CN109112136B - Ggc2基因的分离克隆及其在水稻改良中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及GGC2基因的分离克隆及其在水稻改良中的应用。所述的改良包括利用该基因调控水稻种子大小、株高、分蘖数和穗型。本发明还包括GGC2基因的核苷酸序列和该基因编码的G蛋白γ亚基。通过转基因超量表达GGC2基因，导致水稻种子变大；通过敲除GGC2基因导致水稻种子变小，株高变矮，穗子变密变短。本发明不仅提供了GGC2的活性片段以及遗传转化载体，同时还提供了一种新的改良水稻株型以及粒型的方法。

Description

GGC2基因的分离克隆及其在水稻改良中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种GGC2基因的分离克隆、功能验证及在水稻改良中的应用。本发明通过基因工程技术改变GGC2基因的表达丰度，可以改良水稻的粒型、株型。

背景技术

随着人口不断增加、耕地面积的减少和环境的恶化，粮食安全受到严重挑战。株高、分蘖、穗型和粒重长期以来一直是作物遗传改良的重要目标性状。水稻育种改良的首要目标是提高产量。水稻产量由粒重、每穗颖花数和分蘖数所影响，粒重又可以进一步分解为粒长、粒宽和粒厚(Xing and Zhang,Genetic and molecular bases of rice yield.AnnuRev Plant Biol 2010,61:421-442)。随着人民生活水平的提高，对稻米的品质要求越来越高，并且越来越注重对环境的保护，因此育种的目标在针对产量的同时，还注重品质的改良、抗性的筛选、和氮磷利用的效率等。谷粒大小也是稻米的重要品质性状，消费者普遍喜好细长的粒型的籼稻品种。在我国，认为优质的籼稻品种的稻米长宽比不能低于2.8。因此种子大小是粒重的决定因素，直接影响水稻的产量以及品质。

水稻的产量同时与株型密切相关，以理想株型为改良目标的育种模式在农业生产上受到高度的重视。水稻的株型包含株高、分蘖、穗型、根形态、器官的大小和角度等组成因素(Wang and Li,Molecular basis of plant architecture.Annu Rev Plant Biol,2008,59:253-279)。株高与水稻产量、光合作用以及与抗倒伏性密切相关。发掘改良水稻株高的基因资源，实现对茎杆的控制，可以提高水稻增产的潜力。上个世纪以降低株高为目标的第一次“绿色革命”培育的半矮秆品种，极大的增加了全球农作物的产量。2002年水稻绿色革命基因SD1被成功克隆，其编码的是一种赤霉素氧化酶，控制赤霉素的合成(Sasaki etal.,Green revolution: a mutant gibberellins-synthesis gene in rice.Nature,2002,416:701-702)。穗形态是产量的重要组成元件，包括一次枝梗，二次枝梗，穗长以及穗密度。鉴于穗型在农业生产上的重要意义，科学家已经发现了大量的控制穗型发育的基因，并且一些基因已经在育种实践中得到了应用(Zhang and Yuan,Molecular control ofgrass inflorescence development.Annu Rev Plant Biol,2014,65:553-578)。

在水稻中存在着一类具有C末端的非典型的G蛋白γ亚基，控制着水稻的株高、穗型以及粒型。其中GS3 最早被克隆，主要负调控种子的大小，在育种中广泛应用，对水稻产量有重要的影响(Fan et al.,GS3,a major QTL for grain length and weight andminor QTL for grain width and thickness in rice,encodes a putative

transmembrane protein.Theor Appl Genet,2006,112:1164-1171)。第二个被克隆的基因DEP1，控制穗形态以及株高，它的突变可以显著增加穗粒数，降低株高，增加产量(Huang et al.,Natural variation at the DEP1locus enhances grain yield inrice.Nat Genet,2009,41:494-497)。因此水稻G蛋白γ亚基对水稻的遗传改良具有重要的利用价值。

水稻还含有其他编码G蛋白γ亚基的基因，与GS3以及DEP1的同源程度非常低，它们的生物学功能依然是未知的。本发明通过植物基因工程的手段，在水稻中研究G蛋白γ亚基的功能，挖掘在农业生产上可以用于改良水稻株型、粒型以及穗型的新的G蛋白γ亚基，为水稻理想株型的分子设计育种挖掘基因资源。

发明内容

本发明的目的是从水稻中分离克隆一个GGC2基因，旨在通过对水稻GGC2基因的研究和应用，在水稻种子大小、株高、分蘖数和穗型等目标性状上改良水稻的产量、株型和品质，为水稻遗传育种提供新的基因资源。本发明提供了GGC2基因及其编码的蛋白质，对该基因进行功能及在水稻产量、株型和品质改良中的应用进行了生物功能验证。本发明分离的基因编码一个G蛋白γ亚基，其生物学功能为调控水稻的种子大小、株高、分蘖数和穗型。

本发明分离和应用一个编码G蛋白γ亚基的GGC2基因的DNA片段，并对该片段的作用机理进行阐述。GGC2基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其编码蛋白质如SEQ IDNO：3所示，也包括与SEQ ID NO：2所示的编码区的核苷酸序列有90％以上同源性的基因序列，也包括基因的插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的GGC2基因的DNA片段作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR技术，从栽培稻、野生稻或者禾本科作物的基因组、mRNA和cDNA 中扩增得到本发明的基因或同源基因。同样也可以采取化学合成的方法获得本发明的基因或同源基因。

采用以上技术，可以分离得到包含GGC2基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得增加种子大小，减少分蘖数的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可与其它调控元件，如组成型启动子、诱导型启动子和器官特异性启动子融合构建基因表达载体。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG 起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。突变该基因可以降低株高，改变穗型以及使种子变小；可以通过转基因技术、反义RNA、RNAi、锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases, TALEN)和CRISPR(Clustered RegularlyInterspersed Short Palindromic Repeats)/Cas9等技术对其操控以调控植物的种子大小、株高和穗型。

携带有本发明GGC2基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach(1998)Method forPlant Molecular Biology VIII, Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson andCorey,1998,Plant Molecular Biology(2^nd Edition))。

实现本发明的具体技术方案如下：

1、根据水稻基因组注释的结果，从水稻中分离出包含GGC2基因完整编码区段的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；具体的分离方法在实施例1中有详细描述。

2、将上述包含有GGC2基因完整编码区段的DNA片段连接到pCAMBIA1301S载体上，构建得到GGC2 的超量表达载体，申请人将该表达载体命名为35S:GGC2OE。具体方法在实施例2中有详细描述。

3、设计GGC2的CRISPR突变靶点，构建GGC2的CRISPR突变载体。申请人将该载体命名为pYL-Cas9-gRNA-GGC2；具体方法在实施例3中有详细描述。

3、利用优化过的农杆菌介导的转基因方法(Lin and Zhang,Optimising thetissue culture conditions for high efficiency transformation of indicarice.Plant Cell Rep,2005,23:540-548)将表达载体35S:GGC2OE以及 CRISPR敲除载体pYL-Cas9-gRNA-GGC2导入水稻受体中花11，获得转化植株。具体方法在实施例4中有详细描述。

4、借助PCR的方法分析鉴定阳性转基因植株。在T₀代鉴定35S:GGC2OE转基因植株的基因型，表达量以及表型，进行共分离检测，并对相关表型进行统计分析。具体方法在实施例5中有详细描述。在T₀代鉴定pYL-Cas9-gRNA-GGC2转基因植株的靶位点突变情况，并对相关表型进行统计分析；具体方法在实施例6中有详细描述

与现有技术相比，本发明的优点如下：

本发明描述了分离克隆包含有GGC2基因完整编码区段的DNA片段以及验证GGC2基因功能的方法。本发明发现GGC2基因可以控制水稻的种子大小、株高、分蘖数和穗型，将其超量表达可以增加种子大小，减少分蘖数，将GGC2基因敲除之可以降低株高，改变穗型并使种子变小。本发明可以为水稻的产量、株型和品质遗传改良提供一种新颖方法。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的包含有GGC2基因的基因组序列。序列长度为3133bp.

