CN113699180B - 基因BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成以及生产转基因植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成以及转基因植物培育中的应用。本发明首次提供了基因BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成中的应用，所述基因BnaCYP705a12的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中油菜素内酯生物合成基因BnaCYP705a12、其编码产物BnaCYP705a12蛋白、含有油菜素内酯生物合成BnaCYP705a12基因片段的表达载体可以用于生产油菜素内酯生物合成缺陷转基因作物，以获得新的种质资源，具有广阔的应用前景。

Description

基因BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成以及生产转基因植物中的应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及基因BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成以及生产转基因植物中的应用。

背景技术

油菜是世界上最重要的油料作物之一，为人类提供高优质的食用油，可以作为富含高蛋白的动物饲料和工业原材料。株型育种在农作物产量提高中，发挥了重要的作用。油菜株型研究还比较薄弱，需进一步挖掘理想株型种质资源和相关基因，深化油菜株型研究。

油菜素内酯(brassinosteroids，BR)是植物体内广泛存在的一类甾醇类激素，主要通过促进细胞的伸长、分裂和细胞壁的松弛，从而进一步调控植株的伸长，影响植株株高。BR的生物合成途径受阻会导致植株出现矮化表型。在BR生物合成过程中，许多参与BR生物合成过程的合成酶异常，均会造成植株矮化表型，对其喷施外源BR激素会恢复部分表型。如编码细胞色素P450(CYP90)蛋白的AtCPD基因发生突变，引起BR合成酶(CPD)缺失，从而导致植株矮化，对其喷施外源BR激素或者过表达AtCPD基因，其表型得到恢复。拟南芥dwf4(CYP90B1)、水稻dwarf2(CYP90D)和dwarf11(CYP724B1)突变体均是由于基因发生突变，导致BR合成酶的功能丧失，从而引起植株出现矮化的表型，对突变体喷施外源BR激素可以恢复部分表型。BR-deficient dwarf1(Brd1)基因是编码BR生物合成的最后一步催化酶(BR-C6氧化酶)，该基因发生突变后会导致植株矮化。如水稻brd1突变体表现出叶鞘缩短、叶片皱缩、节间短、分蘖少等表型，对其喷施外源BR激素后，该突变体表型可以得到恢复。玉米Brd1由于基因发生突变，导致植株表现出矮化的表型。DET2(De-etiolated2)是BR生物合成过程中的关键基因，拟南芥突变体det2和玉米突变体na1都是由于DET2基因发生了变异，导致了基因功能的缺失，从而引起植株表现出矮化表型。BR缺陷型突变体bul1-1由于BUL1基因的突变，导致其编码的Δ7-甾醇-C-脱氢酶功能缺失，影响了植株体内油菜素内酯的含量，从而抑制了细胞的伸长，造成植株矮化的表型。

目前已经公开了参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关基因BnaC08-CYP705a12，但是叶绿素的合成和油菜素内酯的合成方式是完全不同的，其作用也完全不同。目前在油菜中还没有关于油菜素内酯相关突变体的报道，因此，可以通过转基因工程手段获得油菜素内酯缺陷转基因油菜。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供基因BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成中的应用，首次明确了基因BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成中的作用。

本发明还提供基因BnaCYP705a12编码的蛋白、载体、宿主菌在油菜素内酯生物合成以及转基因转基因植物培育中的应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述基因BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成中的应用，所述基因BnaCYP705a12的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述基因BnaCYP705a12编码的蛋白BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成中的应用，所述蛋白质BnaCYP705a12的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述基因BnaCYP705a12的基因片段在油菜素内酯生物合成中的应用，所述基因BnaCYP705a12的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述含有基因BnaCYP705a12基因片段的RNAi表达载体在油菜素内酯生物合成中的应用。

本发明所述含有基因BnaCYP705a12基因片段的RNAi表达载体的构建方法，包括如下步骤：

设计引物，PCR扩增BnaCYP705a12基因片段，将扩增的基因片段连接到pEasyBlunt Simple载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞，卡那霉素筛选获得入门克隆，提取质粒，获得含BnaCYP705a12基因片段的pEasy Blunt Simple载体；将含BnaCYP705a12基因的pEasy Blunt Simple载体和pFGC5941载体通过酶切-连接方式重组，转化至大肠杆菌感受态细胞，经卡那霉素筛选得到成功重组的RNAi-BnaCYP705a12载体。

本发明所述含有基因BnaCYP705a12基因片段或者RNAi表达载体的宿主菌在油菜素内酯生物合成中的应用。

其中，所述宿主菌以农杆菌EHA105为出发菌株。

本发明所述基因BnaCYP705a12或者含有基因BnaCYP705a12基因片段的RNAi表达载体在产生油菜素内酯生物合成缺陷转基因植物中的应用。

其中，所述基因BnaCYP705a12或者含有基因BnaCYP705a12基因片段的RNAi表达载体在转化双子叶植物产生油菜素内酯生物合成缺陷转基因植物中的应用。

进一步地，所述双子叶植物包括油菜、拟南芥、烟草等双子叶植物。

其中，所述培育油菜素内酯生物合成缺陷转基因植物的过程，包括如下步骤：

(1)农杆菌介导的转化：将RNAi-BnaCYP705a12质粒转化到农杆菌中，筛选阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆接种到YEP液体培养基中培养至OD600＝0.8-1.2，离心后用侵染培养基重悬至OD600＝0.6-1.0，将宿主植物花苞浸没在侵染培养基中侵染后继续培养直至收获种子；

