CN110699355B

CN110699355B - 长链非编码rna基因rovule及其在调节水稻胚乳发育中的应用

Info

Publication number: CN110699355B
Application number: CN201910695463.7A
Authority: CN
Inventors: 周燕飞; 于洋; 张玉婵; 陈月琴
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: CN110699355A

Abstract

本发明公开了长链非编码RNA基因ROVULE及其在调节水稻胚乳发育中的应用，本发明从水稻中克隆得到长链非编码RNA ROVULE基因，其转录产物参与了水稻授粉后胚乳的发育。通过对ROVULE的生物学功能研究证实，激活其部分片段的表达就足以显著降低其结实率。进一步研究发现长链非编码RNAROVULE并不影响雄蕊和雌蕊的育性，而是影响授粉后胚乳的发育过程。表明长链非编码RNA ROVULE能够负调控水稻授粉后的胚乳发育。所述长链非编码RNA ROVULE可为培育增产水稻提供一种新的策略和遗传资源，具有十分重要的理论意义和应用价值。

Description

长链非编码RNA基因ROVULE及其在调节水稻胚乳发育中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及长链非编码RNA基因ROVULE及其在调节水稻胚乳发育中的应用。

背景技术

胚乳是被子植物特有的组织，是双受精过程中由胚囊中的二倍体中央细胞与1个精细胞结合发育形成的三倍体，是植物遗传研究的重要材料。同时胚乳是种子内营养物质贮藏的最主要场所，为人类提供粮食、营养和能源。胚乳的形成和发育直接影响着作物产量和品质的形成。发掘胚乳发育相关的基因，阐明其功能和调节机制对了解植物种子发育过程具有重要意义，对于指导培育新的增产水稻品种具也同样意义重大。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200nt的非编码RNA分子，广泛参与到调节生物发育的各个方面。在植物中，虽然被系统研究过的lncRNA还很少，但已有功能研究的植物lncRNA大多都参与调节生殖发育过程。这些发现说明植物中lncRNA也同样具有重要的功能。尽管近年来国内外学者已经围绕选育增产水稻做了大量的研究，但是大都局限在蛋白编码基因以及少数的小RNA分子(micro-RNA)对于产量形状的调节，而有关LncRNA在调节胚乳发育影响产量则鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种长链非编码RNA基因ROVULE。

本发明的另一目的在于提供所述长链非编码RNA基因ROVULE在调节水稻胚乳发育中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明研究发现一个仅在生殖阶段的胚珠特异表达，而在其他组织中几乎不表达的长链非编码(lncRNA)，将其命名为ROVULE(expression Restricted to OVULEs)。ROVULE基因位于水稻第8号染色体的正义DNA链上，其基因覆盖从22380590bp到22383406bp的范围，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，长度为2817bp。所述ROVULE基因可以转录出4个变体，分别为：变体1长度为777nt，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；变体2长度为1383nt，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；变体3长度为840nt，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；变体4长度为423nt，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明证实基于ROVULE部分片段原位表达激活植株(ROVULEox-1)会负调控水稻胚乳发育从而导致减产。发现ROVULEox-1中穗型整体减小，一级分枝数目较少，总粒数减少，结实率显著下降，整体呈现减产的表型。进一步发现ROVULEox-1授粉后子房发育明显异常：外部形态较WT明显缓慢且出现了异常发育的情况。内部胚乳的发育也出现了不同程度的异常情况。这些结果表明ROVULE可能参与到了胚乳发育的调控过程。

同时，本发明基于SEQ ID NO：1所示ROVULE的序列，构建了35S启动子驱动的ROVULE变体1和变体2所共有的前两个外显子的超表达载体，以及UBI启动子驱动下ROVULE的RNAi干扰载体，并将超表达载体和RNAi干扰载体通过农杆菌转化到水稻愈伤组织，分别获得超表达ROVULE的转基因水稻植株Ox-ROVULE和ROVULE RNAi干扰的转基因水稻植株。实验结果证实，Ox-ROVULE的表型和ROVULE的T-DNA激活植株类似，出现了育性降低，籽粒变小的减产表型。而RNAi-ROVULE植株则出现了籽粒变大，千粒重增加的增产表型。

本发明结果表明可以通过调控长链非编码RNA ROVULE的表达改变水稻授粉后的胚乳发育从而影响产量相关性状。

本发明提供一种重组超表达载体，所述载体含有ROVULE基因或ROVULE基因中的某一片段。

优选地，所述片段为ROVULE变体1和变体2所共有的前两个外显子的1～640bp序列，其序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供一种干扰表达载体，所述载体含有ROVULE基因或ROVULE基因中的某一片段；优选地，所述片段为ROVULE变体1和变体2所共有的前两个外显子的1～313bp序列，所述片段的序列如SEQ ID NO：7所示。