序列表SEQ ID NO:2是GGC2基因的编码区(即CDS)。该基因编码335个氨基酸。

序列表SEQ ID NO:3是GGC2基因的编码的蛋白质序列。编码335个氨基酸的蛋白质序列。

序列表SEQ ID NO:4是表达载体OsU3-O1-gRNA-polyT的序列。序列长度为603bp。

序列表SEQ ID NO:5是表达载体OsU6a-O2-gRNA-polyT的序列。序列长度为629bp。

序列表SEQ ID NO:6是表达载体OsU3-O1-gRNA-polyT的序列。序列长度为16419bp。

图1：本发明GGC2克隆以及功能验证的技术路线。

图2：是本发明构建的表达载体35S:GGC2OE的构建过程示意图。附图标记说明：

图2中的A图：插入表达载体35S:GGC2OE的包含有GGC2基因编码区的DNA片段示意图。

图2中的B图：用于构建表达载体35S:GGC2OE的空载体pCAMBIA1301S的结构示意图。

图3：本发明构建的表达载体35S:GGC2OE的结构示意图。本发明将图2中的A图所示的片段通过SacI 和SalI双酶切插入图2中的B图所示的载体pCAMBIA1301S的SacI和SalI酶切位点中间，形成转化用的表达载体35S:GGC2OE。

图4：CRISPR载体pYL-Cas9-gRNA-GGC2构建过程示意图。附图标记说明：

图4中的A图：GGC2基因的结构以及CRISPR靶点O1以及O2序列位置示意图。

图4中的B图：将靶点O1以及O2分别通过PCR的方法插入到pYLsgRNA-OsU3以及pYLsgRNA-OsU6a 中，获得OsU3-O1-gRNA-polyT以及OsU6a-O2-gRNA-polyT片段的过程。

图4中的C图：本发明构建的表达载体pYL-Cas9-gRNA-GGC2的结构示意图。本发明将图4B获得的 2个gRNA片段通过BsaI酶切位点与pYLCRISPR/Cas9-MT载体相连接。

图5：35S:GGC2OE转基因植株T₀代表达量检测以及粒长数据。

图6：pYL-Cas9-gRNA-GGC2载体转基因植株GGC2^ko T₀代突变位点检测。附图标记说明：

图6中的A图：GGC2^ko-7以及GGC2^ko-26测序显示的峰图。

图6中的B图：GGC2^ko-7以及GGC2^ko-26突变位点序列分析。

图7：野生型中花11植株(WT)与35S:GGC2OE以及GGC2^ko转基因植株的表型比较。附图标记说明：

图7中的A图：抽穗期的野生型中花11(WT)与35S:GGC2OE以及GGC2^ko转基因植株株高形态的比较。

图7中的B图：野生型中花11(WT)与35S:GGC2OE以及GGC2^ko转基因植株穗型的比较。

图7中的C图：野生型中花11(WT)与35S:GGC2OE以及GGC2^ko转基因植株种子形态的比较。

具体实施方式

根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：分离克隆包含有GGC2基因完整编码区段的DNA片段

本发明采用水稻0.5mm长的幼穗的RNA经过反转录得到的cDNA为模板，利用GGC2基因(该基因的基因组序列如SEQ ID NO:1所示)的特异引物，通过PCR的方法分离克隆GGC2基因的编码区即CDS 序列(序列见SEQ ID NO：2)，其蛋白质序列如SEQ ID NO:3所示。

具体的操作步骤如下：

(1)提取水稻幼穗RNA

抽提水稻品种中花11(或称ZH11，来自中国农业科学院作物科学研究所)植株幼穗分化期0.5mm长的幼穗的RNA，RNA抽提用的试剂购采用Invitrogen公司生产的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤按照试剂盒提供的说明书操作)。

(2)反转录合成cDNA第一链

步骤如下：

①取抽提的总RNA3μg，加入DNaseI 1μl,10×DNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA 酶的强烈抑制剂，工作浓度为0.01％)处理过的水到10μl，混匀后室温放置15min以去除残留的基因组 DNA；

②加入0.2M EDTA 1μl，并于65℃水浴中孵育10min以去除DNaseI的活性

③加入oligo(dT)₁₅引物1μl，并于65℃水浴中孵育10min以破坏RNA的二级结构，然后冰上放置2 min；

④加入5×first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTPmixture 1μl，反转录酶1 μl，混匀后置于42℃水浴锅内温浴1.5h；

⑤反应结束后将反转录产物置于85℃干浴10min以灭活反转录酶；

⑥向反转录产物中加入80μl水，混匀后-20℃保存反应最终产物。反应中用到的试剂全部购自 Invitrogen公司。

(3)扩增GGC2基因的编码区的cDNA，其序列如SEQ ID NO:3所示。

为了扩增GGC2基因编码区的cDNA，本发明设计了如下引物：

GGC2OEF(正向引物)：5'-GAGCTCCGGTGGATAAGTTGGGTTGAG-3'(下划线的序列为SacI识别位点)；

GGC2OER(反向引物)：5'-GTCGACCATACTGTAGTTTAACGATCTACT-3'(下划线的序列为SalI识别位点)；

该引物对可以扩增出GGC2基因的起始密码子上游21bp到终止密码子下游24bp之间的蛋白质编码区段，具体序列如下：

CGGTGGATAAGTTGGGTTGAGATGGGGGAGGCGCCGAGGCCCAAGTCGCCGCCGAGGTACCCGGAC CTGTGCGGCCGGCGGCGGCTGCAGCTGGAGATGCAGATCCTCAACCGGGAGGTCGGCTTCCTCGAGC AAGAGCTACAGGGACTTGAACGGATTCAGCCGGTCTCGAGGTGTTGCAAAGATGTCAACGAATTTGT TGGTGCAAAGTCGGATCCGCTTATACCAATAAACAAAAGGAAACACAGATCTTGCAGCCTCTATCGGT GGATCAGATCGAAATTGTGCAACTGCTTGTTATGCCTCTGCTGTTGGTGCCGGTGCCTCCCAAAGCCC AAGAAACCGAGCTGCTTCAGTTGTTCTTGCTGCTCCTGCTGCGACACATCGTGCTGTAGACCGAGCTG CGGCTGCCTCAAGGCCCCTTCTTCGTGCTGCTGCAAATCCAACTGCAGCTGCTGCAGCAGCGATTGCT GCACCTGCAGCCTTCCCAGCTGCGGCTGCACAGGCTGCGGCCACTGCCGACCGTTGTGTGGCGGCGG CGGCGGCTGCTGTCCGCCCAGCGACTGCTGCTCCAGCTGCAAGTGCTCGTGCTCGTCCTGCACGCGG TGCTGTAGCAGCTGCGCCGGCGGCTGCAAGCCGAGCTGCAGCGGCTGCGGCACGGGGTGCTCGTCCT GCGGCGGCGGCTGCTGCCCCAAGTGCTCGTCCTGCGCGGCGCCGTGCGTCGGCTGCCTGGCTCTGCT CCGGCGGTGGCTGAGCTGCCGGTCGTCGTGCTGCAAGGGGCAGCCGTCCTGCTGCAAGTGCCAGTC GTCGTGCTGCGAGGGGGAGCCTTCCTGCTGCTGCTGCTGCGGCGGCGGGAAGGGATCGTCGGCGTGC TGCTGCGGCAGGCCTTGCTGCCTCGGAGGCGCGACGCCGGCGCCGTCGTGCCCCGAGTGCTCCTGCG GCTGCTCGTGCTCCTGCCCGAGGTGCAAAGATGGGTGCAGCCGCCCGTCGTGTGGCAATCCGTGCTG TGCCGGCGGATGCTTATGCTGAAGTAGATCGTTA AACTACAGTATG