(2)转基因株系的筛选：挑选收获的种子进行种植，经过加代，定量qRT-PCR验证，最后得到纯合的油菜素内酯生物合成缺陷的转基因油菜。

本发明克隆了甘蓝型油菜油菜素内酯生物合成相关基因BnaCYP705a12，所述油菜素内酯生物合成相关基因BnaCYP705a12具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其中，序列表中的SEQ ID NO：1由1479个碱基组成。该油菜素内酯生物合成相关基因BnaCYP705a12能够编码BnaCYP705a12蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中，序列表中的SEQ ID NO：2由492个氨基酸组成。本发明克隆了甘蓝型油菜油菜素内酯生物合成相关的BnaCYP705a12基因片段并构建了RNAi-BnaCYP705a12载体，基因片段如序列表中的SEQ IDNO：3所示。

本发明采用现有的植物表达载体(PFGC5941，南京沃博生物科技有限公司)构建含有BnaCYP705a12基因片段的重组RNAi载体。携带有本发明BnaCYP705a12基因片段的植物RNAi载体可通过农杆菌介导常规生物学方法转化到植物细胞或组织中，被转化的宿主植物可以是油菜、拟南芥、烟草等双子叶植物。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(潮霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明所提供的获得转基因植物的方法，是将上述植物蛋白的编码基因BnaCYP705a12导入植物中，得到油菜素内酯生物合成缺陷的转基因油菜。

本发明发现基因BnaCYP705a12是参与油菜素内酯的生物合成的关键基因，通过将这个基因进行了敲除，导致油菜素内酯的生物合成受阻，从而获得植株矮小、紧凑株型油菜。

本发明生产的转基因植株的油菜素内酯BL和6-脱氧栗甾酮6DCS含量显著降低，说明了转基因植株的油菜素内酯的生物合成受阻，由于转基因植株的油菜素内酯生物合成缺陷，从而导致植株表现出矮杆、紧凑株型，从而利于增强油菜抗倒性，还可帮助增加种植密度和收获指数，更适于机械化收获，可以增加油菜产量。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次提供了BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成中的应用，本发明的基因BnaCYP705a12或者含有基因BnaCYP705a12基因片段的RNAi表达载体可以应用在转化双子叶植物油菜产生油菜素内酯生物合成缺陷转基因植物中的应用。本发明生产的植株矮小、紧凑，不仅利于增强油菜抗倒性，还可帮助增加种植密度和收获指数，更适于机械化收获，可以增加油菜产量，同时可以用于转育的方法，培育出矮杆优良株型。本发明通过基因BnaCYP705a12调控油菜素内酯生物合成，因此在油菜育种过程中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为BnaCYP705a12的蛋白质序列分析图；

图2为甘蓝型油菜BnaCYP705a12蛋白的氨基酸序列经同源性比对，利用MEGA软件分析进化关系；

图3为植物PFGC5941载体构建示意图；

图4为对照ZS11植株和RNAi-BnaCYP705a12转基因植株表型；其中WT为ZS11单株，Ri-CYP705-1和Ri-CYP705-2为两个RNAi-BnaCYP705a12转基因植株；Ri-CYP705-1-1和Ri-CYP705-2-1为两个RNAi-BnaCYP705a12转基因纯合家系植株；

图5纯合转基因株系定量qRT-PCR分析，WT表示ZS11、Ri-CYP705-1、Ri-CYP705-2、Ri-CYP705-3三个株系BnaCYP705a12基因的表达情况，BnActin为内参基因；

图6为RNAi-BnaCYP705a12转基因油菜和对照ZS11植株的油菜素内酯含量测定；其中A、B分别为油菜素内酯(Brasssinolide,BL)和6-脱氧栗甾酮(6-deoxocastasterone,6DCS)的标准曲线；C、D分别为油菜素内酯BL和6-脱氧栗甾酮6DCS在对照ZS11植株和RNAi-BnaCYP705a12转基因油菜中的相对含量；Ri-CYP705-1、Ri-CYP705-2、Ri-CYP705-3表示RNAi-BnaCYP705a12转基因的三个株系。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用到的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

实施例1

参与油菜素内酯生物合成相关基因BnaCYP705a12的克隆

已公开的法国甘蓝型油菜B.napus cv.‘Darmor-bzh’基因组(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)设计用于扩增参与油菜素内酯生物合成相关基因的引物，上游引物P1：5’-ATGGCAGCAATGATAGTTGA-3’和下游引物P2：5’-TTAAAGGCTGAGTCGAGAAA-3’；提取提取甘蓝型油菜(Brassica napus)新鲜叶片的总RNA，然后用Reverse Transcription试剂盒(Takara)反转合成cDNA，以所合成的cDNA为模板，扩增油菜中的参与油菜素内酯生物合成相关基因，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，回收纯化，将回收产物连入载体pEasyBlunt Simple中，经热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。蓝白斑筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素LB液体培养基中，37℃、200rpm下培养10h，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列，由1479个碱基组成，命名为基因BnaCYP705a12，其编码序列位点位为自5’端第1-1479位碱基。基因BnaCYP705a12编码具有序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第43-1473位碱基编码保守序列。

本发明中BnaCYP705a12基因编码的蛋白属于细胞色素P450家族，序列表中SEQ IDNO.2的15-491氨基酸残基序列为该蛋白的保守序列，如图1所示。

本发明中BnaCYP705a12基因编码的蛋白与拟南芥AtCYP705A12、甘蓝型油菜中的BnaA09.CYP705a12、BnaA08.CYP705a12、BnaA03.CYP705a12、白菜中的Bra039930、Bar014143和甘蓝中的Bo8g100820具有较近的亲缘关系，如图2所示。

