CN108546712B - 一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法。本发明以水稻ALS基因为研究对象，构建了同源重组载体。载体甲采用OsU3作为启动子，启动crRNAs的转录，且载体中的修复模板只含有左侧同源臂。载体乙同样采用OsU3作为启动子，启动crRNAs的转录，但载体中的修复模板含有两个同源臂。利用基因枪方法将载体与外源片段同时转入水稻愈伤中，获得了ALS基因定点修饰的水稻植株。研究结果一方面表明，当双链DNA作为修复模板时，细胞采用SDSA模型进行同源重组修复，且当修复模板中只含有左侧同源重组臂时同样可成功介导目的基因的同源重组，此策略使得载体构建更为简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法。
背景技术
CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经成为分子生物学中最强大的工具之一，首次在细菌中发现，由sgRNA和Cas9两部分组成。CRISPR/Cas系统是通过自身的核酸内切酶活性引起基因组靶位点DNA序列双链断裂(double-strand breaks，DSBs)，然后通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组介导的修复(homology-directed repair，HDR)两种方式引入突变。细胞通过NHEJ途径进行修复时，通常会导致小片段的插入或缺失，从而导致基因功能丧失，因此常用于目的基因的功能研究。而HDR不同于NHEJ，此修复途径通常需要DNA修复模板的参与，根据HDR途径的修复特点，已将发展成为一种有效的基因组编辑工具：对靶基因进行定点修饰或定点插入外源基因，从而改良生物性状。鉴于HDR的重要性，众多学者对其作用机制进行了探究。目前，围绕HDR如何对基因组中的DSBs进行修复这一问题，主要提出了SSA，SDSA和DSBR三种修复模型。在SDSA修复模型中，切割产生的DSB缺口被核酸酶再次切割，并在DSB的两侧产生3’端突出，随后3’突出端与修复模板中的同源臂进行碱基互补配对，并以修复模板作为DNA合成模板，继续DNA的修复合成，最后新合成的DNA链与修复模板解链，与基因组中的互补链配对。当细胞采用HDR途径进行DNA修复时，若修复模板为单链DNA，细胞仍采用SDSA机制进行重组修复；若修复模板为双链DNA，细胞中不同的DSBs一般采用不同的修复途径进行修复，且在人类细胞中，细胞具体采用何种途径进行修复主要由DSBs的两侧产生3’突出端的结构决定，但无论是单链还是双链DNA作为修复模板，HDR途径采用的主要修复模型仍是SDSA。而在植物细胞中，细胞以双链DNA作为模板，如何通过HDR途径修复DSBs仍需要进一步的研究。
CRISPR/Cpf1，属于第二类CRISPR/Cas系统，一经发现便被广泛应用于动植物基因组编辑的研究中。CRISPR/Cpf1系统由crRNA和Cpf1蛋白两部分组成，Cpf1蛋白对“TTTN”的PAM位点进行识别，在crRNA的引导下对基因组DNA的靶位点进行切割。与CRISPR/Cas9系统相比，CRISPR/Cpf1系统有众多优势：Cpf1只需单个RNA，即crRNA(CRISPR RNA)，crRNA长度为43nt，且切割无需tracrRNA的帮助，因而组装更加简单；因其识别的PAM位点为“TTTN”，因此可识别富含AT的5’和3’UTR区域；一次可对多种靶位点进行编辑，实现简单的基因多重编辑，同时具有更高的编辑效率和较低的脱靶效应。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法。
本发明提供了一种用于取代植物基因组中的目标片段的重组载体，包括如下元件甲、元件乙和元件丙；
所述元件甲包括启动子甲、区段Ⅰ和区段Ⅱ；
区段Ⅰ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA1的编码序列；
区段Ⅱ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA2的编码序列；
所述元件乙为表达盒；所述表达盒中由启动子乙启动LbCpf1核酸酶的编码基因表达；
所述元件丙为元件丙-1或元件丙-2；
所述元件丙-1中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段A；
所述模板区段A包括上游同源臂和供体片段序列；
所述元件丙-2中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段B；
所述模板区段B包括上游同源臂、供体片段序列和下游同源臂；
所述目标片段的一个末端为区段Ⅰ中crRNA1的靶标序列，另一个末端为区段Ⅱ中crRNA2的靶标序列；
供体片段与目标片段具有如下差异：①预期在目标片段中引入的差异核苷酸；②将crRNA1的靶标中的TTTN突变为非TTTN；③将crRNA2的靶标中的TTTN突变为非TTTN。
区段Ⅰ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA1的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列。
区段Ⅱ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA2的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列。
所述元件丙-1中自5’至3’端依次具有crRNA1的靶标序列、上游同源臂、供体片段序列和crRNA2的靶标序列。
所述元件丙-2中自5’至3’端依次具有crRNA1的靶标序列、上游同源臂、供体片段序列、下游同源臂和crRNA2的靶标序列。
所述目标片段中，crRNA1的靶标和crRNA2的靶标之间具有限制性内切酶的识别序列；所述供体片段与目标片段的区别还包括如下④：将所述限制性内切酶的识别序列突变为非识别序列。
所述Hammerhead型核酸酶的编码序列如序列表中序列1自5’端第394至436位所示。
所述丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列如序列表中序列1自5’端第481至548位所示。
所述crRNA1的编码序列如序列表的序列1自5’端第437至480位所示。
所述crRNA2的编码序列如序列表的序列1自5’端第602至645位所示。
所述上游同源臂如序列表的序列1自5’端第7252至7348位所示。
所述下游同源臂如序列表的序列2自5’端第7730至7850位所示。
所述供体片段序列如序列表的序列1自5’端第7349至7729位所示。
所述区段Ⅰ如序列表的序列1自5’端第394至548位所示。
所述区段Ⅱ如序列表的序列1自5’端第559至713位所示。
所述crRNA1的靶标序列如序列表的序列1自5’端第7225至7251位所示。
所述crRNA2的靶标序列如序列表的序列1自5’端第7730至7756位所示。
所述元件丙-1如序列表的序列1自5’端第7217-7765位所示。
所述元件丙-2如序列表的序列2自5’端第7217-7886位所示。
所述启动子甲为OsU3启动子。所述OsU3启动子如序列表的序列1自5’端第13至393位所示。
所述元件甲如序列表的序列1自5’端13至713位所示。
所述启动子乙为Ubi启动子。所述Ubi启动子的反向互补序列如序列表的序列1自5’端第4940至6925位所示。
所述LbCpf1核酸酶的编码基因的反向互补序列如序列表的序列1自5’端第1089至4937位所示。
所述表达盒还包括终止子。所述终止子为Nos终止子。所述Nos终止子的反向互补序列如序列表的序列1自5’端第817至1069位所示。
所述表达盒的反向互补序列如序列表的1自5’端817至6925位所示。
所述重组载体为序列表的序列1所示的环形质粒。
所述重组载体为序列表的序列2所述的环形质粒。
本发明还保护一种用于取代植物基因组中的目标片段的系统，包括以上任一所述的重组载体和游离片段；所述游离片段与重组载体中的元件丙序列一致。
所述重组载体为序列表的序列1所示的环形质粒，所述游离片段如序列表的序列1自5’端第7217-7765位所示。
所述重组载体为序列表的序列2所示的环形质粒，所述游离片段如序列表的序列1自5’端第7217-7886位所示。
以上任一所述目标片段具体可为植物基因组中ALS基因中序列表的序列4所示的片段。
本发明还保护以上任一所述重组载体，或，任一所述的系统在实现目的基因在植物中同源重组中的应用。
本发明还保护一种实现目的基因在植物中同源重组的方法，包括如下步骤：将以上任一所述重组载体和游离片段导入出发植物，实现植物中目的基因同源重组；所述游离片段与重组载体中的元件丙序列一致。
所述重组载体为序列表的序列1所示的环形质粒，所述游离片段如序列表的序列1自5’端第7217-7765位所示。
所述重组载体为序列表的序列2所示的环形质粒，所述游离片段如序列表的序列1自5’端第7217-7886位所示。
以上任一所述目的基因为ALS基因。
以上任一所述植物可为1)或2)或3)或4)或5)：1)单子叶植物；2)双子叶植物；3)禾本科植物；4)水稻；5)水稻品种中花11(Japonica cv.)。
本发明以水稻ALS基因为研究对象，构建了同源重组载体。pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT载体采用OsU3作为启动子，启动crRNAs的转录，且载体中的修复模板只含有左侧同源臂。pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-armed-DRT载体同样采用OsU3作为启动子，启动crRNAs的转录，但载体中的修复模板含有两个同源臂。利用基因枪方法将载体与外源修复模板片段同时转入水稻愈伤中，获得了ALS基因定点修饰的水稻植株。研究结果一方面表明，当双链DNA作为修复模板时，细胞采用SDSA模型进行同源重组修复，且当修复模板中只含有左侧同源重组臂时同样可成功介导目的基因的同源重组，此策略使得载体构建更为简单。
附图说明
图1为两个载体框架图。
图2为水稻愈伤组织中目的基因的测序鉴定结果。
图3为转基因植株中目的基因的测序鉴定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的用于水稻转化的水稻材料为中花11(Japonica cv.)，由中国农业科学院作物科学研究所提供。
质粒pCXUN-Cas9记载于如下文献中：He et al.，2017和Sun et al.，2016；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
质粒pRS316-RCR-GFP记载于如下文献中：Zhang et al.，2017；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
LbCpf1-OsU6载体记载于如下文献中：Wang et al.，2017；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
pCXUN-Cas9-OsU3记载于如下文献中：Sun et al.，2016；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中所用的内切酶、试剂盒和PCR酶均购自试剂公司。其它试剂均为国产分析纯。
下述实施例中的引物、DNA合成及测序均由华大公司完成。
下述实施例中所用的引物如表1。
表1引物序列