上述片段中的下划线的序列是指扩增的UTR片段，是不编码蛋白的，由于构建的载体是含有这些序列的就写上了。下游的非编码区是24个碱基

以步骤(2)反转录而来的cDNA为模板，用引物GGC2OEF和GGC2OER进行PCR扩增。PCR反应总体积为50μl，包含cDNA模板2μl，2×GC I buffer 25μl，10mM dNTP 5μl，10mM引物GGC2OEF和 GGC2OER各1μl，ExTaq酶1μl,加去离子水至50μl(所用到的2×GC I buffer、dNTP、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。

PCR反应条件如下：①94℃4min；②94℃30s；③58℃30s；④72℃1min；⑤从步骤②－步骤④循环33次；⑥72℃7min；⑦25℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测，回收长度为1065bp(1053bp的目标DNA区段加上引物上附加的两个限制性酶切位点12bp)的DNA片段。进行TA克隆的连接以及测序验证，挑选正确的TA克隆作下一步实验。

实施例2：构建GGC2基因的蛋白质编码区的超量表达载体

用SacI和SalI双酶切质粒TA-GGC2(SacI和SalI限制性内切酶购买自宝生物工程大连有限公司，具体用法与用量参考该公司相应产品的说明书，质粒TA-GGC2来自实施例1，如图2中的A图所示)，回收包含GGC2的1065bp的DNA片段，然后与经过SacI和SalI双酶切的载体质粒pCAMBIA1301S[该载体是公开报道的一种商业质粒:Zhou et al.,Over-expression of aspartate aminotransferase genes in rice resulted in alterednitrogen metabolism and increased amino acid content in seeds.Theor ApplGenet,2009,118:1381-1390；其基本骨架是澳大利亚CAMBIA实验室(http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)的 pCAMBIA1301，通过加入35S启动子实现对转化基因的表达调控，其结构如图2中的B图所示]利用T4 DNA连接酶(购自Promega公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)进行连接。连接产物通过热激化转的方法转入大肠杆菌Tran-T1(购自北京全式金生物技术有限公司)中，加400μl LB培养基复苏 45min，涂于含50mg/L的卡那霉素的LA培养基平板上，37℃温箱培养14-16h(LA与LB配方参考：萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。挑取单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过SacI和SalI双酶切筛选阳性克隆，并将所得的表达载体命名为35S:GGC2OE，其结构如图2所示。

实施例3：构建GGC2基因突变载体pYL-Cas9-gRNA-GGC2

针对水稻GGC2基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，位于GGC2基因的第2个外显子，其核苷酸序列为O1：5’AACGGATTCAGCCGGTCTCG3’；O2：5’GGGACTTGAACGGATTCAGC3’(见图4中的A图)。将sgRNA O1以及O2通过重叠延伸PCR的方法分别插入到载体pYLsgRNA-OsU3与pYLsgRNA-OsU6a中，获得PCR片段OsU3-O1-gRNA-polyT(序列如SEQ ID NO:4所示)以及OsU6a-O2-gRNA-polyT(序列如SEQ ID NO:5所示)。将以上PCR片段通过BsaⅠ酶切连接至pYLCRISPR/Cas-MH(序列如SEQ ID NO:6所示)载体中。 pYLsgRNA-OsU3、pYLsgRNA-OsU6a以及pYLCRISPR/Cas-MH载体由华南农业大学刘耀光教授惠赠，参考文献(含载体构建)已公开发表：Ma et al.,A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-EfficiencyMultiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Molecular Plant,2015,8:1274–1284)。具体操作步骤如下所述：

(1)OsU3-O1-gRNA-polyT以及OsU6a-O2-gRNA-polyT片段的构建

第一轮PCR以pYLsgRNA-OsU3质粒(华南农业大学刘耀光教授惠赠)为模板，用引物B1’和O1R 扩增OsU3启动子与GGC2基因20bp的O1靶序列；同样以pYL-U3-gRNA为模板，用引物O1F和B2扩增GGC2基因O1靶序列与gRNA-polyT；第二轮PCR是以第一轮PCR产物为模板，用引物B1’和B2扩增得到OsU3-O1-gRNA-polyT片段。

采用同样的方法获得OsU6a-O2-gRNA-polyT的片段。第一轮PCR以pYLsgRNA-OsU6a质粒(由华南农业大学刘耀光教授惠赠)为模板，用引物B2’和O2R扩增OsU6a启动子与GGC2基因20bp的O2靶序列；同样以pYL-U6a-gRNA为模板，用引物O2F和BL扩增GGC2基因O2靶序列与gRNA-polyT；第二轮PCR是以第一轮PCR产物为模板，用引物B2’和BL扩增得到OsU6a-O2-gRNA-polyT片段(见图4中的B图所示)。

(2)GGC2的CRISPR突变载体pYL-Cas9-gRNA-GGC2的构建

利用限制性内切酶BsaⅠ，通过一边酶切一边连连的方法，将OsU3-O1-gRNA-polyT和OsU6-O2-gRNA-polyT的PCR片段连接到pYLCRISPR/Cas9-MT载体(由华南农业大学刘耀光教授惠赠) 中的BsaⅠ位点处中(参见图4中的C图)。

其中步骤(1)中使用的引物序列如下:

B1’:TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3(下划线的序列为BsaⅠ酶切位点)

B2:AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3(下划线的序列为BsaⅠ酶切位点)

B2’:TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3(下划线的序列为BsaⅠ酶切位点)

BL:AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3(下划线的序列为BsaⅠ酶切位点)

O1F:AACGGATTCAGCCGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(下划线的序列为靶点O1)

O1R:CGAGACCGGCTGAATCCGTTTGCCACGGATCATCTGCACA(下划线的序列为靶点O1)

O2F:GGGACTTGAACGGATTCAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(下划线的序列为靶点O2)

O2R:GCTGAATCCGTTCAAGTCCCCGGCAGCCAAGCCAGCACCCG(下划线的序列为靶点O2)

实施例4：转基因水稻的获得

将表达载体35S:GGC2OE(来自实施例2)，以及敲除载体pYL-Cas9-gRNA-GGC2(来自实施例3)通过农杆菌EHA105介导的遗传转化方法导入水稻品种中花11(又称ZH11，品种资源来自中国农业科学院作物科学研究所)的愈伤组织，经过预培养、侵染培养、共培养和筛选培养得到具有对潮霉素(用于筛选阳性的转基因愈伤的一种抗生素，购自丹麦的罗氏制药有限公司)抗性的愈伤组织，再经过分化培养、生根培养，炼苗并移栽至大田，得到转基因植株。本发明的农杆菌遗传转化的方法和所用的试剂及配方是根据Hiei等人的报道优化而来(Hiei et al.,Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6:271-282；Lin and Zhang, Optimising the tissue culture conditions forhigh efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep,2005, 23:540-548)。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

室温下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂-EDTA贮存液(100×)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g，在另一个大三角瓶中加入300ml 蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g。将它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2h，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100×)

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10×)

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100×)

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液(1mg/ml)

2,4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾(KOH)5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

(3)培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml /瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml /瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μlAS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/ 皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/ 皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化的步骤如下：

(1)愈伤组织的诱导

1)将成熟的水稻种子(中花11)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1min，0.15％氯化汞(HgCl₂)15min

2)灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。

(2)愈伤组织的继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

(3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于预培养基上黑暗下培养4d，培养温度为26±1℃。

(4)农杆菌培养

1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105 2d，培养温度为28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，与28℃摇床上培养2-3h。

(5)农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤组织转移至灭菌好的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

3)将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30min；

4)转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上并吸干；然后放置在共培养培养基上培养2d，培养温度为19-20℃。

(6)愈伤组织洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤组织至看不见农杆菌；

2)将洗涤后的愈伤组织浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30min；

3)将步骤2)处理的愈伤组织转移至灭菌好的滤纸上吸干；

4)将步骤3)的愈伤组织转移至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)。

(7)分化

1)将抗性愈伤组织转移至预分化培养基上并在黑暗处培养5-7d；

2)将步骤1)培养的愈伤组织转移至预分化培养基上，在光照培养室(16小时光照，光照强度按水稻遗传转化或组织培养常规光照/8小时黑暗)下培养，培养温度为26℃，培养5－7周。