实施例2

含BnaCYP705a12基因的植物PFGC5941载体(RNAi-BnaCYP705a12)的构建

根据BnaCYP705a12基因的保守序列选取干扰片段170bp(SEQ ID NO.3)，在SEQ IDNO.3序列的上游加上Asc I限制性内切酶位点，根据Asc I限制性内切酶位点和保守序列设计上游引物，上游引物P3:5’-TTACAATTACCATGGGGCGCGCCATCCCTCATCACACCATA-3’，在SEQID NO.3序列的下游加上Swa I限制性内切酶位点，根据Swa I限制性内切酶位点和保守序列设计下游引物，下游引物P4:5’-TTAAATCATCGATTGGGCGCGCATCTACCAAACCTCCCTT-3’。用引物P3和P4对实施例1克隆得到的序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列进行PCR扩增，扩增产物为BnaCYP705a12基因的正义链。在SEQ ID NO.3序列的上游加上Sma I限制性内切酶位点，根据Sma I限制性内切酶位点和保守序列设计上游引物，上游引物P5:5’-GGACTCTAGAGGATCCCCGGGATCCCTCATCACACCATA-3’，在SEQ ID NO:3序列的下游加上BamH I限制性内切酶位点，根据BamH I限制性内切酶位点和保守序列设计下游引物，下游引物P6:5’-ATAAGGGACTGACCACCCGGGATCTACCAAACCTCCCTT-3’。用引物P5和P6对实施例1克隆得到的序列表中SEQID NO.1的核苷酸序列进行PCR扩增，扩增产物为BnaCYP705a12基因的反义链。PCR反应结束后，分别对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，按照说明进行目的条带回收并对其进行纯化，将回收产物连入载体pEasy Blunt Simple(全式金，CB111-02)中(正义链和反义链分别连接到载体中，形成发卡结果，进行基因沉默)，经热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。蓝白斑筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素LB液体培养基中，37℃、200rpm下培养，提取质粒，分别对其进行测序，测序结果表明P3和P4扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO.3加限制性内切酶Asc I和Swa I位点的正义链序列，P5和P6扩增的片段具有序列表中的SEQ ID NO.3加限制性内切酶Sma I和BamH I位点的反义链序列。为构建基因沉默载体，需先将干扰正义链与PFGC5941表达载体连接，用限制性内切酶Asc I和Swa I对含有SEQ ID NO.3序列的正义链质粒进行酶切，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收长度约170bp含有SEQ ID NO：3的正义链片段并对其进行纯化，将回收片段用T4 DNA连接酶(Takara)与经相同酶切的载体PFGC5941连接。再用限制性内切酶Sma I和BamH I对含有SEQ ID NO.3序列的反义链质粒进行酶切，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收长度约170bp含有SEQ ID NO.3的反义链片段并对其进行纯化，将回收片段用T4 DNA连接酶(Takara)与经相同酶切并且已经连接正义链的载体PFGC5941连接，如图3所示。再将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养10h，提取质粒，用引物P3/P4和P5/P6进行PCR鉴定，与预期结果一致，表明得到了插入正义链和反义链序列及位置正确的含有SEQ ID NO.3序列的植物表达载体，命名为RNAi-BnaCYP705a12(SEQ ID NO.4)。

实施例3

RNAi-BnaCYP705a12转基因油菜的获得

将实施例2构建的植物RNAi-BnaCYP705a12载体用热激法转化农杆菌EHA105(博而金，NGC201-1)感受态细胞，将其涂布于含卡那霉素和利福平的LB抗性平板上，在28℃、150rpm下培养16h，挑取长出的农杆菌单菌落，筛选阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆再接种于含卡那霉素和利福平的20ml YEB液体培养基中，在28℃、150rpm下培养2天，然后，再按体积比2％的接种量菌将菌液接种于含卡那霉素和利福平的300ml YEB液体培养基中，在28℃、150rpm下培养18小时，至OD600＝0.8-1.2。培养结束后，5000rpm离心20分钟后收集菌体，再将菌体悬浮于250ml含有5％蔗糖，0.1％Silwetl-77的溶液中，至OD600＝0.6-1.0。最后，将菌液转于250ml烧杯中，将ZS11材料(已授粉结束的甘蓝型油菜的花去掉)，再将植株倒置于烧杯中，使其花序完全侵入菌液中，为提高转化效率，一周后再重复一次。将转化植株进行培养，收获种子，所得种子种植到含有看阿霉素的1/2MS培养基中，经卡那霉素和PCR鉴定筛选。具体过程为：将转化后的T₀代油菜种子放入2mL的离心管中(带盖)，首先用70％的无水乙醇消毒3min，将70％乙醇倒入废桶；再将5％的次氯酸钠溶液加入离心管中，种子消毒10min；种子消毒后对种子表面用无菌水清洗5次；随后加入适量的Agar溶液(0.1％)，使消毒后的种子悬浮起来；然后将种子点播到含有Kan(50ng/mL)的1/2MS固体培养基中，并以ZS11为对照，在24℃光照培养室生长一周，将能长出真叶的植株移栽到营养土中继续生长。待植株长到4片真叶时，提取DNA进行PCR鉴定，利用载体上35S引物(GACGCACAATCCCACTATCC)与基因下游引物(TTAAATCATCGATTGGGCGCGCATCTACCAAACCTCCCTT)进行PCR扩增(含有目的基因)，对扩增产物进行胶回收、测序。测序正确的阳性植株继续放置光照培养箱中培养，观察表型，待植株成熟后收获T₁代种子。得到RNAi-BnaCYP705a12转基因植株。

