CN107794276A

CN107794276A - 一种crispr介导快速有效的农作物定点基因片段或等位基因替换方法和体系

Info

Publication number: CN107794276A
Application number: CN201711089532.7A
Authority: CN
Inventors: 夏兰琴; 李晶莹; 赵云德; 孙永伟; 张佳慧
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2018-03-13

Abstract

本发明公开了一种CRISPR介导快速有效的农作物定点基因片段或等位基因替换的方法和体系。本发明提供的体系包括重组载体和游离供体片段；重组载体中包括：sgRNA1的编码序列、Cas9基因的表达盒、供体片段和sgRNA2的编码序列；供体片段中包括：sgRNA1的靶标、突变区段、sgRNA2的靶标；突变区段与目标区段发生同源重组；突变区段与目标区段的区别：①将目标核苷酸或片段替换为突变后核苷酸或片段；②将sgRNA1的靶标中的NGG突变为非NGG；③将sgRNA2的靶标中的NGG突变为非NGG。本发明为农作物育种改良提供了一种可行、有效的定点基因片段或等位基因替换和整合的方法，具有较大的应用潜力和广泛的前景。

Description

一种CRISPR介导快速有效的农作物定点基因片段或等位基因替换方法和体系

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CRISPR介导快速有效的农作物定点基因片段或等位基因替换方法和体系。

背景技术

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经成为分子生物学中最强大的工具之一。首次在细菌中发现，由sgRNA和Cas9两部分组成。CRISPR/Cas9是通过自身的核酸内切酶活性引起靶位点DNA序列双链断裂(double-strand breaks，DSBs)，然后通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组介导的修复(homology-directedrepair，HDR)两种方式引入突变。NHEJ途径诱导产生的突变大部分为核苷酸的插入或缺失，造成移码突变，而HDR则由同源供体DNA介导片段插入或核苷酸修正。CRISPR/Cas9系统对靶位点的识别依赖于核酸之间碱基互补配对，可对任何紧随PAM(NGG)的20bp的靶点序列进行编辑，且其靶点在基因组中的分布频率很高，因此对于需要定点编辑的靶基因，更容易找到合适的靶位点。另外CRISPR/Cas9系统可同时对同一基因的不同位点或多个基因的位点进行定向编辑，使其运用更加灵活。此外，CRISPR/Cas9系统操作简单快捷，每次打靶只需替换原有载体上20-30bp的核苷酸序列，更适宜规模化，高通量操作。随着CRISPR/Cas9技术在人类与动物细胞系中建立并应用，经过改造的CRISPR/Cas9系统，迅速应用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定点敲除和功能分析研究中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。

农作物地方品种或近缘属种中，含有大量优异农艺性状基因，和常规栽培品种相比，这些基因只存在单个碱基或者多个碱基差异(SNPs)。通过常规杂交和回交转育方法，引入这些基因或优异性状，需要多年多代材料选育，费时费力。尽管CRISPR/Cas9作为一种新的靶向基因修饰技术，展现了广阔的发展潜力和应用前景,但应用在作物改良方向仍然具有一定的限制，传统CRISPR/Cas9技术引入DSB后，与非同源末端连接的随机修复过程相比，HDR发生的频率特别低。因此，亟待开发一种利用CRISPR/Cas9介导的内源基因的定点同源重组系统，应用于在农作物育种改良和新种质创制。

氮元素是作物生长所需的大量元素之一，在植物生长发育中起到重要的作用。亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)主要由两个亚种籼稻和粳稻组成。籼稻比粳稻拥有更强的氮吸收能力。研究表明，在两个亚种中硝酸盐转运蛋白编码基因OsNRT1.1B存在等位变异，该基因980位碱基由C变成T，可导致其编码硝酸盐转运蛋白的第327位的苏氨酸突变成甲硫氨酸，影响了该蛋白的结构，从而大大提高了籼稻的氮利用效率。将该等位基因通过杂交回交转育到粳稻品种中，也可大大提高粳稻的氮利用效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种CRISPR介导快速有效的农作物定点基因片段或等位基因替换方法和体系。

本发明首先保护一种向植物中的功能基因引入定点突变的重组载体(重组载体A)；

将所述功能基因中预期引入定点突变的核苷酸命名为目标核苷酸；将所述功能基因中具有目标核苷酸的区段命名为目标区段；目标区段中，目标核苷酸的上游具有一个sgRNA靶标，目标核苷酸的下游具有另一个sgRNA靶标，将两个sgRNA分别命名为sgRNA1和sgRNA2；

所述重组载体A中包括如下元件：sgRNA1的编码序列、Cas9基因的表达盒、供体片段和sgRNA2的编码序列；Cas9基因的表达盒位于sgRNA1的编码序列和sgRNA2的编码序列之间；供体片段均位于sgRNA1的编码序列和sgRNA2的编码序列之间；

供体片段中包括如下元件：sgRNA1的靶标、突变区段、sgRNA2的靶标；突变区段位于sgRNA1的靶标和sgRNA2的靶标之间；

突变区段的一端为上游同源臂，另一端为下游同源臂，以实现与目标区段发生同源重组；所述突变区段与所述目标区段的区别包括如下①-③：①将目标核苷酸替换为了突变后核苷酸；②将sgRNA1的靶标中的NGG突变为了非NGG；③将sgRNA2的靶标中的NGG突变为了非NGG。

所述目标区段中，sgRNA1的靶标和sgRNA2的靶标之间具有限制性内切酶的识别序列；所述突变区段与所述目标区段的区别还包括如下④：将所述限制性内切酶的识别序列突变为了非识别序列。所述限制性内切酶具体可为限制性内切酶Sac I。