(8)生根

1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

2)然后将其转移至生根培养基中于光照培养室(16小时光照，光照强度按水稻遗传转化或组织培养常规光照/8小时黑暗)下培养2-3周，培养温度为26℃，得到转基因植株。

(9)移栽

洗掉转基因植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载至大田。

实施例5：GGC2基因转基因水稻的鉴定

(1)GGC2基因超量表达转基因植株的表达量检测

1)抽提来自35S:GGC2OE的转化植株分蘖期叶片的RNA，反转录合成cDNA。方法和过程同实施例1。

2)对得到的反转录产物用2对引物进行RT-PCR的检测(引物组合为GGC2QRT-F1和GGC2QRT-R1，以及GGC2QRT-F2和GGC2QRT-R2)，并且用Ubiquitin基因(LOC_Os03g13170)的扩增结果作为内参(引物组合为UbiQRT-F和UbiQRT-R)，序列如下所示：

GGC2QRT-F1:5'-GTGCAACTGCTTGTTATGCC-3'

GGC2QRT-R1:5'-GCTCGGTCTACAGCACGAT-3'

GGC2QRT-F2:5'-GGACTTGAACGGATTCAGC-3'

GGC2QRT-R2:5'-GATCCGACTTTGCACCAAC-3'

UbiQRT-F:5'-AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3'

UbiQRT-R:5'-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3'

PCR反应总体积为20μl，包含cDNA模板1ul，2×GCⅠbuffer 10μl，10 mM dNTP 2μl，10 mM引物各0.2μl，rTaq酶0.2μl,加去离子水至20μl(所用到的2×GCⅠbuffer、dNTP、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4 min；②94℃40 s；③58℃30 s；④72℃30s；⑤从步骤②至步骤④循环28次；⑥72℃7 min；⑦4℃保存。PCR产物在2％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。

RT-PCR检测结果表明，表达载体35S:GGC2OE转基因阳性植株相对于阴性植株而言，其表达量明显上升。对种子的长度进行考察表明，表达量上升的单株种子变长，表型与表达量呈共分离，结果如图4所示。

(2)GGC2基因CRIPSR突变的转基因植株检测

选取靶点上下游127-198bp序列，设计引物，进行PCR扩增，对扩增片段进行测序，通过峰图判断靶位点是否发生突变。鉴定GGC2基因突变效果的引物序列如下(片段大小为352bp)：

GGC2E2F:5'-GCATTGCTCGTGTTCTTTACTG-3'

GGGCE2R:5'-CTGACATTCAGAGTAGCTGTG-3'

用引物GGC2E2F对GGC2基因CRIPSR突变的T₀转基因单株的PCR产物进行测序。测序结果表明纯合突变的转基因植株GGC2^ko-7在GGC2基因中插入了1bp；GGC2^ko-26在GGC2基因中缺失了4bp，造成移码突变，导致GGC2基因的翻译提前终止。测序峰图以及突变位点分析见图5。

GGC2^ko-7突变体插入了1bp的GGC2的编码序列如下(带方框的碱基代表插入的1bp，下划线代表sgRNA 位点)：

ATGGGGGAGGCGCCGAGGCCCAAGTCGCCGCCGAGGTACCCGGACCTGTGCGGCCGGCGGCGGCTG CAGCTGGAGATGCAGATCCTCAACCGGGAGGTCGGCTTCCTCGAGCAAGAGCTACAGGGACTTGAACGGATTC

AG CCGGTCTCGAGGTGTTGCAAAGATGTCAACGAATTTGTTGGTGCAAAGTCGGATCCGC TTATACCAATAAACAAAAGGAAACACAGATCTTGCAGCCTCTATCGGTGGATCAGATCGAAATTGTGC AACTGCTTGTTATGCCTCTGCTGTTGGTGCCGGTGCCTCCCAAAGCCCAAGAAACCGAGCTGCTTCAG TTGTTCTTGCTGCTCCTGCTGCGACACATCGTGCTGTAGACCGAGCTGCGGCTGCCTCAAGGCCCCTT CTTCGTGCTGCTGCAAATCCAACTGCAGCTGCTGCAGCAGCGATTGCTGCACCTGCAGCCTTCCCAGC TGCGGCTGCACAGGCTGCGGCCACTGCCGACCGTTGTGTGGCGGCGGCGGCGGCTGCTGTCCGCCCA GCGACTGCTGCTCCAGCTGCAAGTGCTCGTGCTCGTCCTGCACGCGGTGCTGTAGCAGCTGCGCCGG CGGCTGCAAGCCGAGCTGCAGCGGCTGCGGCACGGGGTGCTCGTCCTGCGGCGGCGGCTGCTGCCC CAAGTGCTCGTCCTGCGCGGCGCCGTGCGTCGGCTGCCTGGCTCTGCTCCGGCGGTGGCTGAGCTGC CGGTCGTCGTGCTGCAAGGGGCAGCCGTCCTGCTGCAAGTGCCAGTCGTCGTGCTGCGAGGGGGAG CCTTCCTGCTGCTGCTGCTGCGGCGGCGGGAAGGGATCGTCGGCGTGCTGCTGCGGCAGGCCTTGCT GCCTCGGAGGCGCGACGCCGGCGCCGTCGTGCCCCGAGTGCTCCTGCGGCTGCTCGTGCTCCTGCCC GAGGTGCAAAGATGGGTGCAGCCGCCCGTCGTGTGGCAATCCGTGCTGTGCCGGCGGATGCTTATGC TGA

突变后推导的氨基酸序列如下：

MGEAPRPKSPPRYPDLCGRRRLQLEMQILNREVGFLEQELQGLERIQAGLEVLQRCQRICWCKVGSAYTNKQKETQILQPLSVDQIEIVQLLVMPLLLVPVPPKAQETELLQLFLLLLLRHIVL GGC2^ko-26突变体GGC2缺失了4bp的编码序列如下(带方框的碱基代表缺失的4bp，下划线代表sgRNA 位点)：

ATGGGGGAGGCGCCGAGGCCCAAGTCGCCGCCGAGGTACCCGGACCTGTGCGGCCGGCGGCGGCTG CAGCTGGAGATGCAGATCCTCAACCGGGAGGTCGGCTTCCTCGAGCAAGAGCTACAGGGACTTGAACGG

AGCCGGTCTCGAGGTGTTGCAAAGATGTCAACGAATTTGTTGGTGCAAAGTCGGATCCGCTT ATACCAATAAACAAAAGGAAACACAGATCTTGCAGCCTCTATCGGTGGATCAGATCGAAATTGTGCAA CTGCTTGTTATGCCTCTGCTGTTGGTGCCGGTGCCTCCCAAAGCCCAAGAAACCGAGCTGCTTCAGTT GTTCTTGCTGCTCCTGCTGCGACACATCGTGCTGTAGACCGAGCTGCGGCTGCCTCAAGGCCCCTTCT TCGTGCTGCTGCAAATCCAACTGCAGCTGCTGCAGCAGCGATTGCTGCACCTGCAGCCTTCCCAGCT GCGGCTGCACAGGCTGCGGCCACTGCCGACCGTTGTGTGGCGGCGGCGGCGGCTGCTGTCCGCCCA GCGACTGCTGCTCCAGCTGCAAGTGCTCGTGCTCGTCCTGCACGCGGTGCTGTAGCAGCTGCGCCGG CGGCTGCAAGCCGAGCTGCAGCGGCTGCGGCACGGGGTGCTCGTCCTGCGGCGGCGGCTGCTGCCC CAAGTGCTCGTCCTGCGCGGCGCCGTGCGTCGGCTGCCTGGCTCTGCTCCGGCGGTGGCTGAGCTGC CGGTCGTCGTGCTGCAAGGGGCAGCCGTCCTGCTGCAAGTGCCAGTCGTCGTGCTGCGAGGGGGAG CCTTCCTGCTGCTGCTGCTGCGGCGGCGGGAAGGGATCGTCGGCGTGCTGCTGCGGCAGGCCTTGCT GCCTCGGAGGCGCGACGCCGGCGCCGTCGTGCCCCGAGTGCTCCTGCGGCTGCTCGTGCTCCTGCCC GAGGTGCAAAGATGGGTGCAGCCGCCCGTCGTGTGGCAATCCGTGCTGTGCCGGCGGATGCTTATGC TGA