3、RNAi-BnaCYP705a12转基因植株表型观察

将获得的RNAi-BnaCYP705a12载体阳性转基因植株的种子收集并与ZS11材料种植在同一自然条件下(培养箱的温度为24/18℃，湿度为70％，光照为30000Lux)，以甘蓝型油菜ZS11材料为对照。观察RNAi-BnaCYP705a12转基因植株和对照组的生长情况，经过加代，定量qRT-PCR验证，具体过程为：将T1代种子播种在培养土中，进行DNA提取和PCR鉴定，选择单拷贝的阳性植株(阳性：非阳性＝3:1)移栽到营养土中，植株成熟后收获T2代种子。在营养土中播种T2代种子，待植株生长到5叶期时，取转基因植株叶片进行DNA提取，并对叶片DNA进行PCR扩增，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电压设置120V，时间25min，使用凝胶成像仪拍照并分析目的条带。

对目的条带进行回收，步骤如下：

(1)在紫外灯下切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用滤纸吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5mL离心管的重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。

(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后与75℃加热，间隔混合(每次1-2分钟)，直至凝胶块完全熔化(约6-8分钟)。

(3)加0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。

(4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，12，000×g离心1min，弃滤液。

(5)将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1，12，000×g离心30s，弃滤液。

(6)将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12，000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次12，000×g离心1min。

(7)将制备管置回2mL离心管中，12，000×g离心1min。

(8)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，敞口静置2min，在制备膜中央加25-30μLEluent或去离子水(水浴65℃)，室温静置1min。12，000×g离心1min洗脱DNA。

将PCR胶回收产物连入克隆载体并送测序，步骤如下：：

(1)将4μL回收产物与1μL pEasy Blunt Simple克隆载体混匀，置于PCR仪中25℃反应20min；

(2)将5μL的PCR产物加到50μL Trans1-T1大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激30s后迅速置于冰上静置2min，加入600μL无抗LB培养3h；

(3)将培养后的菌液涂在带有卡那霉素抗性的平板上；

(4)挑取单克隆并加入1mL带有卡那霉素抗性的LB培养6-8h；

(5)菌液PCR验证后送测序，测序由擎科生物科技有限公司进行。

最后将T2代阳性转基因植株的种子进行收获并种植，利用上述同样的方法进行PCR鉴定，筛选出表型一致，基因型一致(无杂合基因型)的纯合T3代转基因株系，用于后续的实验分析。最后得到纯合的RNAi-BnaCYP705a12油菜T3代转基因株系，随机选择T3代转基因中三个株系命名为Ri-CYP705-1、Ri-CYP705-2和Ri-CYP705-3进行定量分析和激素测定。Ri-CYP705-1和Ri-CYP705-2两个株系种子收获并种植在光照培养箱中生长，在同样条件下以ZS11为对照，两个株系的后代(Ri-CYP705-1-1和Ri-CYP705-2-1)都表现出矮小、紧凑、叶片皱缩表型，而ZS11株系的后代叶片平展、不紧凑、高杆(图4)，

上述结果显示RNAi-BnaCYP705a12转基因植株表现出叶片皱缩，植株矮小、紧凑等表型，有效解决了现有油菜本身是高杆的、多分枝的，不利于机械收获的问题。同时说明本发明转基因的表型是可以遗传的，同时证实了Ri-CYP705-1和Ri-CYP705-2两个株系均是纯合转基因植株，而Ri-CYP705-3及其后代也表现出如Ri-CYP705-1、Ri-CYP705-2类似的性状。

对纯合的RNAi-BnaCYP705a12油菜T3代转基因株系Ri-CYP705-1、Ri-CYP705-2、Ri-CYP705-3和ZS11对照植株进行RNA的提取，再反转录合成cDNA序列，反转录得到的cDNA经看家基因Actin的引物检测后稀释20倍，可直接用于后续的qRT-PCR反应。根据实时荧光定量qRT-PCR的引物要求设计引物，利用Primer Premier 5软件进行定量引物设计，上游引物(5’-3’)：AGGGTTTGATGAGTTGTTGGAG；下游引物(5’-3’)：GCGTTGTGTGTGCCGAGG。以油菜看家基因Actin为内参，再以SYBR Green作为qRT-PCR的荧光染料，通过稀释BnaActin和BnaCYP705a12两对引物和叶片cDNA模板浓度，设置合适的退火温度(60℃)，使BnaActin基因(内参基因)和BnaCYP705a12基因的扩增效率达到90-110％，Ct值在15-30之间。以不同浓度梯度的cDNA为模板，制作这两个基因的标准曲线。在Bio-Rad CFX96仪器上进行qRT-PCR反应，采用两步法扩增，使用20μL的反应体系。根据转基因材料和ZS11的qRT-PCR的结果进行比较，从图5可以看出，BnaCYP705a12基因在转基因植株中的表达量要显著低于对照ZS11材料中的表达量，说明基因表达受到了沉默，从而进一步阻碍该基因对油菜素内酯的生物合成能力，导致油菜素内酯含量降低，表现出矮杆、紧凑株型。

此外，以不含基因BnaCYP705a12的空载载体为对照，按上述相同的方法进行转基因，并对植株表型观察，空载对照的的转基因植株与对照组ZS11表型类似，无表型变化。

实施例4

RNAi-BnaCYP705a12转基因植株油菜素内酯含量测定

1、标曲溶液配置

(1)取甲醇溶液996μl加入1.5ml离心管，加入500μg/ml油菜素内酯BL(购自OIchem公司)和6-脱氧栗甾酮6DCS激素(购自Sigma公司)标准品储备液各2μl，震荡均匀，配置为终浓度1μg/ml的使用母液以备后续使用。