实施例1、利用CRISPR/LbCpf1系统实现水稻种ALS基因同源重组
本实施例中的靶基因为水稻除草剂抗性ALS基因。
一、表达载体的构建
1、质粒pCXUN-LbCpf1的构建
(1)用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切质粒pCXUN-Cas9，得到约9282bp的载体骨架1。
(2)用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切LbCpf1-OsU6载体，得到约5846bp的Ubi-LbCpf1表达盒。
(3)将载体骨架1和Ubi-LbCpf1表达盒用T4连接酶连接，得到质粒pCXUN-LbCpf1。
2、OsU3-RCR1-RCR2表达盒的构建
(1)以质粒pRS316-RCR-GFP为模板，采用引物RCR1F2和引物RCR-common-R组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物。
(2)以步骤(1)得到的第一轮PCR扩增产物为模板，采用引物RCRF1和引物RCR-common-R组成的引物对进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物(RCR1)。
(3)以质粒pRS316-RCR-GFP为模板，采用引物RCR2-F2和引物RCR-common-R组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物。
(4)以步骤(3)得到的第一轮PCR扩增产物为模板，采用引物RCR-F1和引物RCR-common-R组成的引物对进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物(RCR2)。
(5)以pCXUN-Cas9-OsU3为模板，采用引物OsU3F和引物OsU3-RCR1R组成的引物对进行PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物(OsU3启动子序列)。
(6)以步骤(2)得到的第二轮PCR扩增产物(RCR1)为模板，采用引物RCR-Common-F和引物RCR1-10random-R组成的引物对进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物。
(7)将步骤(5)得到的第一轮PCR扩增产物(OsU3启动子序列)和步骤(6)得到的第二轮PCR扩增产物按照摩尔比1:1混合后作为模板，采用引物OsU3F和引物RCR1-10random-R组成的引物对进行第三轮PCR扩增，得到第三轮PCR产物(OsU3-RCR1表达盒)。
(8)以步骤(4)得到的第二轮PCR扩增产物(RCR2)为模板，采用引物RCR2-10random-F和引物SacI-RCR2-R组成的引物对进行第四轮PCR扩增，得到第四轮PCR扩增产物。
(9)将步骤(7)得到的第三轮PCR产物(OsU3-RCR1表达盒)和步骤(8)得到的第四轮PCR扩增产物按照摩尔比1:1混合后作为模板，采用引物SacI-OsU3-F和引物SacI-RCR2-R进行第五轮PCR扩增，得到第五轮PCR扩增产物(OsU3-RCR1-RCR2表达盒)。
3、DNA修复模板left-armed-DRT(只含有左侧同源臂)的获得
(1)以化学合成定点修饰的ALS基因片段为模板(序列表的序列3)，采用引物donor-armLF和引物donor-armLR1组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物。
(2)以步骤(1)得到的第一轮PCR扩增产物为模板，采用引物armLF和引物donor-armLR2组成的引物对进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物。
(3)以步骤(2)得到的第二轮PCR扩增产物作为模板，采用引物pme-donor-armLF和引物pme-donor-armLR组成的引物对进行第三轮PCR扩增，得到第三轮PCR扩增产物(left-armed-DRT)。
4、DNA修复模板armed-DRT(含有两侧同源臂)的获得
以化学合成定点修饰的ALS基因片段为模板(序列表的序列3)，采用引物Pme-donorF和引物Pme-donorR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(armed-DRT)。
5、载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT的获得
将步骤2制备的OsU3-RCR1-RCR2表达盒和步骤1制备的质粒pCXUN-LbCpf1利用同源重组酶(全式金,北京,中国)进行连接获得重组载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2，将步骤3得到的left-armed-DRT插入重组载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2的PmeI位点中，得到载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT。
载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT经测序如序列表的序列1所示。序列表中序列1自5’末端起，第13至713位为OsU3-RCR1-RCR2表达盒的核苷酸序列，其中，第13至393位为OsU3启动子的核苷酸序列，“第394至436位”和“第559至601位”均为Hammerhead(HH)型核酸酶的核苷酸序列，“第481至548位”和“第646至713位”为丁型肝炎病毒(HDV)核酸酶的核苷酸序列，第437至480位为crRNA1的核苷酸序列，第602至645位为crRNA2的核苷酸序列，第817至1069位为Nos终止子的核苷酸序列的反向互补序列；第1089至4937位为编码LbCpf1的核苷酸序列的反向互补序列，第4940至6925位为Ubi启动子的核苷酸序列的反向互补序列，第7217至7765位为DNA修复模板left-armed-DRT。
DNA修复模板left-armed-DRT中，第7225至7251位为crRNA1的靶标序列，第7252至7348位为上游同源臂，第7349至7729位为突变区段，第7730至7756位为crRNA2的靶标序列。
6、载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-armed-DRT的获得
将步骤2制备的OsU3-RCR1-RCR2表达盒和步骤1制备的质粒pCXUN-LbCpf1利用同源重组酶(全式金,北京,中国)进行连接获得重组载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2，将步骤4得到的armed-DRT插入重组载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2的PmeI位点中，得到载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-armed-DRT。
载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-armed-DRT经测序如序列表的序列2所示。序列表中序列2自5’末端起，第13至713位为OsU3-RCR1-RCR2表达盒的核苷酸序列，第13至393位为OsU3启动子的核苷酸序列，“第395至436位”和“第559至601位”均为Hammerhead(HH)型核酸酶的核苷酸序列，“第481至548位”和“第646至713位”为丁型肝炎病毒(HDV)核酸酶的核苷酸序列，第437至480位为crRNA1的核苷酸序列，第602至645位为crRNA2的核苷酸序列，第817至1069位为Nos终止子的核苷酸序列的反向互补序列；第1089至4937位为编码LbCpf1的核苷酸序列的反向互补序列，第4940至6925位为Ubi启动子的核苷酸序列的反向互补序列，第7217至7886位为DNA修复模板armed-DRT。
DNA修复模板armed-DRT中，第7225至7251位为crRNA1的靶标序列，第7252至7348位为上游同源臂，第7349至7729位为突变区段，第7730至7850位为下游同源臂，第7851-7877位为crRNA2的靶标序列。
载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT和载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-armed-DRT部分元件结构示意图见图1。
二、在水稻愈伤中检测载体活性
1、选取饱满的中花11水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀的点入在含有2毫克/升2,4-D的灭菌NB固体培养基中，28℃黑暗培养40-50天以诱导愈伤组织的产生。
2、将步骤1得到的愈伤组织在含有0.3M甘露醇和0.3M山梨醇的MS培养基中高渗处理4-6小时后，将pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT质粒载体和left-armed-DRT片段(人工合成序列表的序列1第7217至7765位)按照摩尔比1:20混合后基因枪轰击水稻愈伤，采用0.6μm金粉，轰击压力为900psi进行轰击。
3、完成步骤2后，将水稻愈伤28℃暗培养2天后提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物ALSTestF和引物T2MR组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物测序检测是否发生ALS基因同源重组。
4、将步骤1得到的愈伤组织在含有0.3M甘露醇和0.3M山梨醇的MS培养基中高渗处理4-6小时后，将pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-armed-DRT质粒载体和armed-DRT片段(人工合成序列表的序列2第7217至7886位)按照摩尔比1:20混合后基因枪轰击水稻愈伤，采用0.6μm金粉，轰击压力为900psi进行轰击。
5、完成步骤4后，将水稻愈伤28℃暗培养2天后提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物ALSTestF和引物T2MR组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物测序检测是否发生ALS基因同源重组。
结果如图2所示。图2A为采用pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT质粒载体和left-armed-DRT片段轰击愈伤后的检测结果，图2B为采用pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT质粒载体和armed-DRT片段轰击愈伤后的检测结果。其中，WTALS为野生型ALS基因(序列表的序列4)；Donor为修复模板序列(序列表的序列5)；下划线序列分别为靶点1和靶点2序列，斜体的碱基为定点突变的PAM位点及EcoRV酶切位点，斜体加粗的碱基为目标替换成的碱基。