本发明提供长链非编码RNA ROVULE基因或其转录变体或上述重组超表达载体或干扰表达载体在调节水稻胚乳发育中的应用，具体为ROVULE表达量会影响水稻胚乳的发育，ROVULE过表达负调控水稻胚乳发育，降低水稻产量；ROVULE低表达正调控水稻胚乳发育，提高水稻产量；即可通过提高转录变体1～4中任一所述变体的表达量来负调控水稻胚乳发育或通过降低转录变体1～4中任一所述变体的表达量来正调控水稻胚乳发育。

长链非编码RNA ROVULE基因或其转录变体或上述重组超表达载体或干扰表达载体在水稻育种中的应用。

作为一种优选地可实施方式，可通过构建含ROVULE基因的超表达载体并转化水稻，获得胚乳发育负调控的转基因水稻植株。

作为一种优选地可实施方式，可通过构建ROVULE基因的RNAi干扰载体上转化水稻，获得胚乳发育正调控的转基因水稻植株，得到增产水稻。

作为一种优选地可实施方式，可通过原位激活提高ROVULE基因在水稻中的表达，获得胚乳发育负调控的转基因水稻植株。

作为一种优选地可实施方式，可通过CRISPR敲除来降低ROVULE的表达量从而获得正调控水稻胚乳发育的转基因水稻植株，得到增产水稻。

具体地，所述ROVULE基因的超表达载体为ROVULE变体1和变体2所共有的前两个外显子1～640bp序列的超表达载体，所述序列如SEQ ID NO：6所示。

具体地，所述ROVULE基因的RNAi干扰载体为ROVULE变体1和变体2共有的前两个外显子1～313bp序列的RNAi干扰载体，所述序列如SEQ ID NO：7所示。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种长链非编码RNA基因ROVULE，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，可以转录出4个变体，变体1～4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～5所示。本发明发现，激活、提高ROVULE表达会负调节胚乳的发育导致减产，而干扰、降低ROVULE的表达则会正调节胚乳的发育导致增产，所述长链非编码RNA基因ROVULE对于培育增产水稻等重要粮食作物具有重要的应用价值。

附图说明

图1为ROVULE基因座位及各亚型表达量分析。(A)ROVULE基因座位转录出4个变体，T-DNA插入突变体插入位置如图所示；(B)ROVULE各变体表达量为变体1表达量最高；(C)ROVULE的表达量在授粉后呈现时间梯度下降的趋势；(D)ROVULE变体1和2的前两个外显子在突变体中表达上调。Q-RT PCR以水稻基因ACTIN2用作内参。

图2为ROVULE突变体育性降低。ROVULE突变体整体植株偏小(A)，穗型变小，穗长变短，一级分枝、二级分支减少(B)，育性明显降低(D)，一部分种子授粉后发育异常(C)，(E)ROVULE突变体花粉粒I2-KI染色正常，(F)ROVULE突变体花粉粒在柱头上萌发正常，花粉管能够顺利地生长到胚囊内部。

图3为ROVULE突变体授粉后发育异常。和WT相比，ROVULE突变体授粉后发育明显异常：授粉前，WT与ROVULE突变体子房无明显差别。授粉后一天，WT柱头开始退化，子房逐渐伸长，而ROVULE突变体柱头并未出现退化的迹象，资方的伸长也并不明显。授粉后第二天，WT柱头进一步退化，子房显著伸长，而ROVULE突变体此时柱头才开始已退化，子房开始伸长发育。授粉后第三、五、七天，这一差异更加明显，最终WT发育为正常的种子形态，而ROVULE突变体则发育为头小肚子大的啤酒肚形状。

图4为ROVULE突变体授粉后胚乳发育异常。(A)授粉后一天，WT中胚乳细胞核开始分裂并且均匀地分布在胚囊的内壁，而ROVULE突变体中授粉后的胚乳细胞核还未见开始分裂。(B)授粉后2天，WT中胚乳细胞核进一步分裂，且均匀密集地分布在真个胚囊的四周，准备开始进行细胞化的过程，而ROVULE突变体中胚乳细胞核明显偏少，远未达到开始细胞化的细胞核密度。(C)授粉后第三天，WT中胚乳细胞核已经通过细胞化过程形成了3-4层细胞，而ROVULE突变体中还未开始进行细胞化过程，并且胚乳细胞核的分布也出现了异常的现象。

图5为ROVULE突变体授粉后胚乳细胞核分布异常。(A)授粉后1天，WT中胚乳细胞核均匀地分布在胚囊的内壁，而ROVULE突变体中，胚乳细胞核分布出现了异常，胚乳细胞核并不是均匀地分布在胚囊的内壁，而是在胚囊的上部分留下了一部分空白。授粉后2天，这一异常更加显著，WT中胚乳细胞核均匀地分布在胚囊的内壁，而ROVULE突变体中几乎有一半的胚囊部分没有胚乳细胞核。(C)授粉后第三天，WT细胞化正常形成3层细胞，而ROVULE突变体迟迟未进入细胞化过程。