(2)取甲醇溶液对步骤(1)中配置的母液分别进行稀释，配置为终浓度0.5ng/ml,2ng/ml,5ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml的标曲溶液。

2、植物激素提取

(1)取2g对照组ZS11材料以及RNAi-BnaCYP705a12转基因植株的叶片放入预冷的研钵中，加入液氮研磨，准确称量全部新鲜植物样品于试管中；

(2)加入4℃预冷的95％甲醇10ml，4℃提取2h；

(3)10000g,4℃,离心5min，取上清，沉淀再提取一次，合并上清液，过MCX预装柱，以3ml甲醇洗脱；

(4)氮气吹干甲醇，加入200μl甲醇溶解，过0.22μm滤膜，进HPLC-MS/MS检测。

3、色谱-质谱分析

(1)高效液相色谱条件

样品采用AGLIENT1290高效液相色谱仪(美国AGLIENT公司)进行分离。流动相：A液为95％甲醇，B液为0.1％氨水。样品置于4℃自动进样器中，柱温为35℃，流速为350μL/min，进样量为2μL。相关液相梯度如下：

(2)质谱分析

采用SCIEX-6500Qtrap(MSMS)(美国AB公司)质谱仪进行质谱分析。电离方式：ESI正离子模式；扫描类型：MRM；气帘气：15psi；喷雾电压：+4500v；雾化气压力：65psi；辅助气压力：70psi；雾化温度：350℃；植物激素BL和6DCS质子化或去质子化的选择反应监测条件([M+H]⁺或[M-H]^-)见下表：

注：标记*的为定量离子

4、植物激素BR含量计算

仪器所测得浓度为最终提取液的浓度，经计算获得原样品中激素BL和6DCS含量，计算方法如下：

植物样品中激素含量(ng/g)＝检测浓度(ng/ml)×稀释体积(ml)/称取质量(g)

其中稀释体积为样品最终溶解进样时所用的溶液体积，称取质量为提取时的取样质量。

检测浓度由待测物质峰面积代入标曲方程，由仪器自动求得。

通过油菜素内酯含量测定，验证了含有BnaCYP705a12基因片段的转基因植株具有油菜素内酯缺陷的表现，图6结果显示，RNAi-BnaCYP705a12转基因植株的油菜素内酯生物合成受到了破坏，导致转基因植株的油菜素内酯BL和6-脱氧栗甾酮6DCS含量显著降低，使得油菜素内酯的合成受阻，从导致植株矮小、紧凑。植株矮小、紧凑株型不仅利于增强油菜抗倒性，还可帮助增加种植密度和收获指数，更适于机械化收获，可以增加油菜产量，同时可以用于转育的方法，培育出矮杆优良株型。所以本发明对于获得油菜素内酯生物合成缺陷突变体具有重要的理论及实践意义。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 基因BnaCYP705a12在油菜素内酯生物合成以及生产转基因植物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcagcaa tgatagttga ctttcaaaac tgctccatct tcatcctcct ctgcttcttc 60

tcatttctct gttactccgt cttcttcttc ttcaagaaga caaatgactt gggtccgagc 120

cctccctctt tgccgatcat cggccatctt caccattttc tctcagttct accccacaag 180

gcttttcaga aaatctcgac caagtatgga cctctcctcc atctccacat tttcagtttt 240

cccatagtcc ttgtttcttc tcccacaatg gcccacgaga tattcacgac acacgactta 300

aacatctcgt ctcgcaacac acctgccatc gacgagtctc tcctgtttgg accttccggc 360

ttcacggtag ctccttatgg agactacgtt aagttcataa agaagcttct tgcgacgaag 420

cttcttcgac cgcgggcaat cgagaagtca cgaggtgtcc gtgcagagga gctaaagcaa 480

ttttatctta aacttcacga taaggcgttg aagaaagaaa gcattgagat tggtaaggaa 540

acgatgaagt tcactaacaa catgatctgc aggatgagca ttgggaggag tttttcagag 600

gagaacggtg aggtagagac tctgagggaa ttgattatca aatcgtttgc cttatcgaag 660

cagattctgt ttatgcttgg actaatgtca ctgtttaaga aagatataat ggatgtttca 720

agagggtttg atgagttgtt ggagagggtt cttgcggagc atgaagagaa acgggaggag 780

gatcaagata tggacatgat ggatttgctg ttggaagctt gtacagacga aaacgcagag 840

tataaaatca ctaggaacca gatcaaatca ttgttcgtgg aaattttttt gggaggcaca 900

gacacctcgg cacacacaac gcagtggaca atggcggagc tcgttaacaa cctaaacact 960

cttgggagat taagagacga aattgatctc gttgtaggga aagaaagatt gattcaagaa 1020

acagatctac caaacctccc ttatttgcaa gcagtggtta aggaagggct acgcttgcac 1080

ccaccggcac ctttactggt tagaatgttc gacaaaaaat gtgtgatcaa agatttcttc 1140

aaagtaccgg aaaaaacaac acttgttgtt aatgtttatg gtgtgatgag ggatccagat 1200

tcttgggaag atcctaatga gttcaagcca gagaggtttc taacttcaaa gcaagaagaa 1260

gagaaagtat taaagtacct tccttttgca gctggaagaa ggggatgtcc tgcaacaaat 1320

gtaggctata tctttgtagg aatctcaatt ggaatgatgg tgcagtgctt tgactggagt 1380

atcaaagata aggttagtat gaaagaggtc tatgcaggaa tgagtctttc catggctcat 1440

cccccaaagt gcactccagt ttctcgactc agcctttaa 1479

<210> 2

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ala Met Ile Val Asp Phe Gln Asn Cys Ser Ile Phe Ile Leu

