎病抗性提高。说明MYB6参与调控植物对黄萎菌的免疫反应。

序列表

<110>中国农业大学

<120>MYB6基因及其编码蛋白在调控植物对黄萎病抗性中的应用

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>711

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgggaagat ctccttgttg tgaaaaagct cacacaaaca aaggagcttg gactaaagaa 60

gaagatcaac gtctcgtaga ttatatccgt aatcacggtg aaggttgttg gcgttctctt 120

cctaaatccg ctggattgtt gcgttgtggt aaaagttgta gattgagatg gattaattac 180

cttcgtcctg atcttaaacg tggtaatttt actgatgatg aagatcaaat catcatcaaa 240

ctccatagct tactcggtaa caaatggtca ttgatagctg gaagattacc aggaagaaca 300

gataacgaaa taaagaatta ttggaacact catattaaga ggaagcttct tagtcacggt 360

attgatccac aaactcatcg tcagattaac gaatccaaaa cggtgtcgtc tcaagttgtt 420

gttcctattc aaaacgatgc cgttgagtat tctttttcca atttagccgt taaaccgaag 480

acggaaaatt cctccgataa cggagcttcg actagcggca cgacgacgga cgaggatctc 540

cggcagaatg gggagtgtta ttatagtgat aattcaggac atataaagct gaatttggat 600

ttaactcttg ggtttggatc ctggtcgggt cggatagtcg gagtcgggtc atcggctgat 660

tctaaaccgt ggtgcgaccc ggtgatggag gcgcgtttgt cactgttgta a 711

<210>2

<211>236

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Ala His Thr Asn Lys Gly Ala

1 5 10 15

Trp Thr Lys Glu Glu Asp Gln Arg Leu Val Asp Tyr Ile Arg Asn His

20 25 30

Gly Glu Gly Cys Trp Arg Ser Leu Pro Lys Ser Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Phe Thr Asp Asp Glu Asp Gln Ile Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Ile