图6为授粉后胚乳横切。(A)授粉后二天，WT内胚乳细胞核均匀地分布在胚囊内壁，而在ROVULE突变体中，胚乳细胞核明显减少，且分布不规则。(B)授粉后三天，WT细胞化过程正常进行到形成2层细胞，而ROVULE突变体中还未进行细胞化过程或者细胞化的过程出现异常。

图7为ROVULE前两个外显子过表达植株具有和ROVULE T-DNA激活植株负调节胚乳发育相似的表型。(A)ROVULE过表达整体植株比WT稍高。(B)ROVULE过表达植株穗比WT小，一级分枝书减少。(C)结实率显著下降。(D)ROVULE过表达植株种子粒长、粒宽、粒厚都比WT小，呈现负调节产量形状的表型。(E)ROVULE过表达植株子房授粉后胚乳发育异常，而胚的发育不受影响，能够正常萌发。

图8为ROVULE RNAi干扰植株正向调节胚乳发育，具有增产的表型。(A)ROVULERNAi干扰植株比WT整体大一点。(B)ROVULE RNAi干扰植株粒长比WT稍长。(C)ROVULE RNAi干扰植株粒宽比WT稍宽。(D)ROVULE的RNAi干扰效果。(E)ROVULE RNAi干扰植株千粒重统计，ROVULE RNAi干扰植株具有增产的效果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。所用引物序列均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

实施例1 ROVULE原位激活植株的获得与功能鉴定

本发明研究发现了在其他组织中几乎不表达，胚珠特异表达的lncRNA ROVULE(expression Restricted to OVULEs)，其基因位于水稻第8号染色体的正义DNA链上，其基因覆盖从22380590bp到22383406bp的范围，其序列如SEQ ID NO：1所示，长度为2817bp。所述ROVULE基因可以转录出4个变体，分别为：变体1长度为777nt，序列如SEQ ID NO：2所示；变体2长度为1383nt，序列如SEQ ID NO：3所示；变体3长度为840nt，序列如SEQ ID NO：4所示；变体4长度为423nt，序列如SEQ ID NO：5所示(图1A)。

以水稻基因ACTIN2为内参，检测ROVULE变体1～4的表达量，所述ROVULE变体1～4引物如下所示：

q-ROVULE变体1-F：5’-AGTCCCTTACTCTTCCCTTGTCC-3’

q-ROVULE变体1-R：5’-TGTTACCTACTTATTCACTAATGGCTTG-3’

q-ROVULE变体2-F：5’-CCAAAGCCCAAGAAACCGA-3’

q-ROVULE变体2-R：5’-AACACCATAACCAAAGCGAACTC-3’

q-ROVULE变体3-F：5’-TAGCAGTACGTGCGGCTGTC-3’

q-ROVULE变体3-R：5’-TCAATTCTGAAATGCCTGATGTT-3’

q-ROVULE变体3/4-F：5’-GCAATGGCAATCAGTAGGTAGAGA-3’

q-ROVULE变体3/4-R：5’-AATCCGTTCAAGTCCCTGTAGC-3’

正常生理情况下，ROVULE 4个变体中，变体1表达量最高(图1B)。通过搜索突变体库，发现有一个突变体的T-DAN插入位点位于ROVULE内部(图1A)，且该T-DNA插入导致ROVULE前部分片段表达量上调(图D)，将该ROVULE T-DNA突变体命名为原位表达激活植株ROVULEox-1。

实施例2 ROVULE激活突变体植株胚乳发育相关表型的分析

为了观察水稻胚乳发育以及产量相关性状，户外种植突变体ROVULEox-1和野生型水稻。待水稻生长到开花期，每天中午标记刚好盛开的小花。每隔一段时间取下相应的材料固定并进行后续的实验。

1、为了观察花粉粒的育性，取成熟的单胞期花粉粒，I₂-IK染色后显微镜下拍照，结果如图2所示，ROVULE突变体育性降低，表现出穗型整体减小，一级分枝数目较少，总粒数减少，结实率显著下降，整体呈现减产的表型。具体表现为：ROVULE突变体整体植株偏小(图2A)；穗型变小，穗长变短，一级分枝、二级分支减少(图2B)；育性明显降低(图2D)；一部分种子授粉后发育异常(图2C)，(图2E)；ROVULE突变体花粉粒I2-KI染色正常。

2、为了观察授粉后花粉管的萌发情况，取授粉后2小时的样品，剥离出雌蕊，抽真空后固定5小时。用水洗去固定液后于10M的NaOH溶液中56摄氏度水浴10min，洗去NaOH溶液，0.1％苯胺蓝避光染色8～12小时后在荧光显微镜下观察拍照，结果如图2F所示，ROVULE突变体与野生型无差异，花粉粒在柱头上萌发正常，花粉管能够顺利地生长到胚囊内部，表明长链非编码RNAROVULE并不影响雄蕊和雌蕊的育性。

