CN111454970B - 拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的应用，通过所述的拟南芥莲座叶的相关基因PUB25，对拟南芥莲座叶器官的相关基因进行表达，进而快速、准确、高效地对拟南芥莲座叶器官的大小进行调节，为构建调控植物器官大小的基因网络提供依据，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也通过该基因的研究为植物的形态学后续的研究奠定了基础。

Description

拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的 应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的应用。

背景技术

植物生长发育的生长周期中，植物从种子逐渐发育成具有不同形态特征和功能的器官和组织。其中，植物器官大小的发育受到内外多种因素的严格调控。以拟南芥为例，生长发育前期，植物细胞进行旺盛的细胞分裂使得细胞数目逐渐增多，随着生命周期的推进，分裂减少并伴随着细胞增大和分化发育成不同组织细胞，这些是最终导致植物器官呈现不同大小和形态的直接原因。尽管近年来对植物器官大小调控研究颇多，发现了许多会影响植物器官大小的基因，如SMALL ORGAN4(SMO4)，但是目前为止人们对植物器官大小的分子调控机理的认识还相当有限。

PUB25基因是拟南芥U-box家族的一类泛素连接酶E3,前人研究已经发现PUB25基因和其功能冗余的PUB26基因在拟南芥中能够共同促进受体类细胞质激酶BIK1的降解作用，从而调控机体的免疫反应；另外，PUB25基因表达的蛋白还能泛素化MYB15，MYB15是依赖CBF起作用的耐冷信号途径的转录抑制因子，PUB25基因通过抑制MYB15的作用来增强植物的耐冷性。植物在受到生物胁迫产生免疫反应或者是受到非生物胁迫，抵御寒冷的过程中，会伴随有植物器官大小的变化，如受虫害侵染时植物生长矮小等，这都属于植物的形态学生成过程。

因此对该基因进行研究有利于进一步对拟南芥器官大小的调节机制进行分析，进而为人们更深入了解植物器官大小的分子调控机理提供多一种可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的应用，旨在解决现有技术中无法准确对拟南芥莲座叶器官大小进行准确定位和控制的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的应用，其中，所述拟南芥莲座叶的相关基因为PUB25，所述PUB25的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

以及，一种引物对，所述引物对用于扩增表达拟南芥莲座叶的相关基因，所述拟南芥莲座叶的相关基因为PUB25，且所述引物对包括与所述PUB25编码序列结合的上游引物和与所述PUB25编码序列结合的下游引物；其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

以及，一种用于表达拟南芥莲座叶的相关基因的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。

本发明通过所述的拟南芥莲座叶的相关基因PUB25，对拟南芥莲座叶器官的相关基因进行表达，进而快速、准确、高效地对拟南芥莲座叶器官的大小进行调节，为构建调控植物器官大小的基因网络提供依据，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也通过该基因的研究为植物的形态学后续的研究奠定了基础。

本发明所述拟南芥莲座叶的相关基因PUB25，通过研究PUB25基因对拟南芥莲座叶大小的调控作用，为进一步探究植物器官大小变化与植物细胞的分裂、体积扩增和分化之间的关系提供多一种分析路径，为构建植物器官大小的复杂调控网络奠定基础。

本发明所述的用于扩增表达拟南芥莲座叶的相关基因的引物对，通过应用所述引物对，对拟南芥莲座叶的相关基因PUB25进行克隆，进而实现对拟南芥莲座叶的相关基因进行表达及性状分析，快速、准确实现对拟南芥莲座叶器官的大小进行调节，为构建调控植物器官大小的基因网络提供依据，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也通过该基因的研究为植物的形态学后续的研究奠定了基础。

本发明所述的用于表达拟南芥莲座叶的相关基因的试剂盒，所述试剂盒包括引物对，利用所述引物对，进而对所述拟南芥莲座叶的相关基因进行克隆，实现采用所述试剂盒对拟南芥莲座叶的相关基因进行表达及性状分析，快速、准确实现对拟南芥莲座叶器官的大小进行调节，为构建调控植物器官大小的基因网络提供依据，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也通过该基因的研究为植物的形态学后续的研究奠定了基础。

附图说明

图1是本发明实施例提供的野生型和35S:PEG100-PUB25阳性苗(1#，2#，3#，4#，5#)莲座叶大小的对照图。

图2是本发明实施例提供的野生型和35S:PEG100-PUB25阳性苗(1#，2#，3#，4#，5#)PUB25基因的相对表达量的图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明实例提供一种拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的应用，其中，所述拟南芥莲座叶的相关基因为PUB25，所述PUB25的编码序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1如下：

本发明通过所述的拟南芥莲座叶的相关基因PUB25，对拟南芥莲座叶器官的相关基因进行表达，进而快速、准确、高效地对拟南芥莲座叶器官的大小进行调节，为构建调控植物器官大小的基因网络提供依据，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也通过该基因的研究为植物的形态学后续的研究奠定了基础。

相应的，本发明提供了一种引物对，所述引物对用于扩增表达拟南芥莲座叶的相关基因，所述拟南芥莲座叶的相关基因为PUB25，且所述引物对包括与所述PUB25编码序列结合的上游引物和与所述PUB25编码序列结合的下游引物；其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2如下：

ggggtaccat gcctaggaat atagaaccat；

所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ ID NO.3如下：

gctctagaaa aagggaccac ttggctgc。

本发明所述的用于扩增表达拟南芥莲座叶的相关基因的引物对，通过应用所述引物对，对拟南芥莲座叶的相关基因PUB25进行克隆，进而实现对拟南芥莲座叶的相关基因进行表达及性状分析，快速、准确实现对拟南芥莲座叶器官的大小进行调节，为构建调控植物器官大小的基因网络提供依据，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也通过该基因的研究为植物的形态学后续的研究奠定了基础。

相应的，本发明还提供一种用于表达拟南芥莲座叶的相关基因的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。