100 105 110

Lys Arg Lys Leu Leu Ser His Gly Ile Asp Pro Gln Thr His Arg Gln

115 120 125

Ile Asn Glu Ser Lys Thr Val Ser Ser Gln Val Val Val Pro Ile Gln

130 135 140

Asn Asp Ala Val Glu Tyr Ser Phe Ser Asn Leu Ala Val Lys Pro Lys

145 150 155 160

Thr Glu Asn Ser Ser Asp Asn Gly Ala Ser Thr Ser Gly Thr Thr Thr

165 170 175

Asp Glu Asp Leu Arg Gln Asn Gly Glu Cys Tyr Tyr Ser Asp Asn Ser

180 185 190

Gly His Ile Lys Leu Asn Leu Asp Leu Thr Leu Gly Phe Gly Ser Trp

195 200 205

Ser Gly Arg Ile Val Gly Val Gly Ser Ser Ala Asp Ser Lys Pro Trp

210 215 220

Cys Asp Pro Val Met Glu Ala Arg Leu Ser Leu Leu

225 230 235

<210>3

<211>1266

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

atgcctagga atatagaacc attggatctt ggaatccaaa taccatatca tttcagatgt 60

ccaatatcac tcgaacttat gcaagaccca gtcaccgtct gcaccggcca aacctacgac 120

cgagccagca tcgagtcatg ggtctccatc ggtaacaaca cgacatgtcc agtcacacga 180

gctcctctct ccgacttcac actcatccct aaccacactc tccgtcgtct catccaagaa 240

tggtgcgtcg ctaaccgctc caatggagtc gaacgtatcc ctactcctaa acaaccagct 300

gatccaacct ctgttcgtgc tcttctcagt caagcctctg ctataacagg aacccacgtc 360

tctgttcgtt cacgcgccgc cgctctccgc cgtttacgtg gtttcgctcg tgattctgat 420

aaaaatcgcg ttttgatcgc agctcataac gctacagaga ttttgattaa gattctgttc 480

tctgaaacga cgtcgtcgga gttagtctct gagtctttag ctctacttgt tatgttaccg 540

ataacggagc cgaaccagtt tgtttcgata tcgtcggatc cgggtcgggt cgagtttttg 600

acccggttgt tattcgattc gtcgattgaa acacgcgtta acgccgccgc gttgatcgag 660

attgtttcga cgggaaccaa atcggcggac ctgaaaggtt cgatttcgaa ttcagaatct 720

gtattcgaag gagttctcga tcttctgaga aatccgattt cgtcacgacg agctctcaaa 780

atcggaatca aaactctgtt cgcgctctgt tcagtgaaat cgacgcgaca catcgcgatc 840

acagccggtg cgccggagat tctaatagac agactcgcgg cggatttcga tagatgcgat 900

acggagcgag ccttagcgac ggtggagcta ctctgccgaa cgccggaagg atgcgcggcg 960

ttcggtgagc acgctttaac ggtgccgttg ttagttaaaa cgatattgag agtttcggat 1020

cgcgcgacgg agtatgcggc gggggcgttg ttagcgcttt gtacggcgga ggaaaggtgg 1080

agggaggaag cggcgggggc gggagtggtg gtacagttgt tgttgatggt gcagagtgag 1140

tgtacggaga gagcgaagaa gaaagcacag aagttattga agcttctgag agattcatgg 1200

cctgactaca attccttcgc taactccgat gactttggtt gcagcagcca agtggtccct 1260

ttttga 1266

<210>4

<211>421

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

Met Pro Arg Asn Ile Glu Pro Leu Asp Leu Gly Ile Gln Ile Pro Tyr

1 5 10 15

His Phe Arg Cys Pro Ile Ser Leu Glu Leu Met Gln Asp Pro Val Thr

20 25 30

Val Cys Thr Gly Gln Thr Tyr Asp Arg Ala Ser Ile Glu Ser Trp Val

35 40 45

Ser Ile Gly Asn Asn Thr Thr Cys Pro Val Thr Arg Ala Pro Leu Ser

50 55 60

Asp Phe Thr Leu Ile Pro Asn His Thr Leu Arg Arg Leu Ile Gln Glu

65 70 75 80

Trp Cys Val Ala Asn Arg Ser Asn Gly Val Glu Arg Ile Pro Thr Pro

85 90 95

Lys Gln Pro Ala Asp Pro Thr Ser Val Arg Ala Leu Leu Ser Gln Ala

100 105 110

Ser Ala Ile Thr Gly Thr His Val Ser Val Arg Ser Arg Ala Ala Ala

115 120 125

Leu Arg Arg Leu Arg Gly Phe Ala Arg Asp Ser Asp Lys Asn Arg Val

130 135 140

Leu Ile Ala Ala His Asn Ala Thr Glu Ile Leu Ile Lys Ile Leu Phe

145 150 155 160

Ser Glu Thr Thr Ser Ser Glu Leu Val Ser Glu Ser Leu Ala Leu Leu

165 170 175

Val Met Leu Pro Ile Thr Glu Pro Asn Gln Phe Val Ser Ile Ser Ser

180 185 190

Asp Pro Gly Arg Val Glu Phe Leu Thr Arg Leu Leu Phe Asp Ser Ser

195 200 205

Ile Glu Thr Arg Val Asn Ala Ala Ala Leu Ile Glu Ile Val Ser Thr

210 215 220

Gly Thr Lys Ser Ala Asp Leu Lys Gly Ser Ile Ser Asn Ser Glu Ser

225 230 235 240

Val Phe Glu Gly Val Leu Asp Leu Leu Arg Asn Pro Ile Ser Ser Arg

245 250 255

Arg Ala Leu Lys Ile Gly Ile Lys Thr Leu Phe Ala Leu Cys Ser Val

260 265 270

Lys Ser Thr Arg His Ile Ala Ile Thr Ala Gly Ala Pro Glu Ile Leu

275 280 285

Ile Asp Arg Leu Ala Ala Asp Phe Asp Arg Cys Asp Thr Glu Arg Ala

290 295 300

Leu Ala Thr Val Glu Leu Leu Cys Arg Thr Pro Glu Gly Cys Ala Ala

305 310 315 320

Phe Gly Glu His Ala Leu Thr Val Pro Leu Leu Val Lys Thr Ile Leu

325 330 335

Arg Val Ser Asp Arg Ala Thr Glu Tyr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Ala