3、为了观察授粉后子房外部形态的发育情况，取标记好的样品，每隔相应的时间取样并于解剖镜下拍照，结果图如3所示，发现ROVULEox-1授粉后子房发育明显异常：外部形态较WT明显缓慢且出现了异常发育的情况；具体为：授粉前，WT与ROVULE突变体子房无明显差别。授粉后一天，WT柱头开始退化，子房逐渐伸长，而ROVULE突变体柱头并未出现退化的迹象，子房的伸长也并不明显。授粉后第二天，WT柱头进一步退化，子房显著伸长，而ROVULE突变体此时柱头才开始已退化，子房开始伸长发育。授粉后第三、五、七天，这一差异更加明显，最终WT发育为正常的种子形态，而ROVULE突变体则发育为头小肚子大的啤酒肚形状。

4、为了观察授粉后子房内部结构的发育情况，取标记好的样品，固定液固定后进行后续的实验：

(1)对于曙红染色，固定后的样品用50％酒精洗，70％酒精4度保存。70％酒精中剥离出子房并梯度复水(50％酒精→30％酒精→纯水)，2％硫酸铝钾预处理30min(使染料更容易进入子房内部)，10mg/L的曙红(eosin B，溶解于4％蔗糖溶液)室温染色16h。2％硫酸铝钾再处理30min(移去附着在子房壁上面的染料)。纯水洗三遍后梯度脱水(30％酒精→50％酒精→60％酒精→70％酒精→80％酒精→90％酒精→100％酒精三遍，每步1h)，酒精水杨酸甲酯梯度透明(4:1→3:1→2:1→1:1→1:2→1:3→1:4，每步4h)，最后用纯水杨酸甲酯透明至少1d。后在共聚焦下观察，激发波长543nm，发射波长550～630nm。结果如图4所示，ROVULE突变体授粉后胚乳发育异常；具体表现为：授粉后一天，WT中胚乳细胞核开始分裂并且均匀地分布在胚囊的内壁，而ROVULE突变体中授粉后的胚乳细胞核还未见开始分裂(图4A)；授粉后2天，WT中胚乳细胞核进一步分裂，且均匀密集地分布在真个胚囊的四周，准备开始进行细胞化的过程，而ROVULE突变体中胚乳细胞核明显偏少，远未达到开始细胞化的细胞核密度(图4B)；授粉后第三天，WT中胚乳细胞核已经通过细胞化过程形成了3～4层细胞，而ROVULE突变体中还未开始进行细胞化过程，并且胚乳细胞核的分布也出现了异常的现象(图4C)。

(2)而对于PI染色，固定后的样品用70％→50％→30％各30min乙醇复水。PBS洗两次，每次30min。RNase A(100μg/ml)37°处理过夜。PI(5μg/ml)4°避光染色过夜，PBS洗三次，每次3h。30％→50％→70％→80％→90％→100％乙醇各30min梯度脱水，100％乙醇30min洗两次。甲醇-水杨酸甲酯梯度透明(甲醇：水杨酸甲酯2:1→1:1→1:2各1h)，纯水杨酸甲酯洗三次，每次1h，纯水杨酸甲酯4°过夜。结果如图5所示，ROVULE突变体授粉后胚乳细胞核分布异常；具体表现为：授粉后1天，WT中胚乳细胞核均匀地分布在胚囊的内壁，而ROVULE突变体中，胚乳细胞核分布出现了异常，胚乳细胞核并不是均匀地分布在胚囊的内壁，而是在胚囊的上部分留下了一部分空白(图5A)；授粉后2天，这一异常更加显著，WT中胚乳细胞核均匀地分布在胚囊的内壁，而而ROVULE突变体中几乎有一半的胚囊部分没有胚乳细胞核(图5B)；授粉后第三天，WT细胞化正常形成3层细胞，而ROVULE突变体迟迟未进入细胞化过程(图5C)。

(3)对于石蜡切片，固定后的样品室温先用50％乙醇，60％乙醇，75％乙醇，80％乙醇，95％乙醇，100％乙醇，各1h；100％乙醇1h脱水。再用75％乙醇+25％TO，50％乙醇+50％TO，25％乙醇+75％TO，100％TO，各1h；100％TO过夜。将放入样品的包埋盒依次转入25％石蜡+75％TO，50％石蜡+50％TO，75％石蜡+25％TO，每个过程3～5h。后转到纯石蜡4缸，3D换一个缸。浸蜡完成后包埋样品，并把样品块切成单个样品一块。粘台后，调整好刀片与样品的角度，以10μm的厚度切片。切片展片后用载玻片捞片并过夜烘干。切片经溶蜡后复水，1％甲苯胺兰溶液染色30s，后脱水并封片，用正置显微镜拍照。结果如图6所示，授粉后二天，WT内胚乳细胞核均匀地分布在胚囊内壁，而在ROVULE突变体中，胚乳细胞核明显减少，且分布不规则(图6A)；授粉后三天，WT细胞化过程正常进行到形成2层细胞，而ROVULE突变体中还未进行细胞化过程或者细胞化的过程出现异常(图6B)。