优选的，所述引物对包括与所述PUB25编码序列结合的上游引物和与所述PUB25编码序列结合的下游引物；其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2如下：

ggggtaccat gcctaggaat atagaaccat；

所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ ID NO.3如下：

gctctagaaa aagggaccac ttggctgc。

本发明所述的用于表达拟南芥莲座叶的相关基因的试剂盒，所述试剂盒包括引物对，利用所述引物对，进而对所述拟南芥莲座叶的相关基因进行克隆，实现采用所述试剂盒对拟南芥莲座叶的相关基因进行表达及性状分析，快速、准确实现对拟南芥莲座叶器官的大小进行调节，为构建调控植物器官大小的基因网络提供依据，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也通过该基因的研究为植物的形态学后续的研究奠定了基础。

相应的，本发明实施例还提供了一种拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的鉴定方法，该方法包括如下步骤：

S01.培养拟南芥，提取所述拟南芥的基因组DNA；

S02.利用与所述PUB25编码序列结合的上游引物和与所述PUB25编码序列结合的下游引物对所述基因组DNA进行扩增，构建拟南芥35S:PEG100-PUB25重组质粒，将所述重组质粒通过农杆菌(GV3101株系)转化法侵染植物拟南芥Col-0并进行培养及筛选得到阳性转基因植物；

S03.分析所述阳性转基因植物莲座叶的大小，并对所述阳性转基因植物株PUB25的基因表达量进行测定，鉴定拟南芥莲座叶的相关基因具有调节拟南芥莲座叶器官大小的作用。

在上述步骤S01中，对拟南芥进行培养，所述培养方法包括如下步骤：

S011.将春化2天的拟南芥种子播种于1/2MS培养基中，在21～25℃、光照强度为4000 Ix的条件下培养7天得到拟南芥幼苗；

S012.将所述拟南芥幼苗移栽至人工土中，于人工培养室进行光照培养；优选的，所述人工土为体积比1:1:1的腐殖土、蛭石、珍珠岩的混合物；优选的，所述进行光照培养的条件如下：保持室内相对湿度为70％，温度为21～25℃，光照强度为4 000Ix；光照培养的照射周期为为黑暗条件下培养8h、光照条件下培养16h；

S013.上述做农杆菌转化实验的拟南芥培育过程中需要特殊处理：培养得到的植物初生花序为5cm～15cm、次生花序刚刚形成花芽状时，去除初生花序，培养得到拟南芥植物。

进一步的，提取所述拟南芥的基因组DNA；优选的，采用CTAB法提取所述拟南芥植物的基因组DNA。

在本发明优选实施例中，采用CTAB法提取拟南芥的DNA的方法包括如下步骤：

S11.在液氮中研磨拟南芥的幼嫩叶至粉末，收集800uL所述粉末于离心管中，加入800uL采用65℃预热处理得到的CTAB提取液，混合得到第一混合液，将所述第一混合液在65℃的条件下保温处理30分钟；

S12.将保温处理得到的第一混合液加入比例为400：384：16的酚：氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第一混合上清液；

S13.在第一混合上清液中加入比例为768：32的氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第二混合上清液；

S14.在所述第二混合上清液中加入800uL异丙醇，混匀，室温静置10分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心15分钟，收集第三混合上清液；

S15.在所述第三混合上清液中加入800uL的70％乙醇溶液，混匀，再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集沉淀，加入30uL蒸馏水，混匀得到所述拟南芥DNA。

在上述步骤S02中，利用与所述PUB25编码序列结合的上游引物和与所述PUB25编码序列结合的下游引物对所述基因组DNA进行扩增，构建拟南芥35S:PEG100-PUB25重组质粒，将所述重组质粒通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥GV3101并进行培养及筛选得到阳性转基因植物；

具体的，利用与所述PUB25编码序列结合的上游引物和与所述PUB25编码序列结合的下游引物对所述基因组DNA进行扩增，其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2如下：ggggtaccat gcctaggaat atagaaccat；所述下游引物的序列如SEQ IDNO.3所示，所述SEQ ID NO.3如下：gctctagaaa aagggaccac ttggctgc。

进一步，对所述基因组DNA进行扩增，选用的是TAKARA公司的

MaxDNA Polymerase聚合酶(Code No.R045Q)；优选的，所述PCR反应的体系如下：25μlPrimeSTAR Max Premix(2×)，1μl上游引物(10mM),1μl下游引物(10mM)，1μl模板(拟南芥基因组DNA)，22μl灭菌蒸馏水，总共50μl体系。

所述PCR反应程序如下：98℃2min，98℃10sec，52℃15sec，72℃1min，72℃7min，循环数32。

采用上述PCR反应的体系和反应程序对所述基因组DNA进行扩增，扩增得到所述拟南芥莲座叶的相关基因PUB25PCR产物。

进一步的，将所述拟南芥莲座叶的相关基因PUB25 PCR产物，用Thermo FisherScientific公司的Gateway试剂盒，利用体外同源重组技术获得入门载体，并与目的载体PEG100载体进行体外重组，产生表达克隆载体35S:PEG100-PUB25。

优选的，所述第一载体选自PEG100作为重组质粒的载体，选择该载体进行试验，有利于后续进行试验。所述PEG100载体的序列如SEQ ID NO.4所示，所述SEQ ID NO.4如下：

优选的，将构建得到重组质粒35S:PEG100-PUB25进行转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。优选的，所述转化方法包括如下步骤：

S021.将5uL重组质粒35S:PEG100-PUB25加入解冻的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴20～30分钟得到感受态混合物；

S022.将所述感受态混合物放置于42℃条件下热激处理90秒，再进行冰浴2～3分钟；加入600uL LB液体培养基混匀，放置于37℃摇床上于转速220rpm的条件下进行活化50min-60min；

优选的，将活化好的感受态细胞去除，倒于LB(卡那霉素抗性)的固体平板，干燥彻底后倒置过来于37℃恒温培养箱中培养12-16h。观察37℃烘箱里面的平板上长出的菌落克隆，选择特征为圆形边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起和菌落间互相分开的大肠杆菌单克隆进行菌落PCR，选用的是全式金