所述sgRNA1具体如序列表的序列7所示。

所述sgRNA2具体如序列表的序列8所示。

所述功能基因具体可为NRT1.1B基因。所述NRT1.1B基因为编码序列表的序列3所示蛋白质的基因。所述NRT1.1B基因如序列表的序列1或序列表的序列2所示。

所述定点突变具体可为将NRT1.1B基因中编码序列表的序列3所示蛋白质第327位氨基酸残基的密码子由编码苏氨酸的密码子突变为了编码甲硫氨酸的密码子。

所述目标核苷酸具体可为序列表的序列2第980位核苷酸。

所述目标核苷酸具体可为序列表的序列1第3019位核苷酸。

所述目标片段如序列表的序列5所示。

所述重组载体A具体如序列表的序列6所示。

本发明还保护一种向植物中的功能基因引入定点突变的系统(系统A)，包括以上任一所述重组载体A和游离供体片段；所述游离供体片段与所述重组载体A中的供体片段序列一致。

所述目标核苷酸具体可为序列表的序列2第980位核苷酸。

所述目标核苷酸具体可为序列表的序列1第3019位核苷酸。

所述目标片段如序列表的序列5所示。

所述游离供体片段具体如序列表的序列4所示。

所述系统A中，重组载体A和游离供体片段的摩尔比具体可为1：20。

本发明还保护以上任一所述重组载体A或以上任一所述系统A在向植物中的功能基因引入定点突变中的应用。所述功能基因具体可为NRT1.1B基因。所述NRT1.1B基因为编码序列表的序列3所示蛋白质的基因。所述NRT1.1B基因如序列表的序列1或序列表的序列2所示。所述定点突变具体可为将NRT1.1B基因中编码序列表的序列3所示蛋白质第327位氨基酸残基的密码子由编码苏氨酸的密码子突变为了编码甲硫氨酸的密码子。所述目标核苷酸具体可为序列表的序列2第980位核苷酸。所述目标核苷酸具体可为序列表的序列1第3019位核苷酸。

本发明还保护一种向植物中的功能基因引入定点突变的方法，包括如下步骤：将所述重组载体A导入出发植物，得到携带突变后的功能基因(纯合或杂合)的转基因植物。所述功能基因具体可为NRT1.1B基因。所述NRT1.1B基因为编码序列表的序列3所示蛋白质的基因。所述NRT1.1B基因如序列表的序列1或序列表的序列2所示。所述定点突变具体可为将NRT1.1B基因中编码序列表的序列3所示蛋白质第327位氨基酸残基的密码子由编码苏氨酸的密码子突变为了编码甲硫氨酸的密码子。所述目标核苷酸具体可为序列表的序列2第980位核苷酸。所述目标核苷酸具体可为序列表的序列1第3019位核苷酸。

本发明还保护一种向植物中的功能基因引入定点突变的方法，包括如下步骤：将所述重组载体A和所述游离供体片段导入出发植物，得到携带突变后的功能基因(纯合或杂合)的转基因植物。所述功能基因具体可为NRT1.1B基因。所述NRT1.1B基因为编码序列表的序列3所示蛋白质的基因。所述NRT1.1B基因如序列表的序列1或序列表的序列2所示。所述定点突变具体可为将NRT1.1B基因中编码序列表的序列3所示蛋白质第327位氨基酸残基的密码子由编码苏氨酸的密码子突变为了编码甲硫氨酸的密码子。所述目标核苷酸具体可为序列表的序列2第980位核苷酸。所述目标核苷酸具体可为序列表的序列1第3019位核苷酸。所述方法中，重组载体A和游离供体片段的摩尔比具体可为1：20。

本发明还保护一种对植物中的功能基因进行等位基因替换的重组载体(重组载体B)；

将所述功能基因中预期发生等位基因替换或等位基因片段替换的核苷酸区段命名为靶标区段；将功能基因中具有靶标区段的区段命名为目标区段；目标区段中，靶标区段的上游具有一个sgRNA靶标，靶标区段的下游具有另一个sgRNA靶标，将两个sgRNA分别命名为sgRNA3和sgRNA4；

所述重组载体B中包括如下元件：sgRNA3的编码序列、Cas9基因的表达盒、供体片段和sgRNA4的编码序列；Cas9基因的表达盒位于sgRNA3的编码序列和sgRNA4的编码序列之间；供体片段均位于sgRNA3的编码序列和sgRNA4的编码序列之间；

供体片段中包括如下元件：sgRNA3的靶标、突变区段、sgRNA4的靶标；突变区段位于sgRNA3的靶标和sgRNA4的靶标之间；

突变区段的一端为上游同源臂，另一端为下游同源臂，以实现与目标区段发生同源重组；所述突变区段与所述目标区段的区别包括如下①-③：①将靶标区段替换为了目的等位基因或目的等位基因片段；②将sgRNA3的靶标中的NGG突变为非NGG；③将sgRNA4的靶标中的NGG突变为非NGG。

所述目标区段中，sgRNA3的靶标和sgRNA4的靶标之间具有限制性内切酶的识别序列；所述突变区段与所述目标区段的区别还包括如下④：将所述限制性内切酶的识别序列突变为非识别序列。

所述sgRNA1具体如序列表的序列7所示。

所述sgRNA2具体如序列表的序列8所示。

本发明还保护一种对植物中的功能基因进行等位基因替换的系统(系统B)；所述系统B包括重组载体B和游离供体片段，所述游离供体片段与所述重组载体B中的供体片段序列一致。

所述系统B中，重组载体B和游离供体片段的摩尔比具体可为1：20。

本发明还保护以上任一所述重组载体B或以上任一所述系统B在对植物中的功能基因进行等位基因替换中的应用。所述功能基因具体可为NRT1.1B基因。所述NRT1.1B基因为编码序列表的序列3所示蛋白质的基因。所述NRT1.1B基因如序列表的序列1或序列表的序列2所示。

本发明还保护一种对植物中的功能基因进行等位基因替换的方法，包括如下步骤：将所述重组载体B导入出发植物，得到携带突变后的等位基因的基因编辑植物。所述功能基因具体可为NRT1.1B基因。所述NRT1.1B基因为编码序列表的序列3所示蛋白质的基因。所述NRT1.1B基因如序列表的序列1或序列表的序列2所示。

本发明还保护一种对植物中的功能基因进行等位基因替换的方法，包括如下步骤：将所述重组载体B和游离供体片段导入出发植物，得到携带突变后的等位基因的基因编辑植物；所述游离供体片段与所述重组载体B中的供体片段序列一致。所述功能基因具体可为NRT1.1B基因。所述NRT1.1B基因为编码序列表的序列3所示蛋白质的基因。所述NRT1.1B基因如序列表的序列1或序列表的序列2所示。所述方法中，重组载体B和游离供体片段的摩尔比具体可为1：20。