上述这些结果表明长链非编码RNA ROVULE并不影响雄蕊和雌蕊的育性，而是影响授粉后胚乳的发育过程。

实施例3 ROVULE超表达植株的构建、转化及相关表型分析

采用中花11号野生型水稻穗总RNA反转录出cDNA并扩增出ROVULE变体1和变体2共有的前两个外显子，全长DNA序列640bp，序列如SEQ ID NO：6所示；扩增所使用的引物为：

F：5’-GAGAACACGGGGGACTCTAGCCGCGCACGCAGAAAA-3’，

R：5’-TCACCTGTAATTCACACGTGCTCGAGGAAGCCGACCTCC-3’；

1390 35S启动子载体酶切位点使用BamHI和EcoRI，使用同源重组的方法将ROVULE前两个外显子重组到载体上。采用1390 35S启动子引导的ROVULE超表达载体；用农杆菌介导的愈伤组织遗传转化方法做转基因处理，将相应载体转入水稻中；转化体用潮霉素(Hyg)筛选，获得ROVULE超表达的转基因水稻植株Ox-ROVULE。

为了观察水稻胚乳发育以及产量相关性状，户外种植水稻。水稻的准备：每行之间的距离25cm，株距20cm，待水稻水稻灌浆完成后，统计产量相关性状(结实率、粒长、粒宽、千粒重)。结果如图7所示，ROVULE前两个外显子过表达植株Ox-ROVULE具有和ROVULE T-DNA激活植株负调节胚乳发育相似的表型，出现了育性降低，籽粒变小的减产表型；具体表现为：ROVULE过表达整体植株比WT稍高(图7A)；ROVULE过表达植株穗比WT小，一级分枝书减少(图7B)；结实率显著下降(图7C)；ROVULE过表达植株种子粒长、粒宽、粒厚都比WT小，呈现负调节产量形状的表型(图7D)；ROVULE过表达植株子房授粉后胚乳发育异常，而胚的发育不受影响，能够正常萌发(图7E)。

实施例4 ROVULE RNAi干扰植株的构建、转化及相关表型分析

采用中花11号野生型水稻穗总RNA反转录出cDNA并扩增出ROVULE变体1和变体2共有的前两个外显子1-313bp序列，序列如SEQ ID NO：7所示；扩增所使用的引物如下所示：

S-F：5’-CGGGATCCCCGCGCACGCAGAAAA-3’，

S-R：5’-CGAGCTCCCACGTACGTACGTACGTACGTA-3’，

A-F：5’-CGACGCGTCCGCGCACGCAGAAAA-3’，

A-R：5’-TGCACTGCAGCCACGTACGTACGTACGTACGTA-3’；

先使用BamHI和SacI酶切RNAi干扰载体pRNAi-Ubi，正向连接BamHI和SacI酶切后的ROVULE 1-296bp序列，挑取阳性克隆子并扩陪提取质粒。然后用PstI和MluI酶切载体，反向链接用PstI和MluI酶切后的ROVULE 1-296bp的序列，菌落PCR挑选阳性克隆并提取质粒。用农杆菌介导的愈伤组织遗传转化方法做转基因处理，将相应载体转入水稻中；转化体用潮霉素(Hyg)筛选，获得ROVULE RNAi干扰的转基因水稻植株。

为了观察水稻胚乳发育以及产量相关性状，户外种植水稻。水稻的准备：每行之间的距离25cm，株距20cm，待水稻灌浆完成后，统计产量相关性状(结实率、粒长、粒宽、千粒重)。结果如图8所示，ROVULE RNAi干扰植株正向调节胚乳发育，具有增产的表型；具体表现为：ROVULE RNAi干扰植株比WT整体大一点(图8A)；ROVULE RNAi干扰植株粒长比WT稍长(图8B)；ROVULE RNAi干扰植株粒宽比WT稍宽(图8C)；ROVULE的RNAi干扰效果(图8D)；ROVULERNAi干扰植株千粒重统计，ROVULE RNAi干扰植株具有增产的效果(图8E)。