突变后推导的氨基酸序列如下：

MGEAPRPKSPPRYPDLCGRRRLQLEMQILNREVGFLEQELQGLERSRGVAKMSTNLLVQSRIRLYQ

(对突变后推导的氨基酸序列的说明：蛋白质的编码是从核酸的ATG起始密码子开始到TGA/TAA/TAG 这3个中的一个终止子停止。没有突变的蛋白质序列从ATG一直可以编码到TGA，但是如果在中间插入了一个碱基或者缺失了4个碱基，那么它的读码框就发生了移码，以此类推，从ATG开始，到3的整数倍的终止子TGA/TAA/TAG就停止了，所以编码的蛋白就不一样了，从而丧失了原有蛋白的功能。这里上述2个核苷酸序列和氨基酸序列是指的利用crispr构建的突变体的序列，相对于在原始序列中插入了一个碱基或者缺失了4个碱基。上述公开的序列只是描述突变体的状况。)

本发明成功构建获得GGC2基因单碱基插入以及4碱基缺失的CRIPSR纯合突变的转基因植株。

实施例6：转基因水稻的表型鉴定

为了进行表型分析，申请人将2个独立转化而来的35S:GGC2OE的T₀植株及GGC2^ko-7，GGC2^ko-26T₀的种子以经过常规浸种、催芽后播种于秧田，20d以后移栽至大田获得T₁代转基因植株。种植密度即株行距为15厘米×24厘米，种植地点为中国湖北省武汉市洪山区华中农业大学的试验田，在一个有生物基因安全防护设施条件下按常规的水稻种植方法进行田间管理。

利用PCR的方法检测GUS基因进行35S:GGC2OE阳性鉴定，并且分析PCR检测结果与表型的对应关系。结果表明35S:GGC2OE在T₁代分离出来的所有GUS阳性单株相对于阴性单株而言，都表现为种子变大，分蘖减少，表明35S:GGC2OE的转基因事件同本发明所指的种子变大以及分蘖减少的表型是共分离的。对GGC2^ko-7，GGC2^ko-26这两个纯合突变体的T₁表型与野生型“中花11”进行比较，这2个纯合突变体都显著降低了株高，穗长以及种子大小。由此说明GGC2基因是正调控种子大小的基因，它的突变会使种子变小，降低株高以及穗长(图6)。考察和记录T₁代相关植株的表型变化和数据，包括株高、分蘖数、每穗粒数和穗长、粒长以及粒宽，并以每个家系分离出来的GUS阴性单株为对照，分别进行统计学分析，结果见表1。

表1 GGC2超量表达以及CRIPSR突变的转基因植株T₁代的表型统计值

表1的说明：

表1中的(+)和(-)分别表示转基因阳性和阴性单株。利用t测验进行统计学分析，^a,b,c分别表示P< 0.05、0.01和0.001的显著水平。

GGC2^ko是与中花11即ZH11相比较的结果。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> GGC2基因的分离克隆及其在水稻改良中的应用

<141> 2017-08-16

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3133

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(3133)

<400> 1

agggtggttg tcttgcgtct ccggtggata agttgggttg agatggggga ggcgccgagg 60

cccaagtcgc cgccgaggta cccggacctg tgcggccggc ggcggctgca gctggagatg 120

cagatcctca accgggaggt cggcttcctc gaggtgacct cacttcactt ccccgtcatg 180

tcacctcgct ttctttcaca gtgatgaaga aaagcgtgca tttttttttg ttcttcctat 240

ggagtggaga gacagagaga gagagagaga gagagagagg aaatctccgg ggaaaaaagt 300

tgatgtggag agctcatcgg tttggggttt cgcgacggaa gcgaggcgag agctcgctct 360

gtcgcgacaa ccgatgcgcg acaggctccc atgttgtact agcagtacgt gcggctgtca 420

tggctgcccc tactgccgtc ttcttgcaga gagaacaaga acaatgggca gccatgaacc 480

aatgccattt tacttctgga gtagtagtag tagtagagtt ctactgcaat atgtattttt 540

tccccctgca acatcaggca tttcagaatt gcaaagcaag tgcagtatag gagtagtact 600

tccgaagtct cctcattaca ttgcatcatg cgtaaagtct gatgaattct ggaactatag 660

gggtatgggg gagtacctgc aattgataat taaaaataaa aagaactcta ctttcagatt 720

tctgcttctc ttgagcgtga catcacctgg caatggcaat cagtaggtag agacgctgct 780

gctgctgctg cgcattgctc gtgttcttta ctgcttccat tcatggcaca tggagcagga 840

ctgtgtatag gtctgtggaa gccatgtgca tgtgcctcgg cctgactggg ggctcccttt 900

ttgcagcaag agctacaggg acttgaacgg attcagccgg tctcgaggtg ttgcaaagag 960

tatgcgccct atcctctcct ttctgctttc ctcattagcc tcgcttctct ctgcaaatct 1020

tgtcgccggc agtgctggtg tttcgctcgg atgggcaact agcaagttct tgttcattct 1080

agtgatctag tctcagcctt tcaggctcaa atgccattta atcacagcta ctctgaatgt 1140

cagtagtgtt tgagtcatta gtgttgttgt ttctttgatt tgtagtggtc ttattgataa 1200

acaagacaat tctttttccg aggagagcac taaaaattag aattttttcc attgtgttct 1260

ttttatttgc tgaatcctga cacattcctc aaacttattt tttttttgaa aaaaaagaaa 1320

gtggcccaca tgaattgcga catttactat acttttcgat tttcttgaat gccaataata 1380

atctctgcta gtaacttctg acctggtggt ccaacagtca acatgtgaac tgttcatgca 1440

tgacctacat ttcaattttg ctccttttgg aactgtacta tgtaacgttc aaatgccatt 1500

gtcgattaca aagatactaa tgctatatta tcacatttgg cagtgtcaac gaatttgttg 1560

gtgcaaagtc ggatccgctt ataccaatgt atgaatatat tgatttatgt tttgcatttc 1620

agagtttctt ttttcaaagt ttgctgatca gtgttctccc tgtgccttat ttattccaga 1680

aacaaaagga aacacagatc ttgcagcctc tatcggtgga tcaggtccct tactcttccc 1740

ttgtccatgc ttttgggtgt acggataaaa acattctaaa agctttgctg tttaaaccga 1800

gggaatatat tgttgtttat aatttgagag tttattaaat tcaagccatt agtgaataag 1860

taggtaacac tcatagggca aagtatgaca atatgctggt ttcagtttgt tgctgaataa 1920

actagttcaa cagtcaacac tgttaagact catactccta cttgtttctg ttcctgtcaa 1980

atgcccgaac tgaatttcac cttattagcc cattttatca aatgctcact caatttgtag 2040

aacctcaata caccaacaaa gtgatttgtc agaaatgtca cactttaata ctacatgata 2100

actcggagta ctgccttctt ttgatgaaaa aagtcaggat atctgacatc agttatggtg 2160

gcatcaaagc aattttcgca gtctttttgt ggagccaata ctgttcccag aactgcagcg 2220

ctatttacac gacaaatacc gccttttttt tcgttctgaa cttcttgcaa atgacatgct 2280

gtttcaacgc tcccttggaa agactaaaag atcttaaacc tgttgttttt tatcagatcg 2340

aaattgtgca actgcttgtt atgcctctgc tgttggtgcc ggtgcctccc aaagcccaag 2400

aaaccgagct gcttcagttg ttcttgctgc tcctgctgcg acacatcgtg ctgtagaccg 2460

agctgcggct gcctcaaggc cccttcttcg tgctgctgca aatccaactg cagctgctgc 2520

agcagcgatt gctgcacctg cagccttccc agctgcggct gcacaggctg cggccactgc 2580

cgaccgttgt gtggcggcgg cggcggctgc tgtccgccca gcgactgctg ctccagctgc 2640

aagtgctcgt gctcgtcctg cacgcggtgc tgtagcagct gcgccggcgg ctgcaagccg 2700

agctgcagcg gctgcggcac ggggtgctcg tcctgcggcg gcggctgctg ccccaagtgc 2760

tcgtcctgcg cggcgccgtg cgtcggctgc ctggctctgc tccggcggtg gctgagctgc 2820

cggtcgtcgt gctgcaaggg gcagccgtcc tgctgcaagt gccagtcgtc gtgctgcgag 2880

ggggagcctt cctgctgctg ctgctgcggc ggcgggaagg gatcgtcggc gtgctgctgc 2940

ggcaggcctt gctgcctcgg aggcgcgacg ccggcgccgt cgtgccccga gtgctcctgc 3000

ggctgctcgt gctcctgccc gaggtgcaaa gatgggtgca gccgcccgtc gtgtggcaat 3060

ccgtgctgtg ccggcggatg cttatgctga agtagatcgt taaactacag tatggttttg 3120

tactattctt ttt 3133

<210> 2

<211> 1008

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1008)