以上任一所述植物具体可为禾本科植物，具体可为水稻，例如中花11。

本发明以水稻NRT1.1B基因作为功能基因的示例，构建了CRISPR/Cas9介导的同源重组植物表达载体和体系，以期快速实现优异等位基因的片段替换。将重组载体和游离供体片段利用基因枪同时导入水稻，获得了NRT1.1B基因定点替换水稻植株，同源重组概率为6.72％(15/223)。本发明为农作物育种改良提供了一种可行、有效的定点基因片段或等位基因替换和整合的方法，为利用CRISPR/Cas9系统介导的同源重组系统改良其它重要农作物的农艺性状奠定了基础。因此，在快速进行农作物育种改良和新种质创制方面，具有较大的应用潜力和应用前景。

附图说明

图1为游离供体片段的结构示意图。

图2为重组质粒pCXUN-cas9-gRNA1-gRNA2-arm donor的结构示意图。

图3为部分植株的部分测序结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的水稻材料为中花11。如无特殊说明，实施例中的光暗交替培养均为16小时光照/8小时黑暗。

水稻基因组DNA中的NRT1.1B基因，如序列表的序列1所示(第927-2965位核苷酸为内含子)。cDNA中的开放阅读框如序列表的序列2所示，编码序列表的序列3所示的蛋白质。

实施例1、制备重组质粒pCXUN-cas9-gRNA1-gRNA2-arm donor和游离供体片段

游离供体片段如序列表的序列4所示。游离供体片段的结构示意图如图1所示。序列表的序列4中，第4-26位核苷酸为靶标1(Target1)[第4-23位核苷酸为sgRNA1的靶序列，第24-26位核苷酸为CGG]，第30-129位核苷酸为上游同源臂(Left Arm)，第130-152位核苷酸位突变后靶标1(Mutated target1)[第130-149位核苷酸为sgRNA1的靶序列，第150-152位核苷酸为CCG]，第155-157位核苷酸为ATG(编码甲硫氨酸)[即引起蛋白中的T327M突变]，第296-301位核苷酸为GAACTC(Mutated SacⅠ)[即将原有的限制性内切酶SacⅠ“GAGCTC”突变掉了]，第358-380位核苷酸为突变后靶标2(Mutatedtarget2)[第358-360位核苷酸为TCT(其反向互补序列为AGA)，第361-380位核苷酸为sgRNA2的靶序列]，第381-480位核苷酸为下游同源臂(Right Arm)，第484-506位核苷酸为靶标2(Target2)[第484-486位核苷酸为CCT(其反向互补序列为AGG)，第487-506位核苷酸为sgRNA2的靶序列]。游离供体片段与水稻基因组DNA发生同源重组后，水稻基因组DNA中的NRT1.1B基因中序列表的序列5所示片段被游离供体片段中序列表的序列4第30-480位所示片段取代。

重组质粒pCXUN-cas9-gRNA1-gRNA2-arm donor的全序列如序列表的序列6所示。重组质粒pCXUN-cas9-gRNA1-gRNA2-arm donor的结构示意图如图2所示。序列表的序列6中，第13-393位核苷酸为U3启动子，第394-496位核苷酸编码sgRNA2，第615-867位核苷酸为Nos终止子的反向互补序列，第892-5022位核苷酸为Cas9基因的反向互补序列，第5043-7033位核苷酸为Ubi启动子的反向互补序列，第7064-7572位核苷酸为所述游离供体片段，第7833-8213位核苷酸为U3启动子，第8214-8316位核苷酸编码sgRNA1。

sgRNA1如序列表的序列7所示。sgRNA2如序列表的序列8所示。

实施例2、应用重组质粒pCXUN-cas9-gRNA1-gRNA2-arm donor和游离供体片段在NRT1.1B基因中引入定点突变

一、转基因水稻的获得

1、取饱满的中花11种子，剥去种皮，依次进行灭菌和洗涤，然后置于诱导培养基上，28℃黑暗培养40-50天以诱导愈伤组织的产生。

诱导培养基：含2mg/L 2,4-D的固体NB培养基。

2、完成步骤1后，取愈伤组织，在高渗培养基上处理4-6小时，

高渗培养基：含0.3M甘露醇和0.3M山梨醇的固体NB培养基。

3、将重组质粒pCXUN-cas9-gRNA1-gRNA2-arm donor和游离供体片段按照1：20的摩尔比混合，然后采用基因枪轰击完成步骤2的愈伤组织(采用0.6μm金粉，轰击压力为900psi)。

4、取完成步骤3的愈伤组织，在高渗培养基上28℃黑暗培养16小时

5、取完成步骤4的愈伤组织，置于筛选培养基上，28℃黑暗培养2周。

筛选培养基：含2mg/L 2,4-D、50mg/L潮霉素的固体NB培养基。

6、完成步骤5后，取生长良好呈嫩黄色的阳性愈伤组织，转移到预分化培养基培养基上，28℃光照培养2周。

预分化培养基：含1mg/LNAA、5mg/LABA、2mg/Lkinetin、50mg/L潮霉素的固体NB培养基。

7、完成步骤6后，取生长旺盛的愈伤组织，转移到分化培养基上，28℃光照培养至苗高为2-5mm。

分化培养基：含0.02mg/LNAA、2mg/Lkinetin、0.4μM Bispyribac-sodium的固体MS培养基。

8、完成步骤7后，将幼苗转移至固体MS培养基，28℃光暗交替培养2-3周。

9、完成步骤8后，将植株转移至温室中，28-30℃光暗交替培养。

以上得到的再生植株为T₀代再生植株。

二、对T₀代再生植株的基因型鉴定(定点编辑的检测)

对步骤一得到的223株T₀代再生植株进行鉴定。223株植株均采用数字编号，每一数字对应一个植株。

游离供体片段中引入了T327M突变，且中间不再具有限制性内切酶Sac I的识别序列。游离供体片段与水稻基因组DNA发生同源重组后，水稻基因组DNA中的NRT1.1B基因中序列表的序列5所示片段被游离供体片段中序列表的序列4第30-480位所示片段取代。