对于载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT而言，在愈伤L53和L65中检测到有完整同源重组，L32和L42愈伤有部分同源重组。对于载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-armed-DRT而言，愈伤G6中检测到有完整同源重组，F5愈伤有部分同源重组。结果表明，两种载体均可在植物细胞中介导基因同源重组。
三、转基因水稻的获得
1、选取饱满的中花11水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀的点入在含有2毫克/升2,4-D的灭菌NB固体培养基中，28℃黑暗培养40-50天以诱导愈伤组织的产生。
2、将步骤1得到的愈伤组织在含有0.3M甘露醇和0.3M山梨醇的MS培养基中高渗处理4-6小时后，将pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT质粒载体和left-armed-DRT片段(人工合成序列表的序列1第7217至7765位)按照摩尔比1:20混合后基因枪轰击水稻愈伤，采用0.6μm金粉，轰击压力为900psi进行轰击，轰击后在含有0.3M甘露醇和0.3M山梨醇的MS培养基中培养16小时后转移至NB筛选培养基(含有2毫克/升的2,4-D和50毫克/升的潮霉素的NB固体培养基)中，28℃持续暗培养2周。
3、完成步骤2后，选取生长良好呈嫩黄色的阳性愈伤组织，用无菌镊子移至NB预分化培养基(含有1毫克/升NAA、5毫克/升ABA、2毫克/升kinetin和50毫克/升的潮霉素的NB固体培养基)上，28℃持续光照培养2周。
4、完成步骤3后，挑选生长旺盛的愈伤组织转入MS分化培养基(含有0.02毫克/升NAA、2毫克/升kinetin和0.4μM双草醚钠盐的MS固体培养基)中，28℃持续光照培养。
5、完成步骤4后，待分化出来的幼苗长至2至5毫米，转入MS固体培养基中28℃光照培养2到3周，之后移入土中置于温室生长(温度28-30℃，16小时光照/8小时黑暗)，得到T0代转基因植株(转left-armed-DRT)。
6、采用pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-armed-DRT质粒载体和armed-DRT片段(人工合成序列表的序列2第7217至7886位)替代pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT质粒载体和left-armed-DRT片段，按照步骤1-5进行操作，得到T0代转基因植株(转armed-DRT)。
四、转基因水稻的基因型鉴定
待测植株：野生型中花11水稻(WT)、T0代转基因植株(转left-armed-DRT)和T0代转基因植株(转armed-DRT)。
提取待测植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物ALStestF和引物ALStestR组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物采用EcoRV酶切，将完全没有或者部分切开PCR产物进行克隆测序。统计结果见表2和图3。
表2转基因水稻的基因型鉴定统计结果
图3中，图3A为T0代转基因植株(转left-armed-DRT)检测结果，图3B为T0代转基因植株(转armed-DRT)检测结果。其中，WT ALS为野生型ALS基因(序列表的序列4)；Donor为修复模板序列(序列表的序列5)；下划线序列分别为靶点1和靶点2序列，斜体的碱基为定点突变的PAM位点及EcoRV酶切位点，斜体加粗的碱基为目标替换成的碱基。
对于载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-left-armed-DRT而言，转化152个愈伤，共获得71棵植株。对71棵植株PCR产物用EcoRV酶切鉴定后结果表明，171-2和171-9发生了完全同源重组，170-1和172-1为部分同源重组。
对于载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2-armed-DRT而言，转化164个愈伤，共获得94棵单株。对94棵植株PCR产物用EcoRV酶切鉴定后结果表明，169-2和169-3发生了完全同源重组，而168-2、168-4、168-5、169-5和169-6位部分同源重组。
171-2一条链为完整同源重组，另一条链为野生型。171-9位嵌合体，一种类型类完整同源重组，另一种类型为部分同源重组，第三种类型为野生型。170-1一条链为部分同源重组，另一条链为野生型。172-1位嵌合体，第一种类型为1个碱基的替换，第二种类型为部分同源重组，第三种类型为野生型。
169-3为嵌合体，第一种类型为完整同源重组，第二种类型为部分同源重组，第三种类型为野生型。169-2为嵌合体，第一种类型为完整同源重组，第二种和第三种类型为部分同源重组，第四种类型为野生型。168-4、168-5、169-5和169-6的一条链为部分同源重组，另一条链为野生型，其中168-4的部分重组链中伴随着一个碱基的替换。168-2位嵌合体，第一和第二种类型为部分同源重组，第三种类型为野生型。169-1一条链中有253bp的缺失，另一条链为野生型。
五、脱靶分析
本实验对12颗植株进行PCR靶点1和靶点2的脱靶进行鉴定，具体步骤为：提取植株的基因组DNA，采用特异引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序。
靶标1存在三个可能脱靶的位点，ALS1-OFF1、ALS1-OFF2和ALS1-OFF3。靶标2存在两个可能脱靶的位点，ALS2-OFF1和ALS2-OFF2。
用于各个脱靶位点的引物对见表1。
结果如表3所示。结果表明，本实验所设计的crRNA1和crRNA2并不存在脱靶情况。
表3脱靶分析统计结果
注：PAM位点用下划线表示，错配碱基用斜体表示。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16563
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcgagc tcaaggaatc tttaaacata cgaacagatc acttaaagtt cttctgaagc 60
aacttaaagt tatcaggcat gcatggatct tggaggaatc agatgtgcag tcagggacca 120
tagcacaaga caggcgtctt ctactggtgc taccagcaaa tgctggaagc cgggaacact 180
gggtacgttg gaaaccacgt gatgtgaaga agtaagataa actgtaggag aaaagcattt 240
cgtagtgggc catgaagcct ttcaggacat gtattgcagt atgggccggc ccattacgca 300
attggacgac aacaaagact agtattagta ccacctcggc tatccacata gatcaaagct 360
gatttaaaag agttgtgcag atgatccgtg gcaaaattac tgatgagtcc gtgaggacga 420
aacgagtaag ctcgtctaat ttctactaag tgtagatggt atggtggtgc aatgggagga 480
ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacatgctt cggcatggcg 540
aatgggacga atacgaccaa attactgatg agtccgtgag gacgaaacga gtaagctcgt 600
ctaatttcta ctaagtgtag atacctgaat gacccataaa gagtgggccg gcatggtccc 660
agcctcctcg ctggcgccgg ctgggcaaca tgcttcggca tggcgaatgg gaccggtacc 720
cctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca 780
gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attcccgatc tagtaacata gatgacaccg 840
cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt 900
ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa taacgtcatg cattacatgt 960
taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat gataatcatc gcaagaccgg 1020
caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt tgaacgatcg gggaaattcg 1080
gatccttact ttttcttttt tgcctggccg gcctttttcg tggccgccgg ccttttgtgc 1140
ttcacgctgg tctgggcgta ctccagccac tccttgttag agatggcgat cttcacctta 1200
tccagcttct cgtcctcggc cttcttgaac tggccgatgg cccacagcac ctttctggcg 1260
atgttatagg cgccattggc gtcggcgttc tttggcagga tggcattctc ctgggcctca 1320
tagttccggc tatcgtagaa gatgccgtcg gagttcttca cagggctgat cagaaaatcc 1380
acgtcggtgc ggcctgtgat gctgttccgc atctgcagca tcaggctcat cagggccata 1440
aagctagagt agaaggcctt gtcggactgc tcgcacagca gggctctgat atcgccctgc 1500
tgataattga tgccgtactt gttgaacagc tccttatagg cgctggtcag gcacacctcc 1560
tcccagtcga acacgttgtt cttcttagga ttccggaaga ttctgatccg gttgccgtag 1620
gagtacagct tccacttctt gatgtaatcg gcgtctgtgc gagagaagtt cttatagtcc 1680
agggcaaact cgaacagatc ctcctcgggc acgtacatga tcctgtcaaa ggagctgatg 1740
aacttcttgg aatcggcgat gctggtatac ttggttttca gcaggttcac aaagccggta 1800
gatggatcga tcttggatgt cagccaggca gggatgtaaa agatgaagcc gttctgggta 1860
gacatggact taaagctctc gaacttattg gtgatctgat agcccttcag ggcgccgcct 1920
gttgcacaag gattagactt cttgtccacc atgtagttca gcttatcgat cagcatcttc 1980