本发明上述表明长链非编码RNA ROVULE能够负调控水稻授粉后的胚乳发育，可为培育增产水稻提供一种新的策略和遗传资源，具有十分重要的理论意义和应用价值。

序列表

<110> 中山大学

<120> 长链非编码RNA基因ROVULE及其在调节水稻胚乳发育中的应用

<141> 2019-07-30

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2817

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

ccgcgcacgc agaaaaaccc acgcccaccg cgcgcccgcg agagagtctg cggcgcccaa 60

ccccgagcca cacacaccac cacaccagag cagagcagag tgggcgtacg caacaacgtg 120

cactcgcagc gcctcgcctt ccgcgtcctc ctcccgtgcg cgcgcgcgcg atgcgccact 180

gcgccagcat ttaaaccccc aacccaacgc cgcgcgcgtc gccaccacca tccacaccat 240

tcgccgagcc gacgcccccg cccccgcccc ctgccggtgg cgagcgtgcg tacgtacgta 300

cgtacgtacg tggccctgca gccgagctca ccgtagcgcg ggccgtcggt cgccgctctc 360

ctcgcccacc ttagctacgc agctgtagcc tgcagggtag ctagctctct cgctcgctcg 420

ctcgcggcgc tgagggtggt tgtcttgcgt ctccggtgga taagttgggt tgagatgggg 480

gaggcgccga ggcccaagtc gccgccgagg tacccggacc tgtgcggccg gcggcggctg 540

cagctggaga tgcagatcct caaccgggag gtcggcttcc tcgaggtgac ctcacttcac 600

ttccccgtca tgtcacctcg ctttctttca cagtgatgaa gaaaagcgtg catttttttt 660

tgttcttcct atggagtgga gagacagaga gagagagaga gagagagaga ggaaatctcc 720

ggggaaaaaa gttgatgtgg agagctcatc ggtttggggt ttcgcgacgg aagcgaggcg 780

agagctcgct ctgtcgcgac aaccgatgcg cgacaggctc ccatgttgta ctagcagtac 840

gtgcggctgt catggctgcc cctactgccg tcttcttgca gagagaacaa gaacaatggg 900

cagccatgaa ccaatgccat tttacttctg gagtagtagt agtagtagag ttctactgca 960

atatgtattt tttccccctg caacatcagg catttcagaa ttgcaaagca agtgcagtat 1020

aggagtagta cttccgaagt ctcctcatta cattgcatca tgcgtaaagt ctgatgaatt 1080

ctggaactat aggggtatgg gggagtacct gcaattgata attaaaaata aaaagaactc 1140

tactttcaga tttctgcttc tcttgagcgt gacatcacct ggcaatggca atcagtaggt 1200

agagacgctg ctgctgctgc tgcgcattgc tcgtgttctt tactgcttcc attcatggca 1260

catggagcag gactgtgtat aggtctgtgg aagccatgtg catgtgcctc ggcctgactg 1320

ggggctccct ttttgcagca agagctacag ggacttgaac ggattcagcc ggtctcgagg 1380

tgttgcaaag agtatgcgcc ctatcctctc ctttctgctt tcctcattag cctcgcttct 1440

ctctgcaaat cttgtcgccg gcagtgctgg tgtttcgctc ggatgggcaa ctagcaagtt 1500

cttgttcatt ctagtgatct agtctcagcc tttcaggctc aaatgccatt taatcacagc 1560

tactctgaat gtcagtagtg tttgagtcat tagtgttgtt gtttctttga tttgtagtgg 1620

tcttattgat aaacaagaca attctttttc cgaggagagc actaaaaatt agaatttttt 1680

ccattgtgtt ctttttattt gctgaatcct gacacattcc tcaaacttat tttttttttg 1740

aaaaaaaaga aagtggccca catgaattgc gacatttact atacttttcg attttcttga 1800

atgccaataa taatctctgc tagtaacttc tgacctggtg gtccaacagt caacatgtga 1860

actgttcatg catgacctac atttcaattt tgctcctttt ggaactgtac tatgtaacgt 1920

tcaaatgcca ttgtcgatta caaagatact aatgctatat tatcacattt ggcagtgtca 1980

acgaatttgt tggtgcaaag tcggatccgc ttataccaat gtatgaatat attgatttat 2040

gttttgcatt tcagagtttc ttttttcaaa gtttgctgat cagtgttctc cctgtgcctt 2100

atttattcca gaaacaaaag gaaacacaga tcttgcagcc tctatcggtg gatcaggtcc 2160

cttactcttc ccttgtccat gcttttgggt gtacggataa aaacattcta aaagctttgc 2220

tgtttaaacc gagggaatat attgttgttt ataatttgag agtttattaa attcaagcca 2280

ttagtgaata agtaggtaac actcataggg caaagtatga caatatgctg gtttcagttt 2340

gttgctgaat aaactagttc aacagtcaac actgttaaga ctcatactcc tacttgtttc 2400

tgttcctgtc aaatgcccga actgaatttc accttattag cccattttat caaatgctca 2460

ctcaatttgt agaacctcaa tacaccaaca aagtgatttg tcagaaatgt cacactttaa 2520