1、以T₀代再生植株的基因组DNA为模板，采用NRTtestF和NRTtestR组成的引物对进行PCR扩增。

NRTtestF：GTTGATGTCACCTGATGATCTGAAG；

NRTtestR：GAGCTGGCCCATGTAGGT。

2、用限制性内切酶Sac I酶切步骤2得到的PCR扩增产物，然后进行电泳。如果可以被有效酶切、将得到544bp和337bp的两种DNA片段。如果不能被酶切、将保持为881bp的一种DNA片段。PCR扩增产物不能被有效酶切(包括两条链均不能被酶切的纯合体，也包括只有一条链不能被酶切的杂合体)即为发生同源重组的植株。

223株T₀代再生植株中，1株植株为发生同源重组的纯合体，14株植株为发生同源重组的杂合体，另外还有3株植株的NRT1.1B基因的一条染色体的第二个靶点发生同源重组(部分同源重组)，其余植株为未发生同源重组的植株(包括反向互补类型、随机插入缺失类型、野生型)。

3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行测序。

部分植株的部分测序结果见图3。WT NRT1.1B为中花11(野生型基因型)。Donor为游离供体片段。下划线序列分别为gRNA1和gRNA2靶点序列。i#和d#中的#代表插入或者缺失碱基类型。

全部植株的鉴定结果见表1。

173、174、175、176、177、179、181、182、192、193、194、195、196和197均为杂合同源重组株系，一条染色体发生了同源重组，另外一条染色体发生随机插入和缺失类型。46和48为杂合部分同源重组株系，一条染色体发生了部分同源重组(第一个靶点发生随机插入和缺失，第二个靶点发生同源重组)，另一条染色体的两个靶点均发生随机插入和缺失。149为嵌合体株系，发现三种类型，其中一种类型为同源重组类型。其余植株在两个靶点均发生非同源重组。

表1

三、CRISPR/Cas9脱靶分析

对15颗植株(纯合同源重组类型的1株和杂合同源重组类型的14株)进行靶标1和靶标2的脱靶情况的鉴定，具体步骤为：提取植株的基因组DNA，采用特异引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序。

靶标1存在两个可能脱靶的位点，NRT1-OFF1和NRT1-OFF2。靶标2存在三个可能脱靶的位点，NRT2-OFF1、NRT2-OFF2和NRT2-OFF3。

用于各个脱靶位点的引物对见表2。

表2

结果见表3。sgRNA1和sgRNA2并不存在脱靶情况。

表3

以上结果表明，采用本发明提供的方法可以有效实现CRISPR/Cas9介导的同源重组对内源功能基因的等位基因定点替换，重组效率达6.72％。本发明为农作物育种提供了一种可行的有效的等位基因定点替换方法，在农业育种改良方面具有较大的应用潜力和应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种CRISPR介导快速有效的农作物定点基因片段或等位基因替换方法和体系

<130> GNCYX171887

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3830

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atggcgatgg tgttgccgga gacggcggcg gaggggaagg cgctgacgga cgcgtgggac 60