<400> 2

atg ggg gag gcg ccg agg ccc aag tcg ccg ccg agg tac ccg gac ctg 48

Met Gly Glu Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Arg Tyr Pro Asp Leu

1 5 10 15

tgc ggc cgg cgg cgg ctg cag ctg gag atg cag atc ctc aac cgg gag 96

Cys Gly Arg Arg Arg Leu Gln Leu Glu Met Gln Ile Leu Asn Arg Glu

20 25 30

gtc ggc ttc ctc gag caa gag cta cag gga ctt gaa cgg att cag ccg 144

Val Gly Phe Leu Glu Gln Glu Leu Gln Gly Leu Glu Arg Ile Gln Pro

35 40 45

gtc tcg agg tgt tgc aaa gat gtc aac gaa ttt gtt ggt gca aag tcg 192

Val Ser Arg Cys Cys Lys Asp Val Asn Glu Phe Val Gly Ala Lys Ser

50 55 60

gat ccg ctt ata cca ata aac aaa agg aaa cac aga tct tgc agc ctc 240

Asp Pro Leu Ile Pro Ile Asn Lys Arg Lys His Arg Ser Cys Ser Leu

65 70 75 80

tat cgg tgg atc aga tcg aaa ttg tgc aac tgc ttg tta tgc ctc tgc 288

Tyr Arg Trp Ile Arg Ser Lys Leu Cys Asn Cys Leu Leu Cys Leu Cys

85 90 95

tgt tgg tgc cgg tgc ctc cca aag ccc aag aaa ccg agc tgc ttc agt 336

Cys Trp Cys Arg Cys Leu Pro Lys Pro Lys Lys Pro Ser Cys Phe Ser

100 105 110

tgt tct tgc tgc tcc tgc tgc gac aca tcg tgc tgt aga ccg agc tgc 384

Cys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Asp Thr Ser Cys Cys Arg Pro Ser Cys

115 120 125

ggc tgc ctc aag gcc cct tct tcg tgc tgc tgc aaa tcc aac tgc agc 432

Gly Cys Leu Lys Ala Pro Ser Ser Cys Cys Cys Lys Ser Asn Cys Ser

130 135 140

tgc tgc agc agc gat tgc tgc acc tgc agc ctt ccc agc tgc ggc tgc 480

Cys Cys Ser Ser Asp Cys Cys Thr Cys Ser Leu Pro Ser Cys Gly Cys

145 150 155 160

aca ggc tgc ggc cac tgc cga ccg ttg tgt ggc ggc ggc ggc ggc tgc 528

Thr Gly Cys Gly His Cys Arg Pro Leu Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys

165 170 175

tgt ccg ccc agc gac tgc tgc tcc agc tgc aag tgc tcg tgc tcg tcc 576

Cys Pro Pro Ser Asp Cys Cys Ser Ser Cys Lys Cys Ser Cys Ser Ser

180 185 190

tgc acg cgg tgc tgt agc agc tgc gcc ggc ggc tgc aag ccg agc tgc 624

Cys Thr Arg Cys Cys Ser Ser Cys Ala Gly Gly Cys Lys Pro Ser Cys

195 200 205

agc ggc tgc ggc acg ggg tgc tcg tcc tgc ggc ggc ggc tgc tgc ccc 672

Ser Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ser Ser Cys Gly Gly Gly Cys Cys Pro

210 215 220

aag tgc tcg tcc tgc gcg gcg ccg tgc gtc ggc tgc ctg gct ctg ctc 720

Lys Cys Ser Ser Cys Ala Ala Pro Cys Val Gly Cys Leu Ala Leu Leu

225 230 235 240

cgg cgg tgg ctg agc tgc cgg tcg tcg tgc tgc aag ggg cag ccg tcc 768

Arg Arg Trp Leu Ser Cys Arg Ser Ser Cys Cys Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255

tgc tgc aag tgc cag tcg tcg tgc tgc gag ggg gag cct tcc tgc tgc 816

Cys Cys Lys Cys Gln Ser Ser Cys Cys Glu Gly Glu Pro Ser Cys Cys

260 265 270

tgc tgc tgc ggc ggc ggg aag gga tcg tcg gcg tgc tgc tgc ggc agg 864

Cys Cys Cys Gly Gly Gly Lys Gly Ser Ser Ala Cys Cys Cys Gly Arg

275 280 285

cct tgc tgc ctc gga ggc gcg acg ccg gcg ccg tcg tgc ccc gag tgc 912

Pro Cys Cys Leu Gly Gly Ala Thr Pro Ala Pro Ser Cys Pro Glu Cys

290 295 300

tcc tgc ggc tgc tcg tgc tcc tgc ccg agg tgc aaa gat ggg tgc agc 960

Ser Cys Gly Cys Ser Cys Ser Cys Pro Arg Cys Lys Asp Gly Cys Ser

305 310 315 320

cgc ccg tcg tgt ggc aat ccg tgc tgt gcc ggc gga tgc tta tgc tga 1008

Arg Pro Ser Cys Gly Asn Pro Cys Cys Ala Gly Gly Cys Leu Cys

325 330 335

<210> 3

<211> 335

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Gly Glu Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Arg Tyr Pro Asp Leu

1 5 10 15

Cys Gly Arg Arg Arg Leu Gln Leu Glu Met Gln Ile Leu Asn Arg Glu

20 25 30

Val Gly Phe Leu Glu Gln Glu Leu Gln Gly Leu Glu Arg Ile Gln Pro

35 40 45

Val Ser Arg Cys Cys Lys Asp Val Asn Glu Phe Val Gly Ala Lys Ser

50 55 60

Asp Pro Leu Ile Pro Ile Asn Lys Arg Lys His Arg Ser Cys Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Arg Trp Ile Arg Ser Lys Leu Cys Asn Cys Leu Leu Cys Leu Cys

85 90 95

Cys Trp Cys Arg Cys Leu Pro Lys Pro Lys Lys Pro Ser Cys Phe Ser

100 105 110

Cys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Asp Thr Ser Cys Cys Arg Pro Ser Cys

115 120 125

Gly Cys Leu Lys Ala Pro Ser Ser Cys Cys Cys Lys Ser Asn Cys Ser

130 135 140

Cys Cys Ser Ser Asp Cys Cys Thr Cys Ser Leu Pro Ser Cys Gly Cys

145 150 155 160

Thr Gly Cys Gly His Cys Arg Pro Leu Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys

165 170 175

Cys Pro Pro Ser Asp Cys Cys Ser Ser Cys Lys Cys Ser Cys Ser Ser

180 185 190

Cys Thr Arg Cys Cys Ser Ser Cys Ala Gly Gly Cys Lys Pro Ser Cys

195 200 205

Ser Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ser Ser Cys Gly Gly Gly Cys Cys Pro