1               5                   10                  15

Leu Cys Phe Phe Ser Phe Leu Cys Tyr Ser Val Phe Phe Phe Phe Lys

            20                  25                  30

Lys Thr Asn Asp Leu Gly Pro Ser Pro Pro Ser Leu Pro Ile Ile Gly

        35                  40                  45

His Leu His His Phe Leu Ser Val Leu Pro His Lys Ala Phe Gln Lys

    50                  55                  60

Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Pro Leu Leu His Leu His Ile Phe Ser Phe

65                  70                  75                  80

Pro Ile Val Leu Val Ser Ser Pro Thr Met Ala His Glu Ile Phe Thr

                85                  90                  95

Thr His Asp Leu Asn Ile Ser Ser Arg Asn Thr Pro Ala Ile Asp Glu

            100                 105                 110

Ser Leu Leu Phe Gly Pro Ser Gly Phe Thr Val Ala Pro Tyr Gly Asp

        115                 120                 125

Tyr Val Lys Phe Ile Lys Lys Leu Leu Ala Thr Lys Leu Leu Arg Pro

    130                 135                 140

Arg Ala Ile Glu Lys Ser Arg Gly Val Arg Ala Glu Glu Leu Lys Gln

145                 150                 155                 160

Phe Tyr Leu Lys Leu His Asp Lys Ala Leu Lys Lys Glu Ser Ile Glu

                165                 170                 175

Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Phe Thr Asn Asn Met Ile Cys Arg Met

            180                 185                 190

Ser Ile Gly Arg Ser Phe Ser Glu Glu Asn Gly Glu Val Glu Thr Leu

        195                 200                 205

Arg Glu Leu Ile Ile Lys Ser Phe Ala Leu Ser Lys Gln Ile Leu Phe

    210                 215                 220

Met Leu Gly Leu Met Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Met Asp Val Ser

225                 230                 235                 240

Arg Gly Phe Asp Glu Leu Leu Glu Arg Val Leu Ala Glu His Glu Glu

                245                 250                 255

Lys Arg Glu Glu Asp Gln Asp Met Asp Met Met Asp Leu Leu Leu Glu

            260                 265                 270

Ala Cys Thr Asp Glu Asn Ala Glu Tyr Lys Ile Thr Arg Asn Gln Ile

        275                 280                 285

Lys Ser Leu Phe Val Glu Ile Phe Leu Gly Gly Thr Asp Thr Ser Ala

    290                 295                 300

His Thr Thr Gln Trp Thr Met Ala Glu Leu Val Asn Asn Leu Asn Thr

305                 310                 315                 320

Leu Gly Arg Leu Arg Asp Glu Ile Asp Leu Val Val Gly Lys Glu Arg

                325                 330                 335

Leu Ile Gln Glu Thr Asp Leu Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Val

            340                 345                 350

Val Lys Glu Gly Leu Arg Leu His Pro Pro Ala Pro Leu Leu Val Arg

        355                 360                 365

Met Phe Asp Lys Lys Cys Val Ile Lys Asp Phe Phe Lys Val Pro Glu

    370                 375                 380

Lys Thr Thr Leu Val Val Asn Val Tyr Gly Val Met Arg Asp Pro Asp

385                 390                 395                 400

Ser Trp Glu Asp Pro Asn Glu Phe Lys Pro Glu Arg Phe Leu Thr Ser

                405                 410                 415

Lys Gln Glu Glu Glu Lys Val Leu Lys Tyr Leu Pro Phe Ala Ala Gly

            420                 425                 430

Arg Arg Gly Cys Pro Ala Thr Asn Val Gly Tyr Ile Phe Val Gly Ile

        435                 440                 445

Ser Ile Gly Met Met Val Gln Cys Phe Asp Trp Ser Ile Lys Asp Lys

    450                 455                 460

Val Ser Met Lys Glu Val Tyr Ala Gly Met Ser Leu Ser Met Ala His

465                 470                 475                 480

Pro Pro Lys Cys Thr Pro Val Ser Arg Leu Ser Leu

                485                 490

<210> 3

<211> 170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctaccaaa cctcccttat ttgcaagcag tggttaagga agggctacgc ttgcacccac 60

cggcaccttt actggttaga atgttcgaca aaaaatgtgt gatcaaagat ttcttcaaag 120

taccggaaaa aacaacactt gttgttaatg tttatggtgt gatgagggat 170

<210> 4

<211> 11709

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcga gctcggatct gataatttat 120