340 345 350

Leu Cys Thr Ala Glu Glu Arg Trp Arg Glu Glu Ala Ala Gly Ala Gly

355 360 365

Val Val Val Gln Leu Leu Leu Met Val Gln Ser Glu Cys Thr Glu Arg

370 375 380

Ala Lys Lys Lys Ala Gln Lys Leu Leu Lys Leu Leu Arg Asp Ser Trp

385 390 395 400

Pro Asp Tyr Asn Ser Phe Ala Asn Ser Asp Asp Phe Gly Cys Ser Ser

405 410 415

Gln Val Val Pro Phe

420

<210>5

<211>1266

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

atgccgggga atttagagcc gttggatctc ggaatccaaa taccatacca tttcagatgc 60

ccaatctcac ttgacctaat gtctgatccc gtaaccatct ccaccggcca aacttacgac 120

cgaaccagca tcgactcatg gatcgctatg ggcaacacca cttgtccagt cacacgtgtc 180

gctctctccg acttcactct catccctaac cacactctcc gccgtcttat ccaagaatgg 240

tgcgtcgcta accgctctaa cggcgtcgaa cggattccta cacctaaaca accggcggat 300

ccaatctccg ttaggtcact tctcagtcaa gcatccgcaa ttaccggaac tcacgtctct 360

gttcgttcac gcgccgccgc tattcgtcgt ttgagaggat tagctagaga tagtgagaag 420

aatcgcgttt tgatcgctgg tcataacgcg agggagattt tggtgaggat tttgttcgcc 480

gatattgaaa cgacgtcgtt gtcttcggag cttgtttctg agtcgcttgc tcttttggtt 540

ttattgcata tgacggagac ggagtgtgaa gctgttgcgt cggatcctag tcgggtcggg 600

tttatgaccc gattgttgtt tgattcttcg attgaaatta gggttaacgc cgccgcgttg 660

attgagatgg tgttgaccgg agcgaaatcc atggatctga aattgatcat ttccggatct 720

gattcgatat tcgaaggcgt tctcgatctt ctcaagaatc cgatttcatc gcggcgagct 780

ttgaagatcg gaatcaaagc gattttcgct ctctgtctcg tgaaacaaac gagacatcta 840

gcgatctccg ccggagctcc ggggatttta atcgaccgtc tcgcggcgga tttcgatagg 900

tgtgatacgg agcgaggttt agcgacagtg gagcttcttt gccgattacc agaaggatgt 960

gctgcgtttg gtgagcatgc tttgacggtg ccgctaatgg tgaagacgat attaagagtt 1020

tcagatagag cgacggagta cgcggcggga gcgttgttgg ctttatgtac ggcggaggaa 1080

cggtgtagag atgaagctgc ggcggcggga ttggtgacgc agttgttgct tctggtgcag 1140

agtgattgta cggagagagc gaagagaaaa gctcagatgc ttttgaagct tctcagagac 1200

tcttggcctg acgattctac cgttcattcc gacgatttca atcgtagcga agtggcgccg 1260

ttttga 1266

<210>6

<211>421

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

Met Pro Gly Asn Leu Glu Pro Leu Asp Leu Gly Ile Gln Ile Pro Tyr

1 5 10 15

His Phe Arg Cys Pro Ile Ser Leu Asp Leu Met Ser Asp Pro Val Thr

20 25 30

Ile Ser Thr Gly Gln Thr Tyr Asp Arg Thr Ser Ile Asp Ser Trp Ile

35 40 45

Ala Met Gly Asn Thr Thr Cys Pro Val Thr Arg Val Ala Leu Ser Asp

50 55 60

Phe Thr Leu Ile Pro Asn His Thr Leu Arg Arg Leu Ile Gln Glu Trp

65 70 75 80

Cys Val Ala Asn Arg Ser Asn Gly Val Glu Arg Ile Pro Thr Pro Lys

85 90 95

Gln Pro Ala Asp Pro Ile Ser Val Arg Ser Leu Leu Ser Gln Ala Ser

100 105 110

Ala Ile Thr Gly Thr His Val Ser Val Arg Ser Arg Ala Ala Ala Ile

115 120 125

Arg Arg Leu Arg Gly Leu Ala Arg Asp Ser Glu Lys Asn Arg Val Leu

130 135 140

Ile Ala Gly His Asn Ala Arg Glu Ile Leu Val Arg Ile Leu Phe Ala

145 150 155 160

Asp Ile Glu Thr Thr Ser Leu Ser Ser Glu Leu Val Ser Glu Ser Leu

165 170 175