tcgaacttct gatacacctg cttctccacc ttcacgcggc tattcttaaa gccagagttc 2040
aggtcctcca gggcgatcac ggcatcgtac ttctccacca gctcgcagat cttgtgcacc 2100
acctgagaga tatagccggc cttcagctcc ttgatattct cgatggaggt ccagttctgg 2160
cgggcctcga acctctcctt ctccttcttg tccagcagag agtggtaatc tgtcttgatc 2220
ctgatgccgt tgaagttgtt gatgatctcg ttcagggaat actgctccac gatgttgccc 2280
ttgccgtcca ccaccacgat atacagcaga ttgcgctcgc ccctatcgat gccgatcaca 2340
taggggttat cgtcgtgctt cagcagcacg cgcacctctg tattgatctt gaagatgttc 2400
ttggggcact tattgatggc gattgggatg tgcagctcgt actggtcctc agaaaacctc 2460
ttatccttat acacgtcgta ggacagggtt gtggttttct tgggattatc tggattcttg 2520
ttggcgatag gggagttggc tgggtgcacc accagctcct ccttcttcag ggaggcgcgc 2580
ctcatgaaca gctctgctcc tccgctcagc ctgatctgtc cgtgattgtt ctcgtcaaac 2640
agcagcttga agtacatggt gtgcagattg ggtgtgccgt gagacttatc ggaaaagtcc 2700
ttgttataga tctggaacat atacagcttg ccctcctcca ccagcttatc cacctccttc 2760
ttgctggcag actcgaagct caccttatag ccctgctcct ccacctctct gtaaaagccg 2820
gcgatgtcct tatacttctc tgtctcagaa aagttgaaat cgtaggcatt ggaccacttt 2880
ggataccggg agatgctatc cttaaagaag tcgatcagct tgtgacagtc attcaggtta 2940
aacatatcgc ccttcttgaa tgtgccattc ttgtagatct tctggatgtc ctcgctgggg 3000
ttatagtagg ccatccactt cttagaaaag aacacctttg gcagcatctt attagggccg 3060
ggcagcagct tatagttgat cttctcgtaa ttgccgttca catcgtcctt gtcgatcttc 3120
tgcaggcact tggcgtactt cttatccatg atggccagat agtacttgga gccgtatctc 3180
aggatggtgg cccgatagtc tgtctcctta tccttgtccc agccgcccat gaactgaggg 3240
ttctgaaaat acagcttgaa cttatcctta gagtagggct tctgggtcac ataattgcgg 3300
atggcatcgt agatgtggtc caccttcagc aggatgtcgt aggccagcac aaaatcgcca 3360
tagaaggact cgtccctgtt tgtctccttg ccctcgccaa agaaggcctt gatgtaattc 3420
tcgaagctct tcacagaatc cagcaggtcc ttcatgatgg ccaccacggc gtcgttcttc 3480
ttcaggctct tctccagcac aaaatcggcg tcgaacagct tctcagagga gccatacacc 3540
ttgtagatct catccacctt ctggatgatg atctccttca gcttctccac cacagacaga 3600
tcggcgtcgg cgtactcctg cagctgctcc agagaaaagg agccgatctt cttgaaggac 3660
tttctccgat cgtcctcgta cttctcggtc accacggcct tcttcttcag gtggatatcg 3720
tcatactcgg cattccactt gtcccggatc acgttccact cgccgaagat atccttggag 3780
attgtgctga tggcggggcc gttcttcaca aagatgccgg cgctagagta ctcgtcaaaa 3840
ttcttgaaca gcttctccag cttcttgatg gagctgaaga tctcgctgtt cttgttcagg 3900
gtgtttctaa acacctccag cacctcctca tcggatgtat agccctcgcc gtagaagctc 3960
agagactccc gatcgctcag cacctgctta tacagtggct taaacttagg cagcttctgc 4020
ttggttttct gattatacag gttgatgtac tcgttcaggc ccttgatctt ctcgccgctc 4080
tcggtcacga agccgccgat gatggcgtta tacacgtcga tgccctcctg tgtcagcaca 4140
aagttaaaga actcgccctc aaagaaatcc tccacatcat agtcgctgtt caggatcttc 4200
tccttgatct cctgcacctc gtgcttatca aagatggcgt ccaccttctc gaagatgtcc 4260
atattagaga tgtagcgggt cagattctcg ttgatacacc tgaaggcgat ggatgtgctc 4320
ttggcctcct cggaaaacat attctctctg ttatcaaaga agccggtgaa ggctgtggta 4380
aagccattga agctgttcac cagggcgatc tcgtccttat cgtccaggaa ctctggcagg 4440
attgtctcga tgatatcctt cttaaacagg gacttgtagc cctcgttgcc cttgaaggcc 4500
ttggcgatct ccttccgcag attgatctcc aggttctcca gctccttatt ctccttctcg 4560
gttctggttt tcttccggaa caggctgatg taattgttca gattcttcag cttgatgctg 4620
tgcagcacgt cgttgataaa agacagatag tagcgatcca gcagcttctt cacgccctta 4680
taatcctcgg ctctcttctc gtcctccacc agcagccgct tattgtcgat gttctcctgg 4740
gtcttgccca cagggatggc cttgaacctc agggtcttag acagggagta gcagtttgta 4800
aacttctcca gcttgctggc tgctgggact ccgtggatac cgaccttccg cttcttcttt 4860
ggggccatct tatcgtcatc gtctttgtaa tcaatatcat gatccttgta gtctccgtcg 4920
tggtccttat agtccatggc tgcagaagta acaccaaaca acagggtgag catcgacaaa 4980
agaaacagta ccaagcaaat aaatagcgta tgaaggcagg gctaaaaaaa tccacatata 5040
gctgctgcat atgccatcat ccaagtatat caagatcaaa ataattataa aacatacttg 5100
tttattataa tagataggta ctcaaggtta gagcatatga atagatgctg catatgccat 5160
catgtatatg catcagtaaa acccacatca acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc 5220
catccatctt aaactcgtaa ctatgaagat gtatgacaca cacatacagt tccaaaatta 5280
ataaatacac caggtagttt gaaacagtat tctactccga tctagaacga atgaacgacc 5340
gcccaaccac accacatcat cacaaccaag cgaacaaaaa gcatctctgt atatgcatca 5400
gtaaaacccg catcaacatg tatacctatc ctagatcgat atttccatcc atcatcttca 5460
attcgtaact atgaatatgt atggcacaca catacagatc caaaattaat aaatccacca 5520
ggtagtttga aacagaattc tactccgatc tagaacgacc gcccaaccag accacatcat 5580
cacaaccaag acaaaaaaaa gcatgaaaag atgacccgac aaacaagtgc acggcatata 5640
ttgaaataaa ggaaaagggc aaaccaaacc ctatgcaacg aaacaaaaaa aatcatgaaa 5700
tcgatcccgt ctgcggaacg gctagagcca tcccaggatt ccccaaagag aaacactggc 5760
aagttagcaa tcagaacgtg tctgacgtac aggtcgcatc cgtgtacgaa cgctagcagc 5820
acggatctaa cacaaacacg gatctaacac aaacatgaac agaagtagaa ctaccgggcc 5880
ctaaccatgg accggaacgc cgatctagag aaggtagaga gggggggggg gggaggacga 5940
gcggcgtacc ttgaagcgga ggtgccgacg ggtggatttg ggggagatct ggttgtgtgt 6000
gtgtgcgctc cgaacaacac gaggttgggg aaagagggtg tggagggggt gtctatttat 6060
tacggcgggc gaggaaggga aagcgaagga gcggtgggaa aggaatcccc cgtagctgcc 6120
gtgccgtgag aggaggagga ggccgcctgc cgtgccggct cacgtctgcc gctccgccac 6180
gcaatttctg gatgccgaca gcggagcaag tccaacggtg gagcggaact ctcgagaggg 6240