210 215 220

Lys Cys Ser Ser Cys Ala Ala Pro Cys Val Gly Cys Leu Ala Leu Leu

225 230 235 240

Arg Arg Trp Leu Ser Cys Arg Ser Ser Cys Cys Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255

Cys Cys Lys Cys Gln Ser Ser Cys Cys Glu Gly Glu Pro Ser Cys Cys

260 265 270

Cys Cys Cys Gly Gly Gly Lys Gly Ser Ser Ala Cys Cys Cys Gly Arg

275 280 285

Pro Cys Cys Leu Gly Gly Ala Thr Pro Ala Pro Ser Cys Pro Glu Cys

290 295 300

Ser Cys Gly Cys Ser Cys Ser Cys Pro Arg Cys Lys Asp Gly Cys Ser

305 310 315 320

Arg Pro Ser Cys Gly Asn Pro Cys Cys Ala Gly Gly Cys Leu Cys

325 330 335

<210> 4

<211> 603

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(603)

<400> 4

ttcagaggtc tctctcgcac tggaatcggc agcaaaggac gcgttgacat tgtaggacta 60

tattgctcta ataaaggaag gaatctttaa acatacgaac agatcactta aagttcttct 120

gaagcaactt aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg tgcagtcagg 180

gaccatagca caagacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg gaagccggga 240

acactgggta cgttggaaac cacgtgtgat gtgaaggagt aagataaact gtaggagaaa 300

agcatttcgt agtgggccat gaagcctttc aggacatgta ttgcagtatg ggccggccca 360

ttacgcaatt ggacgacaac aaagactagt attagtacca cctcggctat ccacatagat 420

caaagctggt ttaaaagagt tgtgcagatg atccgtggca aacggattca gccggtctcg 480

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 540

ggcaccgagt cggtgctttt tttcaagagc ttggagtgga tggaccctga cgagacccac 600

gct 603

<210> 5

<211> 629

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(629)

<400> 5

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaaggat tttttcctgt agttttccca 60

caaccatttt ttaccatccg aatgatagga taggaaaaat atccaagtga acagtattcc 120

tataaaattc ccgtaaaaag cctgcaatcc gaatgagccc tgaagtctga actagccggt 180

cacctgtaca ggctatcgag atgccataca agagacggta gtaggaacta ggaagacgat 240

ggttgattcg tcaggcgaaa tcgtcgtcct gcagtcgcat ctatgggcct ggacggaata 300

ggggaaaaag ttggccggat aggagggaaa ggcccaggtg cttacgtgcg aggtaggcct 360

gggctctcag cacttcgatt cgttggcacc ggggtaggat gcaatagaga gcaacgttta 420

gtaccacctc gcttagctag agcaaactgg actgccttat atgcgcgggt gctggcttgg 480

ctgccgggga cttgaacgga ttcagcgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 540

ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttc aagagcttgg 600

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<210> 6

<211> 16419

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(16419)

<400> 6

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat 300

ccggtcggca tctactctat ttctttgccc tcggacgagt gctggggcgt cggtttccac 360

tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt 420

gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc 480

aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc 540

ggagcatata cgcccggagt cgtggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt 600

agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct 660

cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat 720

tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc 780

agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt 840

cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac 900

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taagatcggc cgcagcgatc gcatccatag cctccgcgac cggttgtaga acagcgggca 1020

gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg 1080

tcaggctctc gctaaactcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg 1140

caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca 1200

ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga 1260

gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg 1320

cggtgagttc aggctttttc atatctcatt gccccccggg atctgcgaaa gctcgagaga 1380

gatagatttg tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt 1440

ccttatatag aggaaggtct tgcgaaggat agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag 1500

tggagatatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca 1560

cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa 1620

cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg 1680

tccttttgat gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta 1740

ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct 1800

tggagtagac gagagtgtcg tgctccacca tgttatcaca tcaatccact tgctttgaag 1860

acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg 1920

gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt 1980

tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat 2040

ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt 2100

cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt 2160

tggcaagctg ctctagccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 2220

atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 2280

tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat 2340

gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 2400

cgaattcgag ctcggtacca actataacgg tcctaaggta gcgaaggatc cgctcgctac 2460

cttaagagag gatatccctc catcctataa tgtaggctat aggaactagg gcaaggccgg 2520

ccatgcggcc gcaagctggg tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta gagataatga 2580

gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa 2640

gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac tctacgaata atataatcta 2700

tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc 2760

taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat 2820

gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa tacttcatcc attttattag 2880

tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac taattttttt agtacatcta 2940

ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac tctattttag tttttttatt 3000

taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt 3060

taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg 3120

ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg 3180

ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc 3240

cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag 3300

acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac ggcacggcag ctacggggga 3360

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ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc 3480

tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc 3540

ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc ggtagttcta 3600

cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt 3660

acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag tgtttctctt 3720

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tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact 3840

tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt 3900

tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa 3960

ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg 4020

gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg catatacaga 4080

gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt 4140

ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt 4200

atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag 4260

gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca 4320

tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata 4380

attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt 4440

ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac 4500

cctgttgttt ggtgttactt ctgcagatgg ctcctaagaa gaagcggaag gttggtattc 4560

acggggtgcc tgcggctgac aagaagtact ccatcggcct cgacatcggc accaacagcg 4620

tcggctgggc ggtgatcacc gacgagtaca aggtcccgtc caagaagttc aaggtcctgg 4680

gcaacaccga ccgccactcc atcaagaaga acctcatcgg cgccctcctc ttcgactccg 4740

gcgagacggc ggaggcgacc cgcctcaagc gcaccgcccg ccgccgctac acccgccgca 4800

agaaccgcat ctgctacctc caggagatct tctccaacga gatggcgaag gtcgacgact 4860

ccttcttcca ccgcctcgag gagtccttcc tcgtggagga ggacaagaag cacgagcgcc 4920

accccatctt cggcaacatc gtcgacgagg tcgcctacca cgagaagtac cccactatct 4980

accaccttcg taagaagctt gttgactcta ctgataaggc tgatcttcgt ctcatctacc 5040

ttgctctcgc tcacatgatc aagttccgtg gtcacttcct tatcgagggt gaccttaacc 5100

ctgataactc cgacgtggac aagctcttca tccagctcgt ccagacctac aaccagctct 5160

tcgaggagaa ccctatcaac gcttccggtg tcgacgctaa ggcgatcctt tccgctaggc 5220

tctccaagtc caggcgtctc gagaacctca tcgcccagct ccctggtgag aagaagaacg 5280

gtcttttcgg taacctcatc gctctctccc tcggtctgac ccctaacttc aagtccaact 5340

tcgacctcgc tgaggacgct aagcttcagc tctccaagga tacctacgac gatgatctcg 5400

acaacctcct cgctcagatt ggagatcagt acgctgatct cttccttgct gctaagaacc 5460

tctccgatgc tatcctcctt tcggatatcc ttagggttaa cactgagatc actaaggctc 5520

ctctttctgc ttccatgatc aagcgctacg acgagcacca ccaggacctc accctcctca 5580

aggctcttgt tcgtcagcag ctccccgaga agtacaagga gatcttcttc gaccagtcca 5640

agaacggcta cgccggttac attgacggtg gagctagcca ggaggagttc tacaagttca 5700

tcaagccaat ccttgagaag atggatggta ctgaggagct tctcgttaag cttaaccgtg 5760

aggacctcct taggaagcag aggactttcg ataacggctc tatccctcac cagatccacc 5820

ttggtgagct tcacgccatc cttcgtaggc aggaggactt ctaccctttc ctcaaggaca 5880

accgtgagaa gatcgagaag atccttactt tccgtattcc ttactacgtt ggtcctcttg 5940

ctcgtggtaa ctcccgtttc gcttggatga ctaggaagtc cgaggagact atcacccctt 6000

ggaacttcga ggaggttgtt gacaagggtg cttccgccca gtccttcatc gagcgcatga 6060

ccaacttcga caagaacctc cccaacgaga aggtcctccc caagcactcc ctcctctacg 6120

agtacttcac ggtctacaac gagctcacca aggtcaagta cgtcaccgag ggtatgcgca 6180

agcctgcctt cctctccggc gagcagaaga aggctatcgt tgacctcctc ttcaagacca 6240

accgcaaggt caccgtcaag cagctcaagg aggactactt caagaagatc gagtgcttcg 6300

actccgtcga gatcagcggc gttgaggacc gtttcaacgc ttctctcggt acctaccacg 6360

atctcctcaa gatcatcaag gacaaggact tcctcgacaa cgaggagaac gaggacatcc 6420

tcgaggacat cgtcctcact cttactctct tcgaggatag ggagatgatc gaggagaggc 6480

tcaagactta cgctcatctc ttcgatgaca aggttatgaa gcagctcaag cgtcgccgtt 6540

acaccggttg gggtaggctc tcccgcaagc tcatcaacgg tatcagggat aagcagagcg 6600

gcaagactat cctcgacttc ctcaagtctg atggtttcgc taacaggaac ttcatgcagc 6660

tcatccacga tgactctctt accttcaagg aggatattca gaaggctcag gtgtccggtc 6720

agggcgactc tctccacgag cacattgcta accttgctgg ttcccctgct atcaagaagg 6780

gcatccttca gactgttaag gttgtcgatg agcttgtcaa ggttatgggt cgtcacaagc 6840

ctgagaacat cgtcatcgag atggctcgtg agaaccagac tacccagaag ggtcagaaga 6900

actcgaggga gcgcatgaag aggattgagg agggtatcaa ggagcttggt tctcagatcc 6960

ttaaggagca ccctgtcgag aacacccagc tccagaacga gaagctctac ctctactacc 7020

tccagaacgg tagggatatg tacgttgacc aggagctcga catcaacagg ctttctgact 7080

acgacgtcga ccacattgtt cctcagtctt tccttaagga tgactccatc gacaacaagg 7140

tcctcacgag gtccgacaag aacaggggta agtcggacaa cgtcccttcc gaggaggttg 7200

tcaagaagat gaagaactac tggaggcagc ttctcaacgc taagctcatt acccagagga 7260

agttcgacaa cctcacgaag gctgagaggg gtggcctttc cgagcttgac aaggctggtt 7320

tcatcaagag gcagcttgtt gagacgaggc agattaccaa gcacgttgct cagatcctcg 7380

attctaggat gaacaccaag tacgacgaga acgacaagct catccgcgag gtcaaggtga 7440

tcaccctcaa gtccaagctc gtctccgact tccgcaagga cttccagttc tacaaggtcc 7500

gcgagatcaa caactaccac cacgctcacg atgcttacct taacgctgtc gttggtaccg 7560

ctcttatcaa gaagtaccct aagcttgagt ccgagttcgt ctacggtgac tacaaggtct 7620

acgacgttcg taagatgatc gccaagtccg agcaggagat cggcaaggcc accgccaagt 7680

acttcttcta ctccaacatc atgaacttct tcaagaccga gatcaccctc gccaacggcg 7740

agatccgcaa gcgccctctt atcgagacga acggtgagac tggtgagatc gtttgggaca 7800

agggtcgcga cttcgctact gttcgcaagg tcctttctat gcctcaggtt aacatcgtca 7860

agaagaccga ggtccagacc ggtggcttct ccaaggagtc tatccttcca aagagaaact 7920

cggacaagct catcgctagg aagaaggatt gggaccctaa gaagtacggt ggtttcgact 7980

cccctactgt cgcctactcc gtcctcgtgg tcgccaaggt ggagaagggt aagtcgaaga 8040

agctcaagtc cgtcaaggag ctcctcggca tcaccatcat ggagcgctcc tccttcgaga 8100

agaacccgat cgacttcctc gaggccaagg gctacaagga ggtcaagaag gacctcatca 8160

tcaagctccc caagtactct cttttcgagc tcgagaacgg tcgtaagagg atgctggctt 8220

ccgctggtga gctccagaag ggtaacgagc ttgctcttcc ttccaagtac gtgaacttcc 8280

tctacctcgc ctcccactac gagaagctca agggttcccc tgaggataac gagcagaagc 8340

agctcttcgt ggagcagcac aagcactacc tcgacgagat catcgagcag atctccgagt 8400

tctccaagcg cgtcatcctc gctgacgcta acctcgacaa ggtcctctcc gcctacaaca 8460

agcaccgcga caagcccatc cgcgagcagg ccgagaacat catccacctc ttcacgctca 8520

cgaacctcgg cgcccctgct gctttcaagt acttcgacac caccatcgac aggaagcgtt 8580

acacgtccac caaggaggtt ctcgacgcta ctctcatcca ccagtccatc accggtcttt 8640

acgagactcg tatcgacctt tcccagcttg gtggtgataa gcgtcctgct gccaccaaaa 8700

aggccggaca ggctaagaaa aagaagtagg atcctcccga tcgttcaaac atttggcaat 8760

aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 8820

tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgaggtggg 8880

tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 8940

gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgggagcacc 9000

ggtaaggcgc gccgtagtgc tcgagagacc tctgaagtgg ccgattcatt aatgcagctg 9060

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 9120

gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 9180

aattgtgagc ggataacaat ttcacacaag aaacagctat gaccatgatt acgccaagct 9240

atttaggtga cactatagaa tactcaagct atgcatcaag ctcaatgggt ctagtctgta 9300

gatacccatc acactggcga ccgctcgaac atcagtttaa ggtttacacc tataaaagag 9360

agagccgtta tcgtctgttt gtggatgtac agagtgatat tattgacacg ccggggcgac 9420

ggatggtgat ccccctggcc agtgcacgtc tgctgtcaga taaagtctcc cgtgaacttt 9480

acccggtggt gcatatcggg gatgaaagct ggcgcatgat gaccaccgat atggccagtg 9540

tgcctgtctc cgttatcggg gaagaagtgg ctgatctcag ccaccgcgaa aatgacatca 9600

aaaacgccat taacctgatg ttctggggaa tataaatgtc aggcctgaat ggcgaatgga 9660

cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgg 9720

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acgaagttat tgcatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg cagtattaga 9840

tctgataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatga ctgcaggtcg acacccataa 9900

tagctgtttg ccaagcttgg cactggccgt cgtttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 9960

ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 10020

gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgct 10080

agagcagctt gagcttggat cagattgtcg tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt 10140

ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag cgtttattag aataacggat 10200

atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca 10260

gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat ccaacccctc cgctgctata gtgcagtcgg 10320

cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga aaacgacatg tcgcacaagt cctaagttac 10380

gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg gcgttttctt gtcgcgtgtt ttagtcgcat 10440

aaagtagaat acttgcgact agaaccggag acattacgcc atgaacaaga gcgccgccgc 10500

tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac cgacgaccag gacttgacca accaacgggc 10560

cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct gttttccgag aagatcaccg gcaccaggcg 10620

cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga ccacctacgc cctggcgacg ttgtgacagt 10680

gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac ccgcgaccta ctggacattg ccgagcgcat 10740

ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct ggcagagccg tgggccgaca ccaccacgcc 10800

ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat 10860

catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc cgccaaggcc cgaggcgtga agtttggccc 10920

ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg 10980

ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc 11040

acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga 11100

ggacgcattg accgaggccg acgccctggc ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca 11160

agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag 11220

gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc gagccgcccg cgcacgtctc aaccgtgcgg 11280

ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg 11340

gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc 11400

ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg 11460

aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg 11520

caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg 11580

atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg 11640

tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg 11700

tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg 11760

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tggagctggt taagcagcgc attgaggtca cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg 11880

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ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt acgccaaggc aagaccatta ccgagctgct 12300

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ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc ccgaggaatc ggcgtgacgg tcgcaaacca 12540

tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc tggtggagaa gttgaaggcc 12600

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tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggctgg 16419

Claims (1)

1.分离克隆的GGC2基因在调控水稻种子大小、株高、分蘖数和穗型中的应用，其特征在于，所述GGC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

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