tacaagggga ggccggcggg gagggcggcc accggcgggt ggggctgcgc ggcgatgatc 120

ctcggggcgg agctgttcga gcggatgacg acgctgggca tcgccgtcaa cctggtgccg 180

tacatgaccg ggacgatgca cctcggcaat gccgccgccg ccaacacggt caccaacttc 240

atcggcacct ccttcatgct ctgcctcctc ggcggcttcg tcgccgacac ctacctcggc 300

cgctacctca ccatcgccat cttcgaggcc gtccaggcca ccggcgtgat gatactcacg 360

atctccacgg cggcgccggg gctgcggccg ccggcgtgcg gcgacccgaa gggggcgagc 420

gcggagtgcg tggcggcgga cgggacgcag ctcggggtgc tctacctggg gctctacctg 480

acggcgctgg gcacgggggg gctcaagtcc agcgtctccg gcttcggctc cgaccagttc 540

gacgagtccg acgtcgacgg cgagaggaag aagatgatgc gcttcttcaa ctggttctac 600

ttcttcgtca gcctcggcgc gctgctcgcc gtcaccgtgc tggtgtacgt gcaggacaac 660

gtcggacgcc ggtgggggta cggcatctgc gccgccggca tcctcgccgg cctcgccgtg 720

ttcctctccg ggaccaggag gtacaggttc aagaagctgg tggggagccc cctcacccag 780

gtcgccgccg tcaccgccgc cgcctggagc aagaggtcgc tgccgctgcc gtccgaccca 840

gacatgctct acgacgtcga cgacgccgcc gccgccggcc atgacgtcaa gggcaagcag 900

aggatgccac acagcaagga gtgccggtaa gttcaccacc cactctgcat ctttagtatt 960

cagataaagt ttttttacat tattacccca acacaaaact agccggtaag ttcagatgaa 1020

ttttgatgaa attaatttga acgagttata tataggatca agatgcatat gcatcattca 1080

tgtgggccac gcattgacac aaatctagta atagtgctac tagtagtcag ttttaattta 1140

gcatatatag caagccaggt tgtaggaaaa tgaatgaaat taaattaaat tcataatata 1200

tattctacct ccatcccata acaacttagt agtagctagg agtagagaac gagacatata 1260

ctattactac gaatgtgttc agatttatag tattagaata tatttcatca tgtattagat 1320

tgctatgtta cgagatggag cgagtatatt cagggagttc atgattggag gcacgcactg 1380

tttggcccgt tgctgtgaca tttgcaacca cacccctctt aagaaaatca tcttcatttt 1440

gacagctgaa accactccag ccactcactg tcatatatag acagatagat atacggtctc 1500

gcaagcctgt aggtgtgtat atacttggac cagcactact agatatctaa accattaagg 1560

taggtcaaat caagttattt ttaggaagcc taataagtag cccagtccca acgacgtatg 1620

gtcgcagcca tctgccaggt atatagctag agtcgacata cacatgccca taagtaaatt 1680

aaagtggagt acgtgcagaa agcaaaggcc ctttgaccct gaacattaac aaagtcggta 1740

gaggcaagat tgattctagc atgatacgat ggacgagtca cacagaatca aaaccaaagc 1800

agagtaggag ttgctaagtg aagatgagca ctgggcgagg tagcacctcc tcctccacat 1860

agtgacatcc catgcgtaca taacacagtg gcttattagc cagtacatgt acaaacacga 1920

agatgcattt gcatgtgccg cgacccagtg accgatagct tcagctattc tcccaacaaa 1980

ttcctccttt ctccagtgga aactagcaga gccctgaacc tgccttggtc acgggtcgcg 2040

gcagcatctc gcgtgacaaa tatcacatgc gacgcggcgc tgcatacgca cgcacgcccg 2100

tgtgcgtgtg attgatcagc tgcttggaac ttctccctct tgcctatctc aactcatcta 2160

gctcttcccg caaaaaaaaa ccctcatcta gctctttgcg tctgcgtgat gcaacgtacg 2220

tacgacacac cggccgctac aaagacttgg atcttgcagt ggcggtagct accgcgctgc 2280

tacgtgcgca tggctgctcc cttgtttgca cgcgcctact ataccttcct cttacttaag 2340

tccagtgact attagatctt cccgcaaaag aaaaaaaaac tgttagatca ctaatgtatg 2400

agactgtagc aaagtaaatt tatatgtcag cgactcaaaa ttaagtaact taagtcgaag 2460

aatccgcatc catgaataaa cattgtgtgg tttatcttag ctaacacaat tctaactcat 2520

ctcaaaattt aaatgcattt tttaggtttt taatatttga ttcatccatt tctgcctttg 2580

gaaaaataac atgacaagat gagaataatc tataatctag ttgatgtcac ctgatgatct 2640

gaagtagcac tacaataatc cgtaattttt tggtggtcaa aaaccatcaa gtataacatg 2700

aaaaccgcca aaattcatta ttctatcggc cgtctaggga tattcatatt tgttggctgc 2760

taaccataag agaatatttt tttgttagtc ggaccactaa gcaaattaaa aatattacga 2820

actttataac tttgtcggtt tggaccgata agaatatatc ttactttggc tgccaagaaa 2880

caccacaaga aaattactta tttttgaccg ttagaaccac caaggtaata atcattgacg 2940

tgtttggttt gtaatatggg tgcaggttcc tggaccatgc ggcgatcatc gacaggtcgg 3000

cggcggagtc gccggcgacg gcgagcaagt ggaggctgtg cacgaggacg gacgtggagg 3060

aggtgaagca ggtggtgcgg atgctcccca tctgggcgac caccatcatg ttctggacca 3120

tccacgccca gatgaccacc ttcgccgtcg cgcaggccga gctcatggac cgccgcctcg 3180

ccggcggctt cctcatcccg gcgggctccc tcaccgtctt cctcatcgcc tccatcctcc 3240

tcaccgtccc cttctacgac cgcctcgtcg tccccgtcgc gcgccgcgcc acggccaacc 3300

cgcacggcct caccccgctc cagcgcgtct tcgtgggcct ctccctctcc atcgccggca 3360

tggccgtcgc cgcggccgtc gagcgccacc gcgccaccgc ctccgcctcc gccgccgccg 3420

ccgcgcccac ggtgttcctc ctcatgccgc agttcctcct cgtcggcgcc ggcgaggcgt 3480

tcacctacat gggccagctc gacttcttcc tccgcgagtg ccccaagggg atgaagacca 3540

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tcaccatcgt ccacaaggtc accggccatg gcgcccgcgg cggcggctgg ctcgccgaca 3660

acctcgacga cggcaggctc gactacttct actggctgct cgccgtcatc agcgccatca 3720

acctcgtcct cttcaccgtc gccgccaggg ggtacgtcta caaggagaag cgcctcgccg 3780

acgccggcat cgagctcgcc gacgaggaga ccatcgccgt cggccactaa 3830

<210> 2

<211> 1791

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggcgatgg tgttgccgga gacggcggcg gaggggaagg cgctgacgga cgcgtgggac 60

tacaagggga ggccggcggg gagggcggcc accggcgggt ggggctgcgc ggcgatgatc 120

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tacatgaccg ggacgatgca cctcggcaat gccgccgccg ccaacacggt caccaacttc 240

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atctccacgg cggcgccggg gctgcggccg ccggcgtgcg gcgacccgaa gggggcgagc 420

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atccacgccc agatgaccac cttcgccgtc gcgcaggccg agctcatgga ccgccgcctc 1140

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<210> 3

<211> 596

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 3

Met Ala Met Val Leu Pro Glu Thr Ala Ala Glu Gly Lys Ala Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Trp Asp Tyr Lys Gly Arg Pro Ala Gly Arg Ala Ala Thr Gly

20 25 30

Gly Trp Gly Cys Ala Ala Met Ile Leu Gly Ala Glu Leu Phe Glu Arg

35 40 45

Met Thr Thr Leu Gly Ile Ala Val Asn Leu Val Pro Tyr Met Thr Gly

50 55 60

Thr Met His Leu Gly Asn Ala Ala Ala Ala Asn Thr Val Thr Asn Phe

65 70 75 80

Ile Gly Thr Ser Phe Met Leu Cys Leu Leu Gly Gly Phe Val Ala Asp

85 90 95

Thr Tyr Leu Gly Arg Tyr Leu Thr Ile Ala Ile Phe Glu Ala Val Gln

100 105 110

Ala Thr Gly Val Met Ile Leu Thr Ile Ser Thr Ala Ala Pro Gly Leu

115 120 125

Arg Pro Pro Ala Cys Gly Asp Pro Lys Gly Ala Ser Ala Glu Cys Val

130 135 140

Ala Ala Asp Gly Thr Gln Leu Gly Val Leu Tyr Leu Gly Leu Tyr Leu

145 150 155 160

Thr Ala Leu Gly Thr Gly Gly Leu Lys Ser Ser Val Ser Gly Phe Gly

165 170 175

Ser Asp Gln Phe Asp Glu Ser Asp Val Asp Gly Glu Arg Lys Lys Met

180 185 190

Met Arg Phe Phe Asn Trp Phe Tyr Phe Phe Val Ser Leu Gly Ala Leu

195 200 205

Leu Ala Val Thr Val Leu Val Tyr Val Gln Asp Asn Val Gly Arg Arg

210 215 220

Trp Gly Tyr Gly Ile Cys Ala Ala Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ala Val