ttgaaaattc ataagaaaag caaacgttac atgaattgat gaaacaatac aaagacagat 180

aaagccacgc acatttagga tattggccga gattactgaa tattgagtaa gatcacggaa 240

tttctgacag gagcatgtct tcaattcagc ccaaatggca gttgaaatac tcaaaccgcc 300

ccatatgcag gagcggatca ttcattgttt gtttggttgc ctttgccaac atgggagtcc 360

aagattctgc agttagatct cggtgacggg caggaccgga cggggcggta ccggcaggct 420

gaagtccagc tgccagaaac ccacgtcatg ccagttcccg tgcttgaagc cggccgcccg 480

cagcatgccg cggggggcat atccgagcgc ctcgtgcatg cgcacgctcg ggtcgttggg 540

cagcccgatg acagcgacca cgctcttgaa gccctgtgcc tccagggact tcagcaggtg 600

ggtgtagagc gtggagccca gtcccgtccg ctggtggcgg ggggagacgt acacggtcga 660

ctcggccgtc cagtcgtagg cgttgcgtgc cttccagggg cccgcgtagg cgatgccggc 720

gacctcgccg tccacctcgg cgacgagcca gggatagcgc tcccgcagac ggacgaggtc 780

gtccgtccac tcctgcggtt cctgcggctc ggtacggaag ttgaccgtgc ttgtctcgat 840

gtagtggttg acgatggtgc agaccgccgg catgtccgcc tcggtggcac ggcggatgtc 900

ggccgggcgt cgttctgggc tcatcgattc gatttggtgt atcgagattg gttatgaaat 960

tcagatgcta gtgtaatgta ttggtaattt gggaagatat aataggaagc aaggctattt 1020

atccatttct gaaaaggcga aatggcgtca ccgcgagcgt cacgcgcatt ccgttcttgc 1080

tgtaaagcgt tgtttggtac acttttgact agcgaggctt ggcgtgtcag cgtatctatt 1140

caaaagtcgt taatggctgc ggatcaagaa aaagttggaa tagaaacaga atacccgcga 1200

aattcaggcc cggttgccat gtcctacacg ccgaaataaa cgaccaaatt agtagaaaaa 1260

taaaaactag ctcagatact tacgtcacgt cttgcgcact gatttgaaaa atctcagaat 1320

tccaatccca caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg 1380

tattcaacac cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata 1440

cgatgactgg ggttgtacaa aggcggcaac aaacggcgtt cccggagttg cacacaagaa 1500

atttgccact attacagagg caagagcagc agctgacgcg tacacaacaa gtcagcaaac 1560

agacaggttg aacttcatcc ccaaaggaga agctcaactc aagcccaaga gctttgctaa 1620

ggccctaaca agcccaccaa agcaaaaagc ccactggctc acgctaggaa ccaaaaggcc 1680

cagcagtgat ccagccccaa aagagactcc tttgccccgg agattacaat ggacgatttc 1740

ctctatcttt acgatctagg aaggaagttc gaaggtgaag gtgacgacac tatgttcacc 1800

actgataatg agaaggttag cctcttcaat ttcagaaaga atgctgaccc acagatggtt 1860

agagaggcct acgcagcagg tctcatcaag acgatctacc cgagtaacaa tctccaggag 1920

atcaaatacc ttcccaagaa ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taattgcatc 1980

aagaacacag agaaagacat atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt 2040

caaggcttgc ttcataaacc aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt 2100

cctactgaat ctaaggccat gcatggagtc taagattcaa atcgaggatc taacagaact 2160

cgccgtgaag actggcgaac agttcataca gagtctttta cgactcaatg acaagaagaa 2220

aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac tctggtctac tccaaaaatg tcaaagatac 2280

agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa aggataattt cgggaaacct 2340

cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag aaaaggaagg 2400

tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcattcaag atctctctgc 2460

cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt 2520

tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgacatc tccactgacg taagggatga 2580

cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt 2640

ggagaggaca cgctcgagta taagagctct atttttacaa caattaccaa caacaacaaa 2700

caacaaacaa cattacaatt acatttacaa ttaccatggg gcgcgccatc cctcatcaca 2760

ccataaacat taacaacaag tgttgttttt tccggtactt tgaagaaatc tttgatcaca 2820

cattttttgt cgaacattct aaccagtaaa ggtgccggtg ggtgcaagcg tagcccttcc 2880

ttaaccactg cttgcaaata agggaggttt ggtagatatt taaatgtgta agaatttctt 2940

atgttacatt attacattca acgttttatc ttaattggct cttcatttga ttgaaatttg 3000

acaattattt cttgtttttt tttttgtcac actctttttg ggttggggtg gccgacgaat 3060

tgtgggaagg tagaaagagg ggaggacttt tgttatactc cattagtaat tactgtttcc 3120

gtttcaattt atgtgacaat atttcctttt tagtcggttc caaaagaaaa tgtcagcatt 3180

ataaacaatt taattttgaa attacaattt tgccattaat aaaatgattt acaaccacaa 3240

aagtatctat gagcctgttt gggtgggctt ataagcagct tattttaagt ggcttataag 3300

tcaaaaagtg acantttttg agaagttaga aaatcctaac ttctcaaaaa gtagctttta 3360

agccacttat gacttataag tccaaaaatt tttaagttac caaacatata ttaatgggtt 3420

tataagctta taagccactt ttaagctcac ccaaacgggt tctatgtctc actttagact 3480

acaaatttta aaagtcttca tttatttctt aatctccgtg gcgagtnaaa ctataacaca 3540

taaagtgaaa cggagggaat aagatggagt cataaactaa tccaaatcta tactctctcc 3600

gttaatttgt tttttagttt gatttggtac attaataaaa cagatttttc gaaggttata 3660

aacacagaca gatgtttccc agcgagctag caaaattcca agatttctgt cgaaaattcg 3720

tgtgtttcta gctagtactt gatgttatct ttaacctttt agtaattttt tgtccttttc 3780

tttctatttt tcatcttaca atgaattatg agcaagttcc ttaagtagca tcacacgtga 3840

gatgtttttt atgatattga ctaaatccaa tctttaccat tccttaacta gtaaaataca 3900

acacatgtta attgatacat tgcttaacac tgaggttaga aaattttaga aattagttgt 3960

ccaaatgctt tgaaattaga aatctttaat cccttatttt tttttaaaat gttttttctc 4020

actccaaaga aagagaaact gacatgaaag ctcaaaagat catgaatctt actaactttg 4080

tggaactaaa tgtacatcag aatgtttctg acatgtgaaa atgaaagctc ttaattttct 4140

tcttttattt attgagggtt tttgcatgct atgcattcaa tttgagtact ttaaagcacc 4200

tataaacact tacttacact tgccttggag tttatgtttt agtgttttct tcacatcttt 4260

tttggtcaat ttgcaggtat ttggatccat ctaccaaacc tcccttattt gcaagcagtg 4320

gttaaggaag ggctacgctt gcacccaccg gcacctttac tggttagaat gttcgacaaa 4380

aaatgtgtga tcaaagattt cttcaaagta ccggaaaaaa caacacttgt tgttaatgtt 4440

tatggtgtga tgagggatcc cgggactagt ccctagagtc ctgctttaat gagatatgcg 4500

agacgcctat gatcgcatga tatttgcttt caattctgtt gtgcacgttg taaaaaacct 4560

gagcatgtgt agctcagatc cttaccgccg gtttcggttc attctaatga atatatcacc 4620

cgttactatc gtatttttat gaataatatt ctccgttcaa tttactgatt gtaccctact 4680

acttatatgt acaatattaa aatgaaaaca atatattgtg ctgaataggt ttatagcgac 4740

atctatgata gagcgccaca ataacaaaca attgcgtttt attattacaa atccaatttt 4800

aaaaaaagcg gcagaaccgg tcaaacctaa aagactgatt acataaatct tattcaaatt 4860

tcaaaagtgc cccaggggct agtatctacg acacaccgag cggcgaacta ataacgctca 4920

ctgaagggaa ctccggttcc ccgccggcgc gcatgggtga gattccttga agttgagtat 4980

tggccgtccg ctctaccgaa agttacgggc accattcaac ccggtccagc acggcggccg 5040

ggtaaccgac ttgctgcccc gagaattatg cagcattttt ttggtgtatg tgggccccaa 5100

atgaagtgca ggtcaaacct tgacagtgac gacaaatcgt tgggcgggtc cagggcgaat 5160

tttgcgacaa catgtcgagg ctcagcagga cctgcaggca tgcaagcttg gcactggccg 5220

tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 5280

cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 5340

aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgct agagcagctt gagcttggat cagattgtcg 5400

tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa 5460

gagaaaagag cgtttattag aataacggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt 5520

tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat 5580

ccaacccctc cgctgctata gtgcagtcgg cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga 5640

aaacgacatg tcgcacaagt cctaagttac gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg 5700

gcgttttctt gtcgcgtgtt ttagtcgcat aaagtagaat acttgcgact agaaccggag 5760

acattacgcc atgaacaaga gcgccgccgc tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac 5820

cgacgaccag gacttgacca accaacgggc cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct 5880

gttttccgag aagatcaccg gcaccaggcg cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga 5940

ccacctacgc cctggcgacg ttgtgacagt gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac 6000

ccgcgaccta ctggacattg ccgagcgcat ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct 6060

ggcagagccg tgggccgaca ccaccacgcc ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc 6120

cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc 6180

cgccaaggcc cgaggcgtga agtttggccc ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc 6240

gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct 6300

tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac 6360

cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga ggacgcattg accgaggccg acgccctggc 6420

ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac 6480

gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc 6540

gagccgcccg cgcacgtctc aaccgtgcgg ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat 6600

gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta 6660

aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg 6720

cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc 6780

agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg 6840

ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg 6900

ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg 6960

acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg 7020

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cttacgacat atgggccacc gccgacctgg tggagctggt taagcagcgc attgaggtca 7140

cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg 7200

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cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat 10500

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ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc 10740

tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg 10800

tcttcttccc agttttcgca atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat 10860

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cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac 11640

tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg 11700

gctggctgg 11709

Claims (8)

1.基因BnaCYP705a12在油菜中的油菜素内酯生物合成中的应用，所述基因BnaCYP705a12的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.基因BnaCYP705a12编码的蛋白BnaCYP705a12在油菜中的油菜素内酯生物合成中的应用，所述蛋白质BnaCYP705a12的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有BnaCYP705a12基因片段的RNAi表达载体在抑制油菜中油菜素内酯生物合成中的应用，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含有BnaCYP705a12基因片段的RNAi表达载体的构建方法，包括如下步骤：

设计引物，PCR扩增BnaCYP705a12基因片段，将扩增的基因片段连接到pEasy BluntSimple载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞，卡那霉素筛选获得阳性克隆，提取质粒，获得含BnaCYP705a12基因片段的pEasy Blunt Simple载体；将含BnaCYP705a12基因片段的pEasy Blunt Simple载体和pFGC5941载体通过酶切-连接方式重组，转化至大肠杆菌感受态细胞，经卡那霉素筛选得到成功重组的RNAi-BnaCYP705a12载体。

5.一种包含权利要求3中所述的RNAi表达载体的宿主菌在抑制油菜中油菜素内酯生物合成中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述宿主菌为农杆菌EHA105。

7.权利要求3中所述的RNAi表达载体在产生油菜素内酯生物合成缺陷的转基因油菜中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产生油菜素内酯生物合成缺陷转基因油菜的过程，包括如下步骤：

(1)农杆菌介导的转化：将所述RNAi表达载体转化到农杆菌中，筛选阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆接种到YEP液体培养基中培养至OD₆₀₀＝0.8-1.2，离心后用侵染培养基重悬至OD₆₀₀＝0.6-1.0，将油菜花苞浸没在侵染培养基中侵染后继续培养直至收获种子；

(2)转基因株系的筛选：挑选收获的种子进行种植，经过加代，定量qRT-PCR验证，最后得到纯合的油菜素内酯生物合成缺陷的转基因油菜。

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