PCR SuperMix(+dye)(Code No.AS111-11)。优选的，所述菌落PCR的反应体系如下：1μl模板(挑菌落溶于10ul无菌水中作为模板)，1μl上游引物(10mM),1μl下游引物(10mM)，

PCR SuperMix，4.5μl灭菌蒸馏水，总共15μl体系。所述PCR反应程序如下：反应条件如下，94℃10min，94℃30sec，52℃30sec，72℃1min20sec，72℃7min，循环数32。

将鉴定出来的阳性菌落送至艾基生物技术有限公司测序。从TAIR数据库下载目的基因的核酸序列，并在muscle alignment网站上将测序结果对照TAIR网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基和TAIR的基因序列完全匹配则说明所述重组质粒构建成功。

进一步，将所述重组质粒通过农杆菌(GV3101株系)转化法进行侵染植物拟南芥Col-0并进行培养及筛选得到阳性转基因植物。

将所述重组质粒通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥Col-0的方法包括如下步骤：

通过测序结果得到含有成功重组质粒的阳性菌，培养所述含有成功重组质粒35S:PEG100-PUB25的阳性菌并提取其质粒；将所述35S:PEG100-PUB25重组质粒转化入农杆菌(GV3101株系)，得到已转化表达载体的农杆菌菌液；在28℃、220rpm的条件下培养18～24小时得到扩大培养好的已转化的重组质粒的农杆菌菌液，将所述菌液在4℃、转速为6000g的条件下离心处理10min，除去上清液得到农杆菌沉淀，将所述沉淀悬浮于5％蔗糖渗透培养液中，再加入0.010％-0.015％Silwet L-77，摇匀，制备得到农杆菌悬浮液；利用沾花法，使拟南芥Col-0的花浸润在侵染液中40s，侵染后，将侵染好的植株放置于人工培养室中光照培养得到转基因植物，所述培养条件为：保持室内相对湿度为70％，温度为21～25℃，光照强度为4 000Ix；光照培养的照射周期为为黑暗条件下培养8h、光照条件下培养16h。

进一步，将所述转基因植物进行筛选得到阳性转基因植物；优选的，采用含除草剂Basta的培养基筛选对除草剂有抗性的转化植株，并利用初步筛选到的阳性苗的基因组DNA做模板进行PCR进一步筛选成功转化植株。在本发明优选实施例中，所述筛选的步骤如下：将Tl代种子先用70％的酒精浸泡，再用灭菌水洗得到消毒后的种子，将所述消毒后的种子均匀地分散在含潮霉素抗性的筛选培养基表面，于4℃冰箱中放置2-3d后，移至人工培养室光照培养(培养室条件：保持室内相对湿度为70％，温度为21～25℃，光照强度为4 000Ix；光照培养的照射周期为为黑暗条件下培养8h、光照条件下培养16h)。培养7-10天之后，通过萌发的幼苗形态鉴定出转化子。

根据幼苗的形态对阳性苗进行鉴定：深绿色的子叶，根较长的幼苗为阳性苗；子叶发黄，甚至不萌发，根短，不能长期存活的幼苗为非阳性苗。再将确定的阳性苗转入土壤中培养，进行后续试验。

具体的，在上述步骤S03中，分析所述阳性转基因植物莲座叶的大小，将阳性苗转入土壤中进行培养后，对所述阳性苗的莲座叶器官的大小进行分析。

进一步，采用RT-qPCR的方法对所述阳性转基因植物株PUB25的基因表达量进行测定，表达量的测定方法包括如下步骤：

提取所述阳性苗的总RNA序列；再利用)反转录试剂盒进行反转录合成所述阳性秒的cDNA；采用TB Green嵌合荧光法进行Real Time PCR，再进行qPCR反应，对qPCR数据进行处理分析各样品的表达水平。

优选的，所述RT-qPCR引物对包括RT-qPCR上游引物和RT-qPCR下游引物，所述RT-qPCR上游引物如SEQ ID NO.5所示，所述SEQ ID NO.5如下：gggagtggtg gtacagttgttgttga；所述RT-qPCR下游引物如SEQ ID NO.6所示，所述SEQ ID NO.6如下：tcaaaaagggaccacttggc tgc。

进一步，采用TB Green嵌合荧光法进行Real Time PCR的步骤中，所述PCR反应的体系如下：10μL TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X)；1μ10μMLRT-qPCR上游引物(SEQ ID NO.5)；1μ10μMLRT-qPCR下游引物(SEQ ID NO.6)；0.4μROX Reference Dye(50X)；100 ng阳性苗的cDNA模板；总共20uL体系。

再用BIO-RAD CFX96 PCR仪进行qPCR，运用两步法PCR扩增程序，所述PCR扩增程序包括如下：95℃预变性30秒；进行PCR反应，95℃运行5秒；60℃运行30秒；再进行分解反应，95℃运行5秒；60℃运行60秒；95℃运行15秒。通过上述反应程序进行反应，确认Real TimePCR的扩增曲线和融解曲线，比较各样品的表达水平。

分析所述阳性转基因植物莲座叶的大小，并对所述阳性转基因植物株PUB25的基因表达量进行测定，鉴定拟南芥莲座叶的相关基因具有调节拟南芥莲座叶器官大小的作用。

进一步以具体实施例的内容进行说明。

一种拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的鉴定方法

培养拟南芥，提取所述拟南芥的基因组DNA；

利用与所述PUB25编码序列结合的上游引物和与所述PUB25编码序列结合的下游引物对所述基因组DNA进行扩增，构建拟南芥35S:PEG100-PUB25重组质粒，将所述重组质粒通过农杆菌(GV3101株系)转化法进行侵染植物拟南芥Col-0并进行培养及筛选得到阳性转基因植物；