225 230 235 240

Phe Leu Ser Gly Thr Arg Arg Tyr Arg Phe Lys Lys Leu Val Gly Ser

245 250 255

Pro Leu Thr Gln Val Ala Ala Val Thr Ala Ala Ala Trp Ser Lys Arg

260 265 270

Ser Leu Pro Leu Pro Ser Asp Pro Asp Met Leu Tyr Asp Val Asp Asp

275 280 285

Ala Ala Ala Ala Gly His Asp Val Lys Gly Lys Gln Arg Met Pro His

290 295 300

Ser Lys Glu Cys Arg Phe Leu Asp His Ala Ala Ile Ile Asp Arg Ser

305 310 315 320

Ala Ala Glu Ser Pro Ala Thr Ala Ser Lys Trp Arg Leu Cys Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Val Glu Glu Val Lys Gln Val Val Arg Met Leu Pro Ile Trp

340 345 350

Ala Thr Thr Ile Met Phe Trp Thr Ile His Ala Gln Met Thr Thr Phe

355 360 365

Ala Val Ala Gln Ala Glu Leu Met Asp Arg Arg Leu Ala Gly Gly Phe

370 375 380

Leu Ile Pro Ala Gly Ser Leu Thr Val Phe Leu Ile Ala Ser Ile Leu

385 390 395 400

Leu Thr Val Pro Phe Tyr Asp Arg Leu Val Val Pro Val Ala Arg Arg

405 410 415

Ala Thr Ala Asn Pro His Gly Leu Thr Pro Leu Gln Arg Val Phe Val

420 425 430

Gly Leu Ser Leu Ser Ile Ala Gly Met Ala Val Ala Ala Ala Val Glu

435 440 445

Arg His Arg Ala Thr Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Pro Thr

450 455 460

Val Phe Leu Leu Met Pro Gln Phe Leu Leu Val Gly Ala Gly Glu Ala

465 470 475 480

Phe Thr Tyr Met Gly Gln Leu Asp Phe Phe Leu Arg Glu Cys Pro Lys

485 490 495

Gly Met Lys Thr Met Ser Thr Gly Leu Phe Leu Ser Thr Cys Ala Ile

500 505 510

Gly Phe Phe Phe Ser Thr Leu Leu Val Thr Ile Val His Lys Val Thr

515 520 525

Gly His Gly Ala Arg Gly Gly Gly Trp Leu Ala Asp Asn Leu Asp Asp

530 535 540

Gly Arg Leu Asp Tyr Phe Tyr Trp Leu Leu Ala Val Ile Ser Ala Ile

545 550 555 560

Asn Leu Val Leu Phe Thr Val Ala Ala Arg Gly Tyr Val Tyr Lys Glu

565 570 575

Lys Arg Leu Ala Asp Ala Gly Ile Glu Leu Ala Asp Glu Glu Thr Ile

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Ala Val Gly His

595

<210> 4

<211> 509

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

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<210> 5

<211> 451

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

attacttatt tttgaccgtt agaaccacca aggtaataat cattgacgtg tttggtttgt 60

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<210> 6

<211> 17029

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

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taatttagag gctaaaatag aataaaatag atgtactaaa aaaattagtc tataaaaacc 6660

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aggtgaagca ggtggtgcgg atgctcccca tctgggcgac caccatcatg ttctggacca 7320

tccacgccca gatgaccacc ttcgccgtcg cgcaggccga actcatggac cgccgcctcg 7380

ccggcggctt cctcatcccg gcgggctccc tcaccgtctt tctcatcgcc tccatcctcc 7440

tcaccgtccc cttctacgac cgcctcgtcg tccccgtcgc gcgccgcgcc acggccaacc 7500

cgcacggcct caccccgctc cagcgcgtct tcgtgggcct ctccttcctc atcgcctcca 7560

tcctcctcac cgggcgtaat catggtcata gctgtttcct gggcactggc cgtcgtttta 7620

caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 7680

cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 7740

cgcagcctga atggcgaatg ctagagcagc ttgagcttgg atcagattgt cgtttcccgc 7800

cttcagtttt gcatgcctgc aggtcgacga ttaaggaatc tttaaacata cgaacagatc 7860

acttaaagtt cttctgaagc aacttaaagt tatcaggcat gcatggatct tggaggaatc 7920

agatgtgcag tcagggacca tagcacaaga caggcgtctt ctactggtgc taccagcaaa 7980

tgctggaagc cgggaacact gggtacgttg gaaaccacgt gatgtgaaga agtaagataa 8040

actgtaggag aaaagcattt cgtagtgggc catgaagcct ttcaggacat gtattgcagt 8100

atgggccggc ccattacgca attggacgac aacaaagact agtattagta ccacctcggc 8160

tatccacata gatcaaagct gatttaaaag agttgtgcag atgatccgtg gcacaggtcg 8220

gcggcggagt cgcgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 8280

aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct ttttttccac ataatctcta gaggatccaa 8340

actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta 8400

gaataacgga tatttaaaag ggcgtgaaaa ggtttatccg ttcgtccatt tgtatgtgca 8460

tgccaaccac agggttcccc tcgggatcaa agtactttga tccaacccct ccgctgctat 8520

agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag 8580

tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt 8640

tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac tagaaccgga gacattacgc catgaacaag 8700

agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc 8760

aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc 8820

ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc aggatgcttg accacctagc cctggcgacg 8880

ttgtgacagt gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac ccgcgaccta ctggacattg 8940

ccgagcgcat ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct ggcagagccg tgggccgaca 9000

ccaccacgcc ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc cggcattgcc gagttcgagc 9060

gttccctaat catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc cgccaaggcc cgaggcgtga 9120

agtttggccc ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc gcacgcccgc gagctgatcg 9180

accaggaagg ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct tggcgtgcat cgctcgaccc 9240

tgtaccgcgc acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac cgaggccagg cggcgcggtg 9300