gtccagaggc agcgacagag atgccgtgcc gtctgcttcg cttggcccga cgcgacgctg 6300
ctggttcgct ggttggtgtc cgttagactc gtcgacggcg tttaacaggc tggcattatc 6360
tactcgaaac aagaaaaatg tttccttagt ttttttaatt tcttaaaggg tatttgttta 6420
atttttagtc actttatttt attctatttt atatctaaat tattaaataa aaaaactaaa 6480
atagagtttt agttttctta atttagaggc taaaatagaa taaaatagat gtactaaaaa 6540
aattagtcta taaaaaccat taaccctaaa ccctaaatgg atgtactaat aaaatggatg 6600
aagtattata taggtgaagc tatttgcaaa aaaaaaggag aacacatgca cactaaaaag 6660
ataaaactgt agagtcctgt tgtcaaaata ctcaattgtc ctttagacca tgtctaactg 6720
ttcatttata tgattctcta aaacactgat attattgtag tactatagat tatattattc 6780
gtagagtaaa gtttaaatat atgtataaag atagataaac tgcacttcaa acaagtgtga 6840
caaaaaaaat atgtggtaat tttttataac ttagacatgc aatgctcatt atctctagag 6900
aggggcacga ccgggtcacg ctgcaaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 6960
actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 7020
gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 7080
atggcgaatg ctagagcagc ttgagcttgg atcagattgt cgtttcccgc cttcagtttg 7140
tttaaacgta aaacgacggc cagtgaattg gagatcggta cttcgcgaat gcgtcgagat 7200
gacccaatgc tctagaaacc aacatttggg tatggtggtg caatgggagg attgatgggg 7260
atggtagctt cctcatgaac attcaggagc tggcattgat ccgcattgag aacctccctg 7320
tgaaggtgat ggtgttgaac aaccaacacc taggcatggt cgtccagttg gaggataggt 7380
tttacaaggc gaatagggcg catacatact tgggcaaccc ggaatgtgag agcgagatat 7440
atccagattt tgtgactatt gctaaggggt tcaatattcc tgcagtccgt gtaacaaaga 7500
agagtgaagt ccgtgccgcc atcaagaaga tgctcgagac tccagggcca tacttgttgg 7560
acatcatcgt cccgcaccag gagcatgtgc tgcctatgat cccaattggg ggcgcattca 7620
aggacatgat cctggatggt gatggcagga ctgtgtatta atctataatc tgtatgttgg 7680
caaagcacca gcccggccta tgtctgacgt gaatgactca taaagagtgt ttgacctgaa 7740
tgacccataa agagtggtat gcctagtatg cctaactagt ccattgggtc atcggatgcc 7800
gggaccgacg agtgcagagg cgtgcaagcg agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 7860
cctggtttaa acaaactatc agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa cctaagagaa 7920
aagagcgttt attagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc 7980
catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac 8040
ccctccgctg ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg 8100
acatgtcgca caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt tcctggcgtt 8160
ttcttgtcgc gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt 8220
acgccatgaa caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg 8280
accaggactt gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc aagctgtttt 8340
ccgagaagat caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc 8400
tagccctggc gacgttgtga cagtgaccag gctagaccgc ctggcccgca gcacccgcga 8460
cctactggac attgccgagc gcatccagga ggccggcgcg ggcctgcgta gcctggcaga 8520
gccgtgggcc gacaccacca cgccggccgg ccgcatggtg ttgaccgtgt tcgccggcat 8580
tgccgagttc gagcgttccc taatcatcga ccgcacccgg agcgggcgcg aggccgccaa 8640
ggcccgaggc gtgaagtttg gcccccgccc taccctcacc ccggcacaga tcgcgcacgc 8700
ccgcgagctg atcgaccagg aaggccgcac cgtgaaagag gcggctgcac tgcttggcgt 8760
gcatcgctcg accctgtacc gcgcacttga gcgcagcgag gaagtgacgc ccaccgaggc 8820
caggcggcgc ggtgccttcc gtgaggacgc attgaccgag gccgacgccc tggcggccgc 8880
cgagaatgaa cgccaagagg aacaagcatg aaaccgcacc aggacggcca ggacgaaccg 8940
tttttcatta ccgaagagat cgaggcggag atgatcgcgg ccgggtacgt gttcgagccg 9000
cccgcgcacg tctcaaccgt gcggctgcat gaaatcctgg ccggtttgtc tgatgccaag 9060
ctggcggcct ggccggccag cttggccgct gaagaaaccg agcgccgccg tctaaaaagg 9120
tgatgtgtat ttgagtaaaa cagcttgcgt catgcggtcg ctgcgtatat gatgcgatga 9180
gtaaataaac aaatacgcaa ggggaacgca tgaaggttat cgctgtactt aaccagaaag 9240
gcgggtcagg caagacgacc atcgcaaccc atctagcccg cgccctgcaa ctcgccgggg 9300
ccgatgttct gttagtcgat tccgatcccc agggcagtgc ccgcgattgg gcggccgtgc 9360
gggaagatca accgctaacc gttgtcggca tcgaccgccc gacgattgac cgcgacgtga 9420
aggccatcgg ccggcgcgac ttcgtagtga tcgacggagc gccccaggcg gcggacttgg 9480
ctgtgtccgc gatcaaggca gccgacttcg tgctgattcc ggtgcagcca agcccttacg 9540
acatatgggc aaccgccgac ctggtggagc tggttaagca gcgcattgag gtcacggatg 9600
gaaggctaca agcggccttt gtcgtgtcgc gggcgatcaa aggcacgcgc atcggcggtg 9660
aggttgccga ggcgctggcc gggtacgagc tgcccattct tgagtcccgt atcacgcagc 9720
gcgtgagcta cccaggcact gccgccgccg gcacaaccgt tcttgaatca gaacccgagg 9780
gcgacgctgc ccgcgaggtc caggcgctgg ccgctgaaat taaatcaaaa ctcatttgag 9840
ttaatgaggt aaagagaaaa tgagcaaaag cacaaacacg ctaagtgccg gccgtccgag 9900
cgcacgcagc agcaaggctg caacgttggc cagcctggca gacacgccag ccatgaagcg 9960
ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca caccaagctg aagatgtacg cggtacgcca 10020
aggcaagacc attaccgagc tgctatctga atacatcgcg cagctaccag agtaaatgag 10080
caaatgaata aatgagtaga tgaattttag cggctaaagg aggcggcatg gaaaatcaag 10140
aacaaccagg caccgacgcc gtggaatgcc ccatgtgtgg aggaacgggc ggttggccag 10200
gcgtaagcgg ctgggttgtc tgccggccct gcaatggcac tggaaccccc aagcccgagg 10260
aatcggcgtg acggtcgcaa accatccggc ccggtacaaa tcggcgcggc gctgggtgat 10320
gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag gccgcccagc ggcaacgcat cgaggcagaa 10380
gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc gctgatcgaa tccgcaaaga atcccggcaa 10440
ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg aagccgccca agggcgacga gcaaccagat 10500
tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc acccgcgata gtcgcagcat catggacgtg 10560
gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga cgagctggcg aggtgatccg ctacgagctt 10620
ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg ccggccggca tggccagtgt gtgggattac 10680
gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta accgaatcca tgaaccgata ccgggaaggg 10740
aagggagaca agcccggccg cgtgttccgt ccacacgttg cggacgtact caagttctgc 10800
cggcgagccg atggcggaaa gcagaaagac gacctggtag aaacctgcat tcggttaaac 10860
accacgcacg ttgccatgca gcgtacgaag aaggccaaga acggccgcct ggtgacggta 10920
tccgagggtg aagccttgat tagccgctac aagatcgtaa agagcgaaac cgggcggccg 10980
gagtacatcg agatcgagct agctgattgg atgtaccgcg agatcacaga aggcaagaac 11040
ccggacgtgc tgacggttca ccccgattac tttttgatcg atcccggcat cggccgtttt 11100
ctctaccgcc tggcacgccg cgccgcaggc aaggcagaag ccagatggtt gttcaagacg 11160
atctacgaac gcagtggcag cgccggagag ttcaagaagt tctgtttcac cgtgcgcaag 11220
ctgatcgggt caaatgacct gccggagtac gatttgaagg aggaggcggg gcaggctggc 11280
ccgatcctag tcatgcgcta ccgcaacctg atcgagggcg aagcatccgc cggttcctaa 11340
tgtacggagc agatgctagg gcaaattgcc ctagcagggg aaaaaggtcg aaaaggtctc 11400
tttcctgtgg atagcacgta cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggaacccg 11460
tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggtcac acatgtaagt gactgatata 11520
aaagagaaaa aaggcgattt ttccgcctaa aactctttaa aacttattaa aactcttaaa 11580
acccgcctgg cctgtgcata actgtctggc cagcgcacag ccgaagagct gcaaaaagcg 11640
cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc cccgccgctt cgcgtcggcc tatcgcggcc 11700
gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg ccaggcaatc taccagggcg cggacaagcc 11760
gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgccca catcaaggca ccctgcctcg cgcgtttcgg 11820
tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 11880
agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 11940
gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg 12000
gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc 12060
gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 12120
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acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 12240
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gcgatcaagg cagccgactt cgtgctgatt ccggtgcagc caagccctta cgacatatgg 9660
gcaaccgccg acctggtgga gctggttaag cagcgcattg aggtcacgga tggaaggcta 9720
caagcggcct ttgtcgtgtc gcgggcgatc aaaggcacgc gcatcggcgg tgaggttgcc 9780
gaggcgctgg ccgggtacga gctgcccatt cttgagtccc gtatcacgca gcgcgtgagc 9840
tacccaggca ctgccgccgc cggcacaacc gttcttgaat cagaacccga gggcgacgct 9900
gcccgcgagg tccaggcgct ggccgctgaa attaaatcaa aactcatttg agttaatgag 9960
gtaaagagaa aatgagcaaa agcacaaaca cgctaagtgc cggccgtccg agcgcacgca 10020
gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg cagacacgcc agccatgaag cgggtcaact 10080
ttcagttgcc ggcggaggat cacaccaagc tgaagatgta cgcggtacgc caaggcaaga 10140
ccattaccga gctgctatct gaatacatcg cgcagctacc agagtaaatg agcaaatgaa 10200
taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa ggaggcggca tggaaaatca agaacaacca 10260
ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt ggaggaacgg gcggttggcc aggcgtaagc 10320
ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc actggaaccc ccaagcccga ggaatcggcg 10380
tgacggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt 10440
ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc 10500
cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc 10560
agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac gagcaaccag attttttcgt 10620
tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt 10680
ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg 10740
gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt gtgtgggatt acgacctggt 10800
actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga taccgggaag ggaagggaga 10860
caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc 10920
cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc attcggttaa acaccacgca 10980
cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg 11040
tgaagccttg attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat 11100
cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt 11160
gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg 11220
cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga 11280
acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg 11340
gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct 11400
agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga 11460
gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt 11520
ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg 11580
gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa 11640
aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct 11700
ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct 11760
tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg 11820
ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc 11880
gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg caccctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg 11940
gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg 12000
ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag 12060
ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga 12120
gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 12180
aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 12240
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 12300
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 12360
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 12420
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 12480
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 12540
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 12600
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 12660
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 12720
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 12780
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 12840
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 12900
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 12960
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 13020
ctcacgttaa gggattttgg tcatgcattc taggtactaa aacaattcat ccagtaaaat 13080
ataatatttt attttctccc aatcaggctt gatccccagt aagtcaaaaa atagctcgac 13140
atactgttct tccccgatat cctccctgat cgaccggacg cagaaggcaa tgtcatacca 13200
cttgtccgcc ctgccgcttc tcccaagatc aataaagcca cttactttgc catctttcac 13260
aaagatgttg ctgtctccca ggtcgccgtg ggaaaagaca agttcctctt cgggcttttc 13320
cgtctttaaa aaatcataca gctcgcgcgg atctttaaat ggagtgtctt cttcccagtt 13380
ttcgcaatcc acatcggcca gatcgttatt cagtaagtaa tccaattcgg ctaagcggct 13440
gtctaagcta ttcgtatagg gacaatccga tatgtcgatg gagtgaaaga gcctgatgca 13500
ctccgcatac agctcgataa tcttttcagg gctttgttca tcttcatact cttccgagca 13560
aaggacgcca tcggcctcac tcatgagcag attgctccag ccatcatgcc gttcaaagtg 13620
caggaccttt ggaacaggca gctttccttc cagccatagc atcatgtcct tttcccgttc 13680
aacatcatag gtggtccctt tataccggct gtccgtcatt tttaaatata ggttttcatt 13740
ttctcccacc agcttatata ccttagcagg agacattcct tccgtatctt ttacgcagcg 13800
gtatttttcg atcagttttt tcaattccgg tgatattctc attttagcca tttattattt 13860
ccttcctctt ttctacagta tttaaagata ccccaagaag ctaattataa caagacgaac 13920
tccaattcac tgttccttgc attctaaaac cttaaatacc agaaaacagc tttttcaaag 13980
ttgttttcaa agttggcgta taacatagta tcgacggagc cgattttgaa accgcggtga 14040
tcacaggcag caacgctctg tcatcgttac aatcaacatg ctaccctccg cgagatcatc 14100
cgtgtttcaa acccggcagc ttagttgccg ttcttccgaa tagcatcggt aacatgagca 14160
aagtctgccg ccttacaacg gctctcccgc tgacgccgtc ccggactgat gggctgcctg 14220
tatcgagtgg tgattttgtg ccgagctgcc ggtcggggag ctgttggctg gctggtggca 14280
ggatatattg tggtgtaaac aaattgacgc ttagacaact taataacaca ttgcggacgt 14340
ttttaatgta ctgaattaac gccgaattaa ttcgggggat ctggatttta gtactggatt 14400
ttggttttag gaattagaaa ttttattgat agaagtattt tacaaataca aatacatact 14460
aagggtttct tatatgctca acacatgagc gaaaccctat aggaacccta attcccttat 14520
ctgggaacta ctcacacatt attatggaga aactcgagct tgtcgatcga cagatccggt 14580
cggcatctac tctatttctt tgccctcgga cgagtgctgg ggcgtcggtt tccactatcg 14640
gcgagtactt ctacacagcc atcggtccag acggccgcgc ttctgcgggc gatttgtgta 14700
cgcccgacag tcccggctcc ggatcggacg attgcgtcgc atcgaccctg cgcccaagct 14760
gcatcatcga aattgccgtc aaccaagctc tgatagagtt ggtcaagacc aatgcggagc 14820
atatacgccc ggagtcgtgg cgatcctgca agctccggat gcctccgctc gaagtagcgc 14880
gtctgctgct ccatacaagc caaccacggc ctccagaaga agatgttggc gacctcgtat 14940
tgggaatccc cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg gccattgtcc 15000
gtcaggacat tgttggagcc gaaatccgcg tgcacgaggt gccggacttc ggggcagtcc 15060
tcggcccaaa gcatcagctc atcgagagcc tgcgcgacgg acgcactgac ggtgtcgtcc 15120
atcacagttt gccagtgata cacatgggga tcagcaatcg cgcatatgaa atcacgccat 15180
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tcggccgcag cgatcgcatc catagcctcc gcgaccggtt gtagaacagc gggcagttcg 15300
gtttcaggca ggtcttgcaa cgtgacaccc tgtgcacggc gggagatgca ataggtcagg 15360
ctctcgctaa actccccaat gtcaagcact tccggaatcg ggagcgcggc cgatgcaaag 15420
tgccgataaa cataacgatc tttgtagaaa ccatcggcgc agctatttac ccgcaggaca 15480
tatccacgcc ctcctacatc gaagctgaaa gcacgagatt cttcgccctc cgagagctgc 15540
atcaggtcgg agacgctgtc gaacttttcg atcagaaact tctcgacaga cgtcgcggtg 15600
agttcaggct ttttcatatc tcattgcccc ccggatctgc gaaagctcga gagagataga 15660
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atagaggaag gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 15780
tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc 15840
tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag 15900
cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt 15960
tgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt 16020
gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt 16080
agacgagagt gtcgtgctcc accatgttat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg 16140
ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac 16200
tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg 16260
tgccaccttc cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc 16320
cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg 16380
agactgtatc tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttggcaa 16440
gctgctctag ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 16500
ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 16560
ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 16620
tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attac 16675
<210> 3
<211> 670
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaccaacatt tgggtatggt ggtgcaatgg gaggattgat ggggatggta gcttcctcat 60
gaacattcag gagctggcat tgatccgcat tgagaacctc cctgtgaagg tgatggtgtt 120
gaacaaccaa cacctaggca tggtcgtcca gttggaggat aggttttaca aggcgaatag 180
ggcgcataca tacttgggca acccggaatg tgagagcgag atatatccag attttgtgac 240
tattgctaag gggttcaata ttcctgcagt ccgtgtaaca aagaagagtg aagtccgtgc 300
cgccatcaag aagatgctcg agactccagg gccatacttg ttggacatca tcgtcccgca 360
ccaggagcat gtgctgccta tgatcccaat tgggggcgca ttcaaggaca tgatcctgga 420
tggtgatggc aggactgtgt attaatctat aatctgtatg ttggcaaagc accagcccgg 480
cctatgtctg acgtgaatga ctcataaaga gtggtatgcc tatgatgttt gtatgtgctc 540
tatcaataac taaggtgtca actatgaacc atatgctctt ctgttttact tgtttgatgt 600
gcttggcatg gtaatcctaa ttagcttcct gctgtttgac ctgaatgacc cataaagagt 660
ggtatgccta 670
<210> 4
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttgggtatg gtggtgcaat gggaggatag gttttacaag gcgaataggg cgcatacata 60
cttgggcaac ccggaatgtg agagcgagat atatccagat tttgtgacta ttgctaaggg 120
gttcaatatt cctgcagtcc gtgtaacaaa gaagagtgaa gtccgtgccg ccatcaagaa 180
gatgctcgag actccagggc catacttgtt ggatatcatc gtcccgcacc aggagcatgt 240
gctgcctatg atcccaagtg ggggcgcatt caaggacatg atcctggatg gtgatggcag 300
gactgtgtat taatctataa tctgtatgtt ggcaaagcac cagcccggcc tatgtttgac 360
ctgaatgacc cataaagagt ggta 384
<210> 5
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctaggcatg gtcgtccagt tggaggatag gttttacaag gcgaataggg cgcatacata 60
cttgggcaac ccggaatgtg agagcgagat atatccagat tttgtgacta ttgctaaggg 120
gttcaatatt cctgcagtcc gtgtaacaaa gaagagtgaa gtccgtgccg ccatcaagaa 180
gatgctcgag actccagggc catacttgtt ggacatcatc gtcccgcacc aggagcatgt 240
gctgcctatg atcccaattg ggggcgcatt caaggacatg atcctggatg gtgatggcag 300
gactgtgtat taatctataa tctgtatgtt ggcaaagcac cagcccggcc tatgtctgac 360
gtgaatgact cataaagagt ggta 384
Claims (7)
1.一种用于取代植物基因组中的目标片段的重组载体，包括如下元件甲、元件乙和元件丙；
所述元件甲包括启动子甲、区段Ⅰ和区段Ⅱ；
区段Ⅰ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA1的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列；区段Ⅱ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA2的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列；
所述元件丙自5’至3’端依次具有crRNA1的靶标序列、上游同源臂、供体片段序列和crRNA2的靶标序列；所述丙元件如序列表的序列1自5’端第7217-7765位所示；
所述元件乙为表达盒；所述表达盒中由启动子乙启动LbCpf1核酸酶的编码基因表达；
所述目标片段的一个末端为区段Ⅰ中crRNA1的靶标序列，另一个末端为区段Ⅱ中crRNA2的靶标序列；
供体片段与目标片段具有如下差异：①预期在目标片段中引入的差异核苷酸；②将crRNA1的靶标中的TTTN突变为非TTTN；③将crRNA2的靶标中的TTTN突变为非TTTN。
2.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述目标片段中，crRNA1的靶标和crRNA2的靶标之间具有限制性内切酶的识别序列；所述供体片段与目标片段的区别还包括如下④：将所述限制性内切酶的识别序列突变为非识别序列。
3.如权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为序列表的序列1所示的环形质粒。
4.一种用于取代植物基因组中的目标片段的系统，包括权利要求1至3任一所述的重组载体和游离片段；所述游离片段与重组载体中的元件丙序列一致。
5.如权利要求4所述的系统，其特征在于：所述重组载体为序列表的序列1所示的环形质粒，所述游离片段如序列表的序列1自5’端第7217-7765位所示。
6.权利要求1至3任一所述重组载体，或权利要求4或5所述的系统在实现目的基因在植物中同源重组中的应用。
7.一种实现目的基因在植物中同源重组的方法，包括如下步骤：将权利要求1至3任一所述重组载体和游离片段导入出发植物，实现植物中目的基因同源重组；所述游离片段与重组载体中的元件丙序列一致。
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|---|---|---|---|---|
| CN106811479A (zh) * | 2015-11-30 | 2017-06-09 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用 |
| WO2017141173A2 (en) * | 2016-02-15 | 2017-08-24 | Benson Hill Biosystems, Inc. | Compositions and methods for modifying genomes |
| CN107794276A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-03-13 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种crispr介导快速有效的农作物定点基因片段或等位基因替换方法和体系 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| "A CRISPR–Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants";Xu Tang et al.;《Nature plants》;20170217;第3卷;第1页左栏第3段和右栏第1段，第2页图1b和第3页图2b中OsPDS-crRNA01-04的Locus-2和4页方法部分第3段 * |
| "Generation of targeted mutant rice using a CRISPR-Cpf1 system";Rongf ang Xu et al.;《Plant Biotechnology Journal》;20171231;第15卷;第713-717页 * |
| "Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination";Shaoya Li et al.;《NATURE BIOTECHNOLOGY》;20190318;第37卷;第445-450页 * |
| "Self-processing of ribozyme‐fl anked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR‐mediated genome editing";Yangbin Gao et al.;《JIPB》;20131230;第56卷(第4期);第343-349页 * |
| "Synthesis-dependent repair of Cpf1-induced double strand DNA breaks enables targeted gene replacement in rice";Shaoya Li et al.;《Journal of Experimental Botany》;20180628;第69卷(第20期);第4715-4721页 * |
| "新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1";杨帆 等;《生物工程学报》;20170325;第33卷(第3期);第361-371页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108546712A (zh) | 2018-09-18 |
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