分析所述阳性转基因植物莲座叶的大小，并对所述阳性转基因植物株PUB25的基因表达量进行测定，鉴定拟南芥莲座叶的相关基因具有调节拟南芥莲座叶器官大小的作用。

其中，对拟南芥进行培养，所述培养方法包括如下步骤：

将春化2天的拟南芥种子播种于1/2MS培养基中，在21～25℃、光照强度为4 000Ix的条件下培养7天得到拟南芥幼苗；

将所述拟南芥幼苗移栽至人工土中，于人工培养室进行光照培养；优选的，所述人工土为体积比1:1:1的腐殖土、蛭石、珍珠岩的混合物；优选的，所述进行光照培养的条件如下：保持室内相对湿度为70％，温度为21～25℃，光照强度为4 000Ix；光照培养的照射周期为为黑暗条件下培养8h、光照条件下培养16h；

上述做农杆菌转化实验的拟南芥培育过程中需要特殊处理：培养得到的植物初生花序为5cm～15cm、次生花序刚刚形成花芽状时，去除初生花序，培养得到拟南芥植物。

采用CTAB法提取拟南芥的DNA的方法包括如下步骤：

在液氮中研磨拟南芥的幼嫩叶至粉末，收集800uL所述粉末于离心管中，加入800uL采用65℃预热处理得到的CTAB提取液，混合得到第一混合液，将所述第一混合液在65℃的条件下保温处理30分钟；

将保温处理得到的第一混合液加入比例为400：384：16的酚：氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第一混合上清液；

在第一混合上清液中加入比例为768：32的氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第二混合上清液；

在所述第二混合上清液中加入800uL异丙醇，混匀，室温静置10分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心15分钟，收集第三混合上清液；

在所述第三混合上清液中加入800uL的70％乙醇溶液，混匀，再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集沉淀，加入30uL蒸馏水，混匀得到所述拟南芥DNA。

进一步，构建35S:PEG100-PUB25重组质粒

以拟南芥Col-0的DNA为模板，利用TAKARA公司的

Max DNAPolymerase聚合酶(Code No.R045Q)，上游引物SEQ ID NO.2(ggggtaccat gcctaggaatatagaaccat)和下游引物SEQ ID NO.3(gctctagaaa aagggaccac ttggctgc)，进行PCR扩增PUB25CDS序列。

进一步的，将所述拟南芥莲座叶的相关基因PUB25 PCR产物，用Thermo FisherScientific公司的Gateway试剂盒，利用体外同源重组技术获得入门载体，并与目的载体PEG100载体进行体外重组，产生表达克隆载体35S:PEG100-PUB25。

提供融化的DH5α感受态细胞，加入5μl克隆载体，冰浴20min，于42℃水浴中热激90s，后冰上放置2min，往冰浴好的混合液加入600μl LB液体培养基，于37℃220rpm摇床上1h进行活化。将活化好的感受态细胞，倒于LB(卡那霉素抗性)固体平板，涂布棒涂匀，干燥，37℃恒温培养箱中倒置平板培养12-16h。

选择菌落平板中圆而大的菌落，利用全式金

PCR SuperMix(+dye)(Code No.AS111-11)DNA聚合酶和扩增PUB25目的基因的上下游引物进行阳性菌落鉴定，将鉴定出来的阳性菌落送至艾基生物技术有限公司测序。从TAIR数据库下载目的基因的核酸序列，并利用DNAMAN软件，对测序序列与TAIR网站上的模板序列进行序列比对，选出序列完全匹配的阳性样品即为含有成功重组质粒的阳性菌。

进一步，采用农杆菌侵染法获得转基因植株。

将所述重组质粒通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥GV3101，通过测序结果得到含有成功重组质粒的阳性菌，培养所述含有成功重组质粒35S:PEG100-PUB25的阳性菌并提取其质粒；将所述35S:PEG100-PUB25重组质粒通过农杆菌转化法得到已转化的表达载体的农杆菌菌液；在28℃、220rpm的条件下培养18～24小时得到扩大培养好的已转化的重组质粒的农杆菌菌液，将所述菌液在4℃、转速为6000g的条件下离心处理10min，除去上清液得到农杆菌沉淀，将所述沉淀悬浮于5％蔗糖渗透培养液中，再加入0.010％-0.015％Silwet L-77，摇匀，制备得到农杆菌悬浮液；利用沾花法，使Col-0拟南芥的花浸润在侵染液中40s，侵染后，将侵染好的植株放置于人工培养室中光照培养得到转基因植物，所述培养条件为：保持室内相对湿度为70％，温度为21～25℃，光照强度为4 000Ix；光照培养的照射周期为为黑暗条件下培养8h、光照条件下培养16h。

进一步，筛选拟南芥阳性转基因植物T1代种子。

将Tl代种子先用70％的酒精浸泡，再用灭菌水洗得到消毒后的种子，将所述消毒后的种子均匀地分散在含潮霉素抗性的筛选培养基表面，于4℃冰箱中放置2-3d后，移至人工培养室光照培养(培养室条件：保持室内相对湿度为70％，温度为21～25℃，光照强度为4000Ix；光照培养的照射周期为为黑暗条件下培养8h、光照条件下培养16h)。培养7-10天之后，通过萌发的幼苗形态鉴定出转化子。

根据幼苗的形态对阳性苗进行鉴定：深绿色的子叶，根较长的幼苗为阳性苗；子叶发黄，甚至不萌发，根短，不能长期存活的幼苗为非阳性苗。再将确定的阳性苗转入土壤中培养，进行后续试验。

进一步，对阳性苗进行拍照观察。

分析所述阳性转基因植物莲座叶的大小，将阳性苗转入土壤中进行培养后，对所述阳性苗的莲座叶器官的大小进行分析。

进一步，采用RT-qPCR的方法鉴定阳性植株PUB25基因表达水平。

提取所述阳性苗的总RNA序列；再利用)反转录试剂盒进行反转录合成所述阳性秒的cDNA；采用TB Green嵌合荧光法进行Real Time PCR，再进行qPCR反应，对qPCR数据进行处理分析各样品的表达水平。