tactacatga taactcggag tactgccttc ttttgatgaa aaaagtcagg atatctgaca 2580

tcagttatgg tggcatcaaa gcaattttcg cagtcttttt gtggagccaa tactgttccc 2640

agaactgcag cgctatttac acgacaaata ccgccttttt tttcgttctg aacttcttgc 2700

aaatgacatg ctgtttcaac gctcccttgg aaagactaaa agatcttaaa cctgttgttt 2760

tttatcagat cgaaattgtg caactgcttg ttatgcctct gctgttggtg ccggtgc 2817

<210> 2

<211> 777

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

ccgcgcacgc agaaaaaccc acgcccaccg cgcgcccgcg agagagtctg cggcgcccaa 60

ccccgagcca cacacaccac cacaccagag cagagcagag tgggcgtacg caacaacgtg 120

cactcgcagc gcctcgcctt ccgcgtcctc ctcccgtgcg cgcgcgcgcg atgcgccact 180

gcgccagcat ttaaaccccc aacccaacgc cgcgcgcgtc gccaccacca tccacaccat 240

tcgccgagcc gacgcccccg cccccgcccc ctgccggtgg cgagcgtgcg tacgtacgta 300

cgtacgtacg tggccctgca gccgagctca ccgtagcgcg ggccgtcggt cgccgctctc 360

ctcgcccacc ttagctacgc agctgtagcc tgcagggtag ctagctctct cgctcgctcg 420

ctcgcggcgc tgagggtggt tgtcttgcgt ctccggtgga taagttgggt tgagatgggg 480

gaggcgccga ggcccaagtc gccgccgagg tacccggacc tgtgcggccg gcggcggctg 540

cagctggaga tgcagatcct caaccgggag gtcggcttcc tcgagcaaga gctacaggga 600

cttgaacgga ttcagccggt ctcgaggtgt tgcaaagatg tcaacgaatt tgttggtgca 660

aagtcggatc cgcttatacc aataaacaaa aggaaacaca gatcttgcag cctctatcgg 720

tggatcagat cgaaattgtg caactgcttg ttatgcctct gctgttggtg ccggtgc 777

<210> 3

<211> 1383

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

ccgcgcacgc agaaaaaccc acgcccaccg cgcgcccgcg agagagtctg cggcgcccaa 60

ccccgagcca cacacaccac cacaccagag cagagcagag tgggcgtacg caacaacgtg 120

cactcgcagc gcctcgcctt ccgcgtcctc ctcccgtgcg cgcgcgcgcg atgcgccact 180

gcgccagcat ttaaaccccc aacccaacgc cgcgcgcgtc gccaccacca tccacaccat 240

tcgccgagcc gacgcccccg cccccgcccc ctgccggtgg cgagcgtgcg tacgtacgta 300

cgtacgtacg tggccctgca gccgagctca ccgtagcgcg ggccgtcggt cgccgctctc 360

ctcgcccacc ttagctacgc agctgtagcc tgcagggtag ctagctctct cgctcgctcg 420

ctcgcggcgc tgagggtggt tgtcttgcgt ctccggtgga taagttgggt tgagatgggg 480

gaggcgccga ggcccaagtc gccgccgagg tacccggacc tgtgcggccg gcggcggctg 540

cagctggaga tgcagatcct caaccgggag gtcggcttcc tcgagcaaga gctacaggga 600

cttgaacgga ttcagccggt ctcgaggtgt tgcaaagatg tcaacgaatt tgttggtgca 660

aagtcggatc cgcttatacc aatgtatgaa tatattgatt tatgttttgc atttcagagt 720

ttcttttttc aaagtttgct gatcagtgtt ctccctgtgc cttatttatt ccagaaacaa 780

aaggaaacac agatcttgca gcctctatcg gtggatcagg tcccttactc ttcccttgtc 840

catgcttttg ggtgtacgga taaaaacatt ctaaaagctt tgctgtttaa accgagggaa 900

tatattgttg tttataattt gagagtttat taaattcaag ccattagtga ataagtaggt 960

aacactcata gggcaaagta tgacaatatg ctggtttcag tttgttgctg aataaactag 1020

ttcaacagtc aacactgtta agactcatac tcctacttgt ttctgttcct gtcaaatgcc 1080

cgaactgaat ttcaccttat tagcccattt tatcaaatgc tcactcaatt tgtagaacct 1140

caatacacca acaaagtgat ttgtcagaaa tgtcacactt taatactaca tgataactcg 1200

gagtactgcc ttcttttgat gaaaaaagtc aggatatctg acatcagtta tggtggcatc 1260

aaagcaattt tcgcagtctt tttgtggagc caatactgtt cccagaactg cagcgctatt 1320

tacacgacaa ataccgcctt ttttttcgtt ctgaacttct tgcaaatgac atgctgtttc 1380

aac 1383

<210> 4

<211> 840

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

cttcttgcag agagaacaag aacaatgggc agccatgaac caatgccatt ttacttctgg 60