Ala Leu Leu Val Leu Leu His Met Thr Glu Thr Glu Cys Glu Ala Val

180 185 190

Ala Ser Asp Pro Ser Arg Val Gly Phe Met Thr Arg Leu Leu Phe Asp

195 200 205

Ser Ser Ile Glu Ile Arg Val Asn Ala Ala Ala Leu Ile Glu Met Val

210 215 220

Leu Thr Gly Ala Lys Ser Met Asp Leu Lys Leu Ile Ile Ser Gly Ser

225 230 235 240

Asp Ser Ile Phe Glu Gly Val Leu Asp Leu Leu Lys Asn Pro Ile Ser

245 250 255

Ser Arg Arg Ala Leu Lys Ile Gly Ile Lys Ala Ile Phe Ala Leu Cys

260 265 270

Leu Val Lys Gln Thr Arg His Leu Ala Ile Ser Ala Gly Ala Pro Gly

275 280 285

Ile Leu Ile Asp Arg Leu Ala Ala Asp Phe Asp Arg Cys Asp Thr Glu

290 295 300

Arg Gly Leu Ala Thr Val Glu Leu Leu Cys Arg Leu Pro Glu Gly Cys

305 310 315 320

Ala Ala Phe Gly Glu His Ala Leu Thr Val Pro Leu Met Val Lys Thr

325 330 335

Ile Leu Arg Val Ser Asp Arg Ala Thr Glu Tyr Ala Ala Gly Ala Leu

340 345 350

Leu Ala Leu Cys Thr Ala Glu Glu Arg Cys Arg Asp Glu Ala Ala Ala

355 360 365

Ala Gly Leu Val Thr Gln Leu Leu Leu Leu Val Gln Ser Asp Cys Thr

370 375 380

Glu Arg Ala Lys Arg Lys Ala Gln Met Leu Leu Lys Leu Leu Arg Asp

385 390 395 400

Ser Trp Pro Asp Asp Ser Thr Val His Ser Asp Asp Phe Asn Arg Ser

405 410 415

Glu Val Ala Pro Phe

420

Claims (11)

1.MYB6蛋白质在调控植物对黄萎病抗性中的应用；

所述MYB6蛋白质是如下a）或b）所示的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b）在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述植物为拟南芥。

2.与MYB6蛋白质相关的生物材料在调控植物对黄萎病抗性中的应用；

所述生物材料为下述A1）至A8）中的任一种：

A1）编码MYB6蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；

所述植物为拟南芥。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1中所述的MYB6蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在培育黄萎病抗性提高的转基因植物中的应用；所述植物为拟南芥。

5.一种培育黄萎病抗性降低的转基因植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述的MYB6蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对黄萎病的抗性低于所述受体植物；所述植物为拟南芥。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中权利要求1中所述的MYB6蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过沉默或抑制受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除MYB6蛋白质的编码基因来实现；

所述MYB6蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述沉默或抑制受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除MYB6蛋白质的编码基因为突变受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因使受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因表达量降低或使受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述使受体植物基因组中MYB6蛋白质的编码基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方法为T-DNA插入。

9.一种培育黄萎病抗性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的MYB6蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对黄萎病的抗性高于所述受体植物；所述植物为拟南芥。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1所述的MYB6蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1所述的MYB6蛋白质。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将权利要求1所述的MYB6蛋白质的编码基因导入受体植物；

所述MYB6蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

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