优选的，所述RT-qPCR引物对包括RT-qPCR上游引物和RT-qPCR下游引物，所述RT-qPCR上游引物如SEQ ID NO.5所示，所述SEQ ID NO.5如下：gggagtggtg gtacagttgttgttga；所述RT-qPCR下游引物如SEQ ID NO.6所示，所述SEQ ID NO.6如下：tcaaaaagggaccacttggc tgc。

进一步，采用TB Green嵌合荧光法进行Real Time PCR的步骤中，所述PCR反应的体系如下：10μL TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X)；1μ10μMLRT-qPCR上游引物(SEQ ID NO.5)；1μ10μMLRT-qPCR下游引物(SEQ ID NO.6)；0.4μROX Reference Dye(50X)；100ng阳性苗的cDNA模板；总共20uL体系。

再用BIO-RAD CFX96 PCR仪进行qPCR，运用两步法PCR扩增程序，所述PCR扩增程序包括如下：95℃预变性30秒；进行PCR反应，95℃运行5秒；60℃运行30秒；再进行分解反应，95℃运行5秒；60℃运行60秒；95℃运行15秒。通过上述反应程序进行反应，确认Real TimePCR的扩增曲线和融解曲线，比较各样品的表达水平。

结果分析：

分析所述阳性转基因植物莲座叶的大小，将阳性苗转入土壤中进行培养后，对阳性苗进行拍照观察，如图1所示，图1为野生型Col-0和35S:PEG100-PUB25阳性苗(1#，2#，3#，4#，5#)莲座叶大小，由图1可得，野生型Col-0的莲座叶较大，而35S:PEG100-PUB25阳性苗(1#，2#，3#，4#，5#)莲座叶的尺寸依次减小。

采用RT-qPCR的方法鉴定阳性植株PUB25基因表达水平，分别对野生型Col-0和35S:PEG100-PUB25阳性苗(1#，2#，3#，4#，5#)的PUB25基因的表达水平进行分析，如图2所示，将野生型Col-0的表达量设为对照1，可以看出，所述35S:PEG100-PUB25阳性苗(1#，2#，3#，4#，5#)的PUB25基因的相对表达量呈递增趋势，与野生型Col-0的表达量相比，35S:PEG100-PUB25阳性苗1#的相对表达量提高了8倍左右；35S:PEG100-PUB25阳性苗2#的相对表达量提高了12倍左右；35S:PEG100-PUB25阳性苗3#的相对表达量提高了28倍左右；35S:PEG100-PUB25阳性苗4#的相对表达量提高了40倍左右；35S:PEG100-PUB25阳性苗5#的相对表达量提高了85倍左右。

结合图1和图2两两对应的植物表型和PUB25基因表达量可以看出，PUB25基因表达量增高会使拟南芥莲座叶片变小，并且当PUB25基因表达量逐渐升高时，拟南芥莲座叶片越小。

鉴定得到拟南芥莲座叶的相关基因PUB25能够调节拟南芥莲座叶器官大小，且PUB25对莲座叶呈负相关性调控作用。

通过所述的拟南芥莲座叶的相关基因PUB25，对拟南芥莲座叶器官的相关基因进行表达，进而快速、准确、高效地对拟南芥莲座叶器官的大小进行调节，为构建调控植物器官大小的基因网络提供依据，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也通过该基因的研究为植物的形态学后续的研究奠定了基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

<120> 拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的应用

<130> 2019.12.23

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2298

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgtagccga tcaatgattt cttgcaagtt gcaaccattt aaagtacttt tggggtcctt 60