ccttccgtga ggacgcattg accgaggccg acgccctggc ggccgccgag aatgaacgcc 9360

aagaggaaca agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac gaaccgtttt tcattaccga 9420

agagatcgag gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc gagccgcccg cgcacgtctc 9480

aaccgtgcgg ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat gccaagctgg cggcctggcc 9540

ggccagcttg gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta aaaaggtgat gtgtatttga 9600

gtaaaacagc ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg cgatgagtaa ataaacaaat 9660

acgcaagggg aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc agaaaggcgg gtcaggcaag 9720

acgaccatcg caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg ccggggccga tgttctgtta 9780

gtcgattccg atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg ccgtgcggga agatcaaccg 9840

ctaaccgttg tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg acgtgaaggc catcggccgg 9900

cgcgacttcg tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg acttggctgt gtccgcgatc 9960

aaggcagccg acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc cttacgacat atgggcaacc 10020

gccgacctgg tggagctggt taagcagcgc attgaggtca cggatggaag gctacaagcg 10080

gcctttgtcg tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg gcggtgaggt tgccgaggcg 10140

ctggccgggt acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca cgcagcgcgt gagctaccca 10200

ggcactgccg ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac ccgagggcga cgctgcccgc 10260

gaggtccagg cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca tttgagttaa tgaggtaaag 10320

agaaaatgag caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg tccgagcgca cgcagcagca 10380

aggctgcaac gttggccagc ctggcagaca cgccagccat gaagcgggtc aactttcagt 10440

tgccggcgga ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt acgccaaggc aagaccatta 10500

ccgagctgct atctgaatac atcgcgcagc taccagagta aatgagcaaa tgaataaatg 10560

agtagatgaa ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa atcaagaaca accaggcacc 10620

gacgccgtgg aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt ggccaggcgt aagcggctgg 10680

gttgtctgcc ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc ccgaggaatc ggcgtgacgg 10740

tcgcaaacca tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc tggtggagaa 10800

gttgaaggcc gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac gccccggtga 10860

atcgtggcaa gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc cggcagccgg 10920

tgcgccgtcg attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt tcgttccgat 10980

gctctatgac gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg ttttccgtct 11040

gtcgaagcgt gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag acgggcacgt 11100

agaggtttcc gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc tggtactgat 11160

ggcggtttcc catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg gagacaagcc 11220

cggccgcgtg ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc gagccgatgg 11280

cggaaagcag aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca cgcacgttgc 11340

catgcagcgt acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg agggtgaagc 11400

cttgattagc cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt acatcgagat 11460

cgagctagct gattggatgt accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg acgtgctgac 11520

ggttcacccc gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct accgcctggc 11580

acgccgcgcc gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc aagacgatct acgaacgcag 11640

tggcagcgcc ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga tcgggtcaaa 11700

tgacctgccg gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga tcctagtcat 11760

gcgctaccgc aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta cggagcagat 11820

gctagggcaa attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa ggtctctttc ctgtggatag 11880

cacgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca ttgggaaccc 11940

aaagccgtac attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag agaaaaaagg 12000

cgatttttcc gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc gcctggcctg 12060

tgcataactg tctggccagc gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta cccttcggtc 12120

gctgcgctcc ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg gccgctcaaa 12180

aatggctggc ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc cgtcgccact 12240

cgaccgccgg cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa 12300

acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga 12360

gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga 12420

cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat 12480

tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 12540

ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 12600

gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 12660

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 12720

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 12780

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 12840

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 12900

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 12960

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 13020

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 13080

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 13140

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 13200

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 13260

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 13320

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 13380

ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata 13440

ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg 13500

ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc 13560

cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat 13620

gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt 13680

taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca 13740

atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa 13800

gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc 13860

atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac 13920

gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac 13980

ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttcaacatc 14040

ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc 14100

caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt 14160

ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc 14220

tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat 14280

tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt 14340

tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg gtgatcacag 14400

gcagcaacgc tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt 14460

tcaaacccgg cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct 14520

gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg cctgtatcga 14580

gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggctggt ggcaggatat 14640

attgtggtgt aaacaaattg acgcttagac aacttaataa cacattgcgg acgtttttaa 14700

tgtactgaat taacgccgaa ttaattcggg ggatctggat tttagtactg gattttggtt 14760

ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa tacaaataca tactaagggt 14820

ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac cctaattccc ttatctggga 14880

actactcaca cattattatg gagaaactcg agcttgtcga tcgacagatc cggtcggcat 14940

ctactctatt tctttgccct cggacgagtg ctggggcgtc ggtttccact atcggcgagt 15000

acttctacac agccatcggt ccagacggcc gcgcttctgc gggcgatttg tgtacgcccg 15060

acagtcccgg ctccggatcg gacgattgcg tcgcatcgac cctgcgccca agctgcatca 15120

tcgaaattgc cgtcaaccaa gctctgatag agttggtcaa gaccaatgcg gagcatatac 15180

gcccggagtc gtggcgatcc tgcaagctcc ggatgcctcc gctcgaagta gcgcgtctgc 15240

tgctccatac aagccaacca cggcctccag aagaagatgt tggcgacctc gtattgggaa 15300

tccccgaaca tcgcctcgct ccagtcaatg accgctgtta tgcggccatt gtccgtcagg 15360

acattgttgg agccgaaatc cgcgtgcacg aggtgccgga cttcggggca gtcctcggcc 15420

caaagcatca gctcatcgag agcctgcgcg acggacgcac tgacggtgtc gtccatcaca 15480

gtttgccagt gatacacatg gggatcagca atcgcgcata tgaaatcacg ccatgtagtg 15540

tattgaccga ttccttgcgg tccgaatggg ccgaacccgc tcgtctggct aagatcggcc 15600

gcagcgatcg catccatagc ctccgcgacc ggttgtagaa cagcgggcag ttcggtttca 15660

ggcaggtctt gcaacgtgac accctgtgca cggcgggaga tgcaataggt caggctctcg 15720

ctaaactccc caatgtcaag cacttccgga atcgggagcg cggccgatgc aaagtgccga 15780

taaacataac gatctttgta gaaaccatcg gcgcagctat ttacccgcag gacatatcca 15840

cgccctccta catcgaagct gaaagcacga gattcttcgc cctccgagag ctgcatcagg 15900

tcggagacgc tgtcgaactt ttcgatcaga aacttctcga cagacgtcgc ggtgagttca 15960

ggctttttca tatctcattg ccccccggat ctgcgaaagc tcgagagaga tagatttgta 16020

gagagagact ggtgatttca gcgtgtcctc tccaaatgaa atgaacttcc ttatatagag 16080

gaaggtcttg cgaaggatag tgggattgtg cgtcatccct tacgtcagtg gagatatcac 16140

atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg 16200

tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc 16260

ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga 16320

agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa 16380

aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga 16440

gagtgtcgtg ctccaccatg ttatcacatc aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa 16500

cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg 16560

cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg taggtgccac 16620

cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga 16680

ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc cctttggtct tctgagactg 16740

tatctttgat attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc caccatgttg gcaagctgct 16800

ctagccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 16860

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 16920

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 16980

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattac 17029

<210> 7

<211> 103

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

caggucggcg gcggagucgc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 8

<211> 103

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

ugaggaggau ggaggcgaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

Claims

1.一种重组载体；所述重组载体为向植物中的功能基因引入定点突变的重组载体A或对植物中的功能基因进行等位基因替换的重组载体B；

将所述功能基因中预期引入定点突变的核苷酸命名为目标核苷酸；将所述功能基因中具有目标核苷酸的区段命名为目标区段；目标区段中，目标核苷酸的上游具有一个sgRNA靶标，目标核苷酸的下游具有另一个sgRNA靶标，将两个sgRNA分别命名为sgRNA1和sgRNA2；所述重组载体A中包括如下元件：sgRNA1的编码序列、Cas9基因的表达盒、供体片段和sgRNA2的编码序列；Cas9基因的表达盒位于sgRNA1的编码序列和sgRNA2的编码序列之间；供体片段均位于sgRNA1的编码序列和sgRNA2的编码序列之间；供体片段中包括如下元件：sgRNA1的靶标、突变区段、sgRNA2的靶标；突变区段位于sgRNA1的靶标和sgRNA2的靶标之间；突变区段的一端为上游同源臂，另一端为下游同源臂，以实现与目标区段发生同源重组；所述突变区段与所述目标区段的区别包括如下①-③：①将目标核苷酸替换为了突变后核苷酸；②将sgRNA1的靶标中的NGG突变为非NGG；③将sgRNA2的靶标中的NGG突变为非NGG；

将所述功能基因中预期发生等位基因替换或等位基因片段替换的核苷酸区段命名为靶标区段；将功能基因中具有靶标区段的区段命名为目标区段；目标区段中，靶标区段的上游具有一个sgRNA靶标，靶标区段的下游具有另一个sgRNA靶标，将两个sgRNA分别命名为sgRNA3和sgRNA4；所述重组载体B中包括如下元件：sgRNA3的编码序列、Cas9基因的表达盒、供体片段和sgRNA4的编码序列；Cas9基因的表达盒位于sgRNA3的编码序列和sgRNA4的编码序列之间；供体片段均位于sgRNA3的编码序列和sgRNA4的编码序列之间；供体片段中包括如下元件：sgRNA3的靶标、突变区段、sgRNA4的靶标；突变区段位于sgRNA3的靶标和sgRNA4的靶标之间；突变区段的一端为上游同源臂，另一端为下游同源臂，以实现与目标区段发生同源重组；所述突变区段与所述目标区段的区别包括如下①-③：①将靶标区段替换为了目的等位基因或目的等位基因片段；②将sgRNA3的靶标中的NGG突变为非NGG；③将sgRNA4的靶标中的NGG突变为非NGG。

2.如权利要求1所述的重组载体A，其特征在于：所述目标区段中，sgRNA1的靶标和sgRNA2的靶标之间具有限制性内切酶的识别序列；所述突变区段与所述目标区段的区别还包括如下④：将所述限制性内切酶的识别序列突变为非识别序列。

3.如权利要求1所述的重组载体B，其特征在于：所述目标区段中，sgRNA3的靶标和sgRNA4的靶标之间具有限制性内切酶的识别序列；所述突变区段与所述目标区段的区别还包括如下④：将所述限制性内切酶的识别序列突变为非识别序列。

4.如权利要求1所述的重组载体A，其特征在于：所述重组载体A如序列表的序列6所示。

5.一种系统，为向植物中的功能基因引入定点突变的系统A或对植物中的功能基因进行等位基因替换的系统B；所述系统A包括重组载体和游离供体片段，所述重组载体为权利要求1或2所述的重组载体A,所述游离供体片段与所述重组载体A中的供体片段序列一致；所述系统B包括重组载体和游离供体片段，所述重组载体为权利要求1或3所述的重组载体B,所述游离供体片段与所述重组载体B中的供体片段序列一致。

6.如权利要求5所述的系统A，其特征在于：所述重组载体A如序列表的序列6所示；所述供游离体片段如序列表的序列4所示。

7.权利要求1或2或4所述重组载体A或权利要求5或6所述系统A在向植物中的功能基因引入定点突变中的应用，或者，权利要求1或3所述重组载体B或权利要求5所述系统B在对植物中的功能基因进行等位基因替换中的应用。

8.一种向植物中的功能基因引入定点突变的方法，包括如下步骤：将权利要求1或2或4所述重组载体A导入出发植物，得到携带突变后的功能基因的基因编辑植物。

9.一种向植物中的功能基因引入定点突变的方法，包括如下步骤：将重组载体和游离供体片段导入出发植物，得到携带突变后的功能基因的基因编辑植物；所述重组载体为权利要求1或2或4所述重组载体A；所述游离供体片段与所述重组载体A中的供体片段序列一致。

10.一种对植物中的功能基因进行等位基因替换的方法，包括如下步骤：

将权利要求1或3所述重组载体B导入出发植物，得到携带突变后的等位基因的基因编辑植物；

或者，

将权利要求1或3所述重组载体B和游离供体片段导入出发植物，得到携带突变后的等位基因的基因编辑植物；所述游离供体片段与所述重组载体B中的供体片段序列一致。