agtagtagta gtagtagagt tctactgcaa tatgtatttt ttccccctgc aacatcaggc 120

atttcagaat tgcaaagcaa gtgcagtata ggagtagtac ttccgaagtc tcctcattac 180

attgcatcat gcgtaaagtc tgatgaattc tggaactata ggggtatggg ggagtacctg 240

caattgataa ttaaaaataa aaagaactct actttcagat ttctgcttct cttgagcgtg 300

acatcacctg gcaatggcaa tcagtaggta gagacgctgc tgctgctgct gcgcattgct 360

cgtgttcttt actgcttcca ttcatggcac atggagcagg actgtgtata ggtctgtgga 420

agccatgtgc atgtgcctcg gcctgactgg gggctccctt tttgcagcaa gagctacagg 480

gacttgaacg gattcagccg gtctcgaggt gttgcaaaga gtatgcgccc tatcctctcc 540

tttctgcttt cctcattagc ctcgcttctc tctgcaaatc ttgtcgccgg cagtgctggt 600

gtttcgctcg gatgggcaac tagcaagttc ttgttcattc tagtgatcta gtctcagcct 660

ttcaggctca aatgccattt aatcacagct actctgaatg tcagtagtgt ttgagtcatt 720

agtgttgttg tttctttgat ttgtagtggt cttattgata aacaagacaa ttctttttcc 780

gaggagagca ctaaaaatta gaattttttc cattgtgttc tttttatttg ctgaatcctg 840

<210> 5

<211> 423

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 5

ggaagccatg tgcatgtgcc tcggcctgac tgggggctcc ctttttgcag caagagctac 60

agggacttga acggattcag ccggtctcga ggtgttgcaa agagtatgcg ccctatcctc 120

tcctttctgc tttcctcatt agcctcgctt ctctctgcaa atcttgtcgc cggcagtgct 180

ggtgtttcgc tcggatgggc aactagcaag ttcttgttca ttctagtgat ctagtctcag 240

cctttcaggc tcaaatgcca tttaatcaca gctactctga atgtcagtag tgtttgagtc 300

attagtgttg ttgtttcttt gatttgtagt ggtcttattg ataaacaaga caattctttt 360

tccgaggaga gcactaaaaa ttagaatttt ttccattgtg ttctttttat ttgctgaatc 420

ctg 423

<210> 6

<211> 640

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 6

ccgcgcacgc agaaaaaccc acgcccaccg cgcgcccgcg agagagtctg cggcgcccaa 60

ccccgagcca cacacaccac cacaccagag cagagcagag tgggcgtacg caacaacgtg 120

cactcgcagc gcctcgcctt ccgcgtcctc ctcccgtgcg cgcgcgcgcg atgcgccact 180

gcgccagcat ttaaaccccc aacccaacgc cgcgcgcgtc gccaccacca tccacaccat 240

tcgccgagcc gacgcccccg cccccgcccc ctgccggtgg cgagcgtgcg tacgtacgta 300

cgtacgtacg tggccctgca gccgagctca ccgtagcgcg ggccgtcggt cgccgctctc 360

ctcgcccacc ttagctacgc agctgtagcc tgcagggtag ctagctctct cgctcgctcg 420

ctcgcggcgc tgagggtggt tgtcttgcgt ctccggtgga taagttgggt tgagatgggg 480

gaggcgccga ggcccaagtc gccgccgagg tacccggacc tgtgcggccg gcggcggctg 540

cagctggaga tgcagatcct caaccgggag gtcggcttcc tcgagcaaga gctacaggga 600

cttgaacgga ttcagccggt ctcgaggtgt tgcaaagatg 640

<210> 7

<211> 313

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 7

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ccccgagcca cacacaccac cacaccagag cagagcagag tgggcgtacg caacaacgtg 120

cactcgcagc gcctcgcctt ccgcgtcctc ctcccgtgcg cgcgcgcgcg atgcgccact 180

gcgccagcat ttaaaccccc aacccaacgc cgcgcgcgtc gccaccacca tccacaccat 240

tcgccgagcc gacgcccccg cccccgcccc ctgccggtgg cgagcgtgcg tacgtacgta 300

cgtacgtacg tgg 313

Claims

1. ROVULE基因的超表达载体在制备负调节水稻胚乳发育的试剂中的应用，其特征在于，所述ROVULE基因的超表达载体含有ROVULE变体1和变体2所共有的序列如SEQ ID NO：6所示的外显子。

2. ROVULE基因的RNAi干扰载体在制备正调节水稻胚乳发育的试剂中的应用，其特征在于，所述ROVULE基因的RNAi干扰载体含有ROVULE变体1和变体2共有的序列如SEQ ID NO：7所示的外显子。

3. ROVULE基因的超表达载体在培育胚乳发育负调控的转基因水稻植株中的应用，其特征在于，构建含ROVULE基因的超表达载体并转化水稻，获得胚乳发育负调控的转基因水稻植株；所述ROVULE基因的超表达载体含有ROVULE变体1和变体2所共有的序列如SEQ IDNO：6所示的外显子。

4. ROVULE基因的RNAi干扰载体在培育胚乳发育正调控的转基因水稻植株中的应用，其特征在于，构建ROVULE基因的RNAi干扰载体上转化水稻，获得胚乳发育正调控的转基因水稻植株；所述ROVULE基因的RNAi干扰载体含有ROVULE变体1和变体2共有的序列如SEQ IDNO：7所示的外显子。