aaaatagaga ctaatcgaaa tgttaacaaa tgctttaaca ccattcaaca agaaaaaact 120

caagttgcac ccaaaaaata gaaaaaggag acacttaaaa gaagataaat taacaagagc 180

tctacaacac aaagtacaaa ctaccataat gacgttcact agaagcttac atgtcgatac 240

caaatttgcc aacatgtcga taccaaaatt taccttaaaa atgcagaaaa aagttgactt 300

acctttagac tttaaacttt aaaaagcctt taagcatatc ttccatttgc ttctttaaca 360

acttttccca actcaaaagg ccaatcaaat aacaaaataa ttactttaca tacatactga 420

aaaaaaaaaa aactaattca tggtcatcaa aaagcttctg tatattatct tttcttcttc 480

acatctttcc atcaaataca cacaaaaaat gaccattatt tttccttcta attaaaaaaa 540

aaacattttt ttaataatta ctgtgaaaaa acaatgtttt gaaaaaaaaa aatcgagaaa 600

tcaaaaaggg accacttggc tgctgcaacc aaagtcatcg gagttagcga aggaattgta 660

gtcaggccat gaatctctca gaagcttcaa taacttctgt gctttcttct tcgctctctc 720

cgtacactca ctctgcacca tcaacaacaa ctgtaccacc actcccgccc ccgccgcttc 780

ctccctccac ctttcctccg ccgtacaaag cgctaacaac gcccccgccg catactccgt 840

cgcgcgatcc gaaactctca atatcgtttt aactaacaac ggcaccgtta aagcgtgctc 900

accgaacgcc gcgcatcctt ccggcgttcg gcagagtagc tccaccgtcg ctaaggctcg 960

ctccgtatcg catctatcga aatccgccgc gagtctgtct attagaatct ccggcgcacc 1020

ggctgtgatc gcgatgtgtc gcgtcgattt cactgaacag agcgcgaaca gagttttgat 1080

tccgattttg agagctcgtc gtgacgaaat cggatttctc agaagatcga gaactccttc 1140

gaatacagat tctgaattcg aaatcgaacc tttcaggtcc gccgatttgg ttcccgtcga 1200

aacaatctcg atcaacgcgg cggcgttaac gcgtgtttca atcgacgaat cgaataacaa 1260

ccgggtcaaa aactcgaccc gacccggatc cgacgatatc gaaacaaact ggttcggctc 1320

cgttatcggt aacataacaa gtagagctaa agactcagag actaactccg acgacgtcgt 1380

ttcagagaac agaatcttaa tcaaaatctc tgtagcgtta tgagctgcga tcaaaacgcg 1440

atttttatca gaatcacgag cgaaaccacg taaacggcgg agagcggcgg cgcgtgaacg 1500

aacagagacg tgggttctgt tatagcagag gcttgactga gaagagcacg aacagaggtt 1560

ggatcagctg gttgtttagg agtagggata cgttcgactc cattggagcg gttagcgacg 1620

caccattctt ggatgagacg acggagagtg tggttaggga tgagtgtgaa gtcggagaga 1680

ggagctcgtg tgactggaca tgtcgtgttg ttaccgatgg agacccatga ctcgatgctg 1740

gctcggtcgt aggtttggcc ggtgcagacg gtgactgggt cttgcataag ttcgagtgat 1800

attggacatc tgaaatgata tggtatttgg attccaagat ccaatggttc tatattccta 1860

ggcattaaga aacttgagaa acagagagaa gaagaagaag aagaaaggtg agattgtttg 1920

ttgtgagcgt taagagtatg aggaacgaga gcttatctgg gtatgagccc acacgtgtgc 1980

catttataac tttgttacct gctggattat ttaataatat attctgttaa attcgtgatg 2040

ttaattttta atcaagtgaa catcatgaga tgatatatac gtaaatatgt tttgtgggag 2100

aaagtcgcat ctttgaagtg aagcttaaga tttatatgaa tgatatacaa ttatacatct 2160

ctttatgata atttttacga ctatgtttat gttctattat aacgttcaaa tggatttgta 2220

aaaactctca ataatgctta atttgaacaa aataaataaa catggttgat ttttgtcaaa 2280

gcatacaaaa tatatatt 2298

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggggtaccat gcctaggaat atagaaccat 30

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gctctagaaa aagggaccac ttggctgc 28

<210> 4

<211> 11649

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcga gctcggatct gataatttat 120

ttgaaaattc ataagaaaag caaacgttac atgaattgat gaaacaatac aaagacagat 180

aaagccacgc acatttagga tattggccga gattactgaa tattgagtaa gatcacggaa 240

tttctgacag gagcatgtct tcaattcagc ccaaatggca gttgaaatac tcaaaccgcc 300

ccatatgcag gagcggatca ttcattgttt gtttggttgc ctttgccaac atgggagtcc 360

aagattctgc agtcaaatct cggtgacggg caggaccgga cggggcggta ccggcaggct 420

gaagtccagc tgccagaaac ccacgtcatg ccagttcccg tgcttgaagc cggccgcccg 480

cagcatgccg cggggggcat atccgagcgc ctcgtgcatg cgcacgctcg ggtcgttggg 540

cagcccgatg acagcgacca cgctcttgaa gccctgtgcc tccagggact tcagcaggtg 600

ggtgtagagc gtggagccca gtcccgtccg ctggtggcgg ggggagacgt acacggtcga 660

ctcggccgtc cagtcgtagg cgttgcgtgc cttccagggg cccgcgtagg cgatgccggc 720

gacctcgccg tccacctcgg cgacgagcca gggatagcgc tcccgcagac ggacgaggtc 780

gtccgtccac tcctgcggtt cctgcggctc ggtacggaag ttgaccgtgc ttgtctcgat 840

gtagtggttg acgatggtgc agaccgccgg catgtccgcc tcggtggcac ggcggatgtc 900

ggccgggcgt cgttctgggc tcatcgattc gatttggtgt atcgagattg gttatgaaat 960

tcagatgcta gtgtaatgta ttggtaattt gggaagatat aataggaagc aaggctattt 1020

atccatttct gaaaaggcga aatggcgtca ccgcgagcgt cacgcgcatt ccgttcttgc 1080

tgtaaagcgt tgtttggtac acttttgact agcgaggctt ggcgtgtcag cgtatctatt 1140

caaaagtcgt taatggctgc ggatcaagaa aaagttggaa tagaaacaga atacccgcga 1200

aattcaggcc cggttgccat gtcctacacg ccgaaataaa cgaccaaatt agtagaaaaa 1260

taaaaactga ctcggatact tacgtcacgt cttgcgcact gatttgaaaa atctcagaat 1320

tccaatccca caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg 1380

tattcaacac cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata 1440

cgatgactgg ggttgtacaa aggcggcaac aaacggcgtt cccggagttg cacacaagaa 1500

atttgccact attacagagg caagagcagc agctgacgcg tacacaacaa gtcagcaaac 1560

agacaggttg aacttcatcc ccaaaggaga agctcaactc aagcccaaga gctttgctaa 1620

ggccctaaca agcccaccaa agcaaaaagc ccactggctc acgctaggaa ccaaaaggcc 1680

cagcagtgat ccagccccaa aagagatctc ctttgccccg gagattacaa tggacgattt 1740

cctctatctt tacgatctag gaaggaagtt cgaaggtgaa ggtgacgaca ctatgttcac 1800

cactgataat gagaaggtta gcctcttcaa tttcagaaag aatgctgacc cacagatggt 1860

tagagaggcc tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac ccgagtaaca atctccagga 1920

gatcaaatac cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa agattcagga ctaattgcat 1980

caagaacaca gagaaagaca tatttctcaa gatcagaagt actattccag tatggacgat 2040

tcaaggcttg cttcataaac caaggcaagt aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt 2100

tcctactgaa tctaaggcca tgcatggagt ctaagattca aatcgaggat ctaacagaac 2160

tcgccgtgaa gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga 2220

aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca ctctggtcta ctccaaaaat gtcaaagata 2280

cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aaggataatt tcgggaaacc 2340

tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag 2400

gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcattcaa gatctctctg 2460

ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 2520

ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgacat ctccactgac gtaagggatg 2580

acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 2640

tggagaggac acgctcgaga tcacaagttt gtacaaaaaa gctgaacgag aaacgtaaaa 2700

tgatataaat atcaatatat taaattagat tttgcataaa aaacagacta cataatactg 2760

taaaacacaa catatccagt catattggcg gccgcattag gcaccccagg ctttacactt 2820

tatgcttccg gctcgtataa tgtgtggatt ttgagttagg atccgtcgag attttcagga 2880

gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga tatatcccaa 2940

tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag 3000

accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt 3060

tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgga attccgtatg 3120

gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta caccgttttc 3180

catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga tttccggcag 3240

tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct 3300

aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt 3360

tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc ccgttttcac catgggcaaa 3420

tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt 3480

tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg 3540

cagggcgggg cgtaaacgcg tggatccggc ttactaaaag ccagataaca gtatgcgtat 3600

ttgcgcgctg atttttgcgg tataagaata tatactgata tgtatacccg aagtatgtca 3660

aaaagaggta tgctatgaag cagcgtatta cagtgacagt tgacagcgac agctatcagt 3720

tgctcaaggc atatatgatg tcaatatctc cggtctggta agcacaacca tgcagaatga 3780

agcccgtcgt ctgcgtgccg aacgctggaa agcggaaaat caggaaggga tggctgaggt 3840

cgcccggttt attgaaatga acggctcttt tgctgacgag aacaggggct ggtgaaatgc 3900

agtttaaggt ttacacctat aaaagagaga gccgttatcg tctgtttgtg gatgtacaga 3960

gtgatattat tgacacgccc gggcgacgga tggtgatccc cctggccagt gcacgtctgc 4020

tgtcagataa agtctcccgt gaactttacc cggtggtgca tatcggggat gaaagctggc 4080

gcatgatgac caccgatatg gccagtgtgc cggtctccgt tatcggggaa gaagtggctg 4140

atctcagcca ccgcgaaaat gacatcaaaa acgccattaa cctgatgttc tggggaatat 4200

aaatgtcagg ctcccttata cacagccagt ctgcaggtcg accatagtga ctggatatgt 4260

tgtgttttac agcattatgt agtctgtttt ttatgcaaaa tctaatttaa tatattgata 4320

tttatatcat tttacgtttc tcacccagct ttcttgtaca aagtggtgcc taggtgagtc 4380

tagagagtta attaagaccc gggactagtc cctagagtcc tgctttaatg agatatgcga 4440

gacgcctatg atcgcatgat atttgctttc aattctgttg tgcacgttgt aaaaaacctg 4500

agcatgtgta gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca ttctaatgaa tatatcaccc 4560

gttactatcg tatttttatg aataatattc tccgttcaat ttactgattg taccctacta 4620

cttatatgta caatattaaa atgaaaacaa tatattgtgc tgaataggtt tatagcgaca 4680

tctatgatag agcgccacaa taacaaacaa ttgcgtttta ttattacaaa tccaatttta 4740

aaaaaagcgg cagaaccggt caaacctaaa agactgatta cataaatctt attcaaattt 4800

caaaagtgcc ccaggggcta gtatctacga cacaccgagc ggcgaactaa taacgctcac 4860

tgaagggaac tccggttccc cgccggcgcg catgggtgag attccttgaa gttgagtatt 4920

ggccgtccgc tctaccgaaa gttacgggca ccattcaacc cggtccagca cggcggccgg 4980

gtaaccgact tgctgccccg agaattatgc agcatttttt tggtgtatgt gggccccaaa 5040

tgaagtgcag gtcaaacctt gacagtgacg acaaatcgtt gggcgggtcc agggcgaatt 5100

ttgcgacaac atgtcgaggc tcagcaggac ctgcaggcat gcaagcttgg cactggccgt 5160

cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc 5220

acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca 5280

acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc agattgtcgt 5340

ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt tgacaggata tattggcggg taaacctaag 5400

agaaaagagc gtttattaga ataacggata tttaaaaggg cgtgaaaagg tttatccgtt 5460

cgtccatttg tatgtgcatg ccaaccacag ggttcccctc gggatcaaag tactttgatc 5520

caacccctcc gctgctatag tgcagtcggc ttctgacgtt cagtgcagcc gtcttctgaa 5580

aacgacatgt cgcacaagtc ctaagttacg cgacaggctg ccgccctgcc cttttcctgg 5640

cgttttcttg tcgcgtgttt tagtcgcata aagtagaata cttgcgacta gaaccggaga 5700

cattacgcca tgaacaagag cgccgccgct ggcctgctgg gctatgcccg cgtcagcacc 5760

gacgaccagg acttgaccaa ccaacgggcc gaactgcacg cggccggctg caccaagctg 5820

ttttccgaga agatcaccgg caccaggcgc gaccgcccgg agctggccag gatgcttgac 5880

cacctacgcc ctggcgacgt tgtgacagtg accaggctag accgcctggc ccgcagcacc 5940

cgcgacctac tggacattgc cgagcgcatc caggaggccg gcgcgggcct gcgtagcctg 6000

gcagagccgt gggccgacac caccacgccg gccggccgca tggtgttgac cgtgttcgcc 6060

ggcattgccg agttcgagcg ttccctaatc atcgaccgca cccggagcgg gcgcgaggcc 6120

gccaaggccc gaggcgtgaa gtttggcccc cgccctaccc tcaccccggc acagatcgcg 6180

cacgcccgcg agctgatcga ccaggaaggc cgcaccgtga aagaggcggc tgcactgctt 6240

ggcgtgcatc gctcgaccct gtaccgcgca cttgagcgca gcgaggaagt gacgcccacc 6300

gaggccaggc ggcgcggtgc cttccgtgag gacgcattga ccgaggccga cgccctggcg 6360

gccgccgaga atgaacgcca agaggaacaa gcatgaaacc gcaccaggac ggccaggacg 6420

aaccgttttt cattaccgaa gagatcgagg cggagatgat cgcggccggg tacgtgttcg 6480

agccgcccgc gcacgtctca accgtgcggc tgcatgaaat cctggccggt ttgtctgatg 6540

ccaagctggc ggcctggccg gccagcttgg ccgctgaaga aaccgagcgc cgccgtctaa 6600

aaaggtgatg tgtatttgag taaaacagct tgcgtcatgc ggtcgctgcg tatatgatgc 6660

gatgagtaaa taaacaaata cgcaagggga acgcatgaag gttatcgctg tacttaacca 6720

gaaaggcggg tcaggcaaga cgaccatcgc aacccatcta gcccgcgccc tgcaactcgc 6780

cggggccgat gttctgttag tcgattccga tccccagggc agtgcccgcg attgggcggc 6840

cgtgcgggaa gatcaaccgc taaccgttgt cggcatcgac cgcccgacga ttgaccgcga 6900

cgtgaaggcc atcggccggc gcgacttcgt agtgatcgac ggagcgcccc aggcggcgga 6960

cttggctgtg tccgcgatca aggcagccga cttcgtgctg attccggtgc agccaagccc 7020

ttacgacata tgggccaccg ccgacctggt ggagctggtt aagcagcgca ttgaggtcac 7080

ggatggaagg ctacaagcgg cctttgtcgt gtcgcgggcg atcaaaggca cgcgcatcgg 7140

cggtgaggtt gccgaggcgc tggccgggta cgagctgccc attcttgagt cccgtatcac 7200

gcagcgcgtg agctacccag gcactgccgc cgccggcaca accgttcttg aatcagaacc 7260

cgagggcgac gctgcccgcg aggtccaggc gctggccgct gaaattaaat caaaactcat 7320

ttgagttaat gaggtaaaga gaaaatgagc aaaagcacaa acacgctaag tgccggccgt 7380

ccgagcgcac gcagcagcaa ggctgcaacg ttggccagcc tggcagacac gccagccatg 7440

aagcgggtca actttcagtt gccggcggag gatcacacca agctgaagat gtacgcggta 7500

cgccaaggca agaccattac cgagctgcta tctgaataca tcgcgcagct accagagtaa 7560

atgagcaaat gaataaatga gtagatgaat tttagcggct aaaggaggcg gcatggaaaa 7620

tcaagaacaa ccaggcaccg acgccgtgga atgccccatg tgtggaggaa cgggcggttg 7680

gccaggcgta agcggctggg ttgtctgccg gccctgcaat ggcactggaa cccccaagcc 7740

cgaggaatcg gcgtgagcgg tcgcaaacca tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg 7800

ggtgatgacc tggtggagaa gttgaaggcc gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag 7860

gcagaagcac gccccggtga atcgtggcaa gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc 7920

cggcaaccgc cggcagccgg tgcgccgtcg attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa 7980

ccagattttt tcgttccgat gctctatgac gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg 8040

gacgtggccg ttttccgtct gtcgaagcgt gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac 8100

gagcttccag acgggcacgt agaggtttcc gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg 8160

gattacgacc tggtactgat ggcggtttcc catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg 8220

gaagggaagg gagacaagcc cggccgcgtg ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag 8280

ttctgccggc gagccgatgg cggaaagcag aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg 8340

ttaaacacca cgcacgttgc catgcagcgt acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg 8400

acggtatccg agggtgaagc cttgattagc cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg 8460

cggccggagt acatcgagat cgagctagct gattggatgt accgcgagat cacagaaggc 8520

aagaacccgg acgtgctgac ggttcacccc gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc 8580

cgttttctct accgcctggc acgccgcgcc gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc 8640

aagacgatct acgaacgcag tggcagcgcc ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg 8700

cgcaagctga tcgggtcaaa tgacctgccg gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag 8760

gctggcccga tcctagtcat gcgctaccgc aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt 8820

tcctaatgta cggagcagat gctagggcaa attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa 8880

ggtctctttc ctgtggatag cacgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg 8940

aacccgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact 9000

gatataaaag agaaaaaagg cgatttttcc gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact 9060

cttaaaaccc gcctggcctg tgcataactg tctggccagc gcacagccga agagctgcaa 9120

aaagcgccta cccttcggtc gctgcgctcc ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc 9180

gcggccgctg gccgctcaaa aatggctggc ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga 9240

caagccgcgc cgtcgccact cgaccgccgg cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg 9300

tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 9360

tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 9420

gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac 9480

tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac 9540

agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 9600

ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 9660

ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 9720

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 9780

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 9840

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 9900

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 9960

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 10020

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 10080

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 10140

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 10200

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 10260

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 10320

acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 10380

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat 10440

tcatccagta aaatataata ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca 10500

aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag 10560

gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact 10620

ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc 10680

tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg 10740

tcttcttccc agttttcgca atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat 10800

tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga 10860

aagagcctga tgcactccgc atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca 10920

tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca 10980

tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg 11040

tccttttccc gttccacatc ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa 11100

tataggtttt cattttctcc caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta 11160

tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta 11220

gccatttatt atttccttcc tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt 11280

ataacaagac gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa 11340

cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt 11400

tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc 11460

tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat 11520

cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac 11580

tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg 11640

gctggctgg 11649

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gggagtggtg gtacagttgt tgttga 26

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tcaaaaaggg accacttggc tgc 23

Claims (3)

1.一种拟南芥莲座叶的相关基因在调节拟南芥莲座叶器官大小的应用，其中，所述拟南芥莲座叶的相关基因为PUB25，所述PUB25的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增表达拟南芥莲座叶的相关基因，所述拟南芥莲座叶的相关基因为PUB25，其中，所述PUB25的编码序列如SEQ ID NO.1所示，且所述引物对包括与所述PUB25编码序列结合的上游引物和与所述PUB25编码序列结合的下游引物；其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种用于表达拟南芥莲座叶的相关基